Sumário

A hipóxia ocorre em uma ampla variedade de condições fisiológicas e patológicas, incluindo tumorigênese. As células tumorais têm de se adaptar à hipóxia, alterando sua expressão gênica e síntese de proteínas. Aqui, mostramos que a hipoxia inibe a tradução através da activação de PERK e inactivação de mTOR em células HCT116 do cancro do cólon humano. hipoxia prolongada (1% O

2, 16 h) inibe drasticamente a tradução geral em células HCT116, mRNAs ainda selecionados permanecem eficientemente traduzido sob tal condição. Utilizando a análise de micro-arranjo de polysome- associada mRNAs, foi identificado um grande número de genes regulados por hipoxia ao nível da tradução. ARNm traduzido eficientemente durante a hipóxia foram validados por polissoma perfilamento e quantitativo em tempo real de RT-PCR. Análise de Enriquecimento de via mostrou que muitos dos genes sobre-regulada estão envolvidos no lisossoma, o metabolismo lipídico e glicano, a apresentação de antigénio, adesão celular, e a remodelação da matriz extracelular e o citoesqueleto. A maioria dos genes regulados de deslocamento estão envolvidas em apoptose, a proteólise mediada por ubiquitina, e a fosforilação oxidativa. Investigações posteriores mostraram que a hipóxia induz a autofagia lisossômico e disfunção mitocondrial através da regulação de translação em células HCT116. A abundância de vários factores de tradução e a actividade da mTOR quinase estão envolvidos na autofagia mitocondrial induzida por hipoxia em células HCT116. Nossos estudos destacam a importância da regulação de translação para a adaptação das células tumorais à hipóxia

Citation:. Lai MC, Chang CM, Sun HS (2016) a hipóxia induz Autophagy através Translational-regulação de lisossomais proteínas em células cancerígenas do cólon humano . PLoS ONE 11 (4): e0153627. doi: 10.1371 /journal.pone.0153627

editor: Vladimir Trajkovic, Faculdade de Medicina da Universidade de Belgrado, na Sérvia

Recebido: 02 de novembro de 2015; Aceito: 02 de abril de 2016; Publicação: 14 de abril de 2016

Direitos de autor: © 2016 Lai et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi financiado por doações do Ministério da Ciência e Tecnologia, Taiwan (NSC100-2320-B-006-021-MY3 para MCL e NSC101- 2627-B-006-005 para HSS) e Chang Gung Memorial Hospital, Taiwan (CMRPD3E0012). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal (CRC) é um dos cancros mais comuns em humanos. Cada ano, mais de 1 milhão de pacientes são diagnosticados com CRC no mundo. A incidência de CRC tem vindo a aumentar de forma constante nos últimos 20 anos [1]. Estudos de CRC ter fornecido informações valiosas sobre o processo de genética de várias etapas da carcinogênese [2, 3]. A maioria de CRC é desencadeada por mutações em polipose adenomatosa coli (

APC

) gene [4], o que induz a formação de adenoma precoce. O desenvolvimento de câncer de cólon é promovida ainda mais por uma série de mutações genéticas, incluindo

KRAS

,

SMAD4

, e

TP53

, que permitem o crescimento adenoma e progressão carcinoma. Uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes a progressão CRC pode facilitar o desenvolvimento de novas terapias anti-cancerosas. Ao longo da última década, vários novos alvos moleculares estão actualmente a ser investigada para o tratamento de CRC [5].

Por causa da rápida proliferação e angiogénese aberrante, tumores contêm áreas com diferentes graus de hipoxia [6]. As células tumorais têm de se adaptar ao estresse hipóxico alterando sua expressão gênica e síntese de proteínas [7]. Estas alterações incluem o metabolismo de energia, a angiogénese, a migração celular, invasão tumoral e metástase, regulação do ciclo celular, resposta inflamatória, e regulação do pH [8-10]. hipoxia tumor é pensada para desempenhar um papel fundamental na progressão de tumores e malignidade. A presença de células hipóxicas em tumores sólidos está associada com um prognóstico desfavorável em vários tipos de cancros [6]. Estudos anteriores demonstraram que as células de tumor hipóxicas são mais resistentes à radioterapia [11, 12] e muitos agentes quimioterapêuticos normalmente utilizados [13]. Portanto, é útil para investigar a regulação da expressão de genes em células de cancro humanas sob condições hipóxicas.

Em resposta a hipoxia, as células de aumentar rapidamente o nível de factor de hypoxia-inducible 1 (HIF-1) [14, 15], um heterodímero composto por uma subunidade HIF-1α sensíveis ao oxigénio e uma subunidade HIF-1β constitutivamente expresso. HIF-1 regula a homeostase de oxigénio durante a hipóxia por segmentação transcricionalmente mais de 100 genes, que contêm elementos de resposta de hipoxia (HREs) dentro dos seus promotores [16, 17]. Além disso a transcrição, a tradução é considerada como um importante contribuinte para a expressão do gene regulado por hipoxia [18, 19]. estudos de marcação metabólica mostrou que a hipoxia inibe a tradução global em muitas linhas de células diferentes [20-23]. Geral tradução é significativamente inibida por anoxia aguda ( 0,02% S

2) ou hipoxia prolongada (≦ 2% S

2, 16 h) [21, 22, 24-26]. Tem sido relatado que o alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) e a quinase retículo endoplasmático residente (PERK) desempenham papéis fundamentais na regulação de translação durante a hipóxia [26-28]. A hipoxia inibe a actividade de quinase de mTOR e leva à desfosforilação de proteínas de ligação do factor de iniciação da tradução 4E (4E-BPS). Desfosforilação de 4E-BP aumenta a sua afinidade de ligação ao fator eIF4E iniciação da tradução e, portanto, suprime tradução dependente da cap por perturbar associação de eIF4E com eIF4G. Por outro lado, a hipoxia induz a resposta de proteína desdobrada (UPR), que ocorre como uma consequência do retículo (ER) estresse endoplasmático, e conduz à activação de PERK [21, 24, 27]. PERK activada fosforila tradução eucariótica fator de iniciação 2 subunidade α (eIF2α) e, assim, inibe a iniciação da tradução, impedindo a formação da eIF2-GTP-ARNt (I) Met complexo ternário [29].

Embora tradução geral é largamente inibida durante a hipóxia, mRNAs selecionados permanecem eficientemente traduzido sob tal condição. Tradução de genes de hipoxia-responsive requer mecanismos alternativos, como o site de ribossoma interno de entrada (IRES) [30, 31] e a montante de leitura aberta (uORF) [32]. IRES é um elemento estrutural de ARN complexo que inicia a tradução através do recrutamento de ribossomas directamente para encontrar o codão de iniciação de um ARNm. Pensa-se que a hipóxia reprime dependente da tampa, mas não IRES mediada tradução iniciação [29]. A hipoxia de genes responsivos a HIF-1α e VEGFA foram mostrados para manter a tradução através IRES durante hipoxia [33, 34]. No entanto, o mecanismo de regulação de translação durante a hipóxia é ainda não totalmente compreendida, e que pode variar dependendo dos tipos de células e condições hipóxicas.

Autophagy é um processo biológico de células que degrada proteínas e organelas para manter desnecessários ou disfuncionais homeostase de nutrientes e energia durante condições de estresse [35]. Tem sido relatado que a hipoxia induz autofagia de um modo dependente de HIF-1-[36, 37]. No entanto, a regulação de translação, também desempenha um papel importante na autofagia induzida por hipoxia. Neste estudo, utilizou-se polissoma perfil acoplado a matriz de expressão do genoma humano inteiro para identificar genes candidatos cuja tradução é regulado por hipoxia em células HCT116 do cancro do cólon humano. anotação funcional de genes candidatos indica que a hipoxia regula a tradução de uma grande quantidade de genes envolvidos no lisossoma e diferentes vias metabólicas. Nós fornecemos evidências de que a hipóxia induz a autofagia por meio de translação aumento da regulação de proteínas lisossomais nas células HCT116. Nossos estudos enfatizam a importância da regulação de translação para a adaptação das células tumorais à hipóxia.

Materiais e Métodos

Cultura celular e tratamento hipóxico

células HCT116 (ATCC

® CCL247

™) foram cultivadas em meio MEM suplementado com soro bovino fetal a 10% a 37 ° C em 5% de CO

2 incubadora. Para tratamento hipóxico (1% O

2), as células foram transferidas para uma câmara de hipoxia especialmente concebidos (NexBiOxy Inc., Hsinchu, Taiwan), que foi lavado com 95% N

2 e 5% de CO

2 a 37 ° C

Plasmids e transfecção

Os plasmídeos que expressam marcado com FLAG tipo selvagem mTOR ou mutantes constitutivamente ativos (L1460P E2419K). foram comprados de Addgene (Cambridge, MA). transfecção de células foi feita utilizando o reagente de transfeco Lipofectamina

® 2000 (Thermo Fisher Scientific), essencialmente de acordo com as instruções do fabricante.

mediada por ARNi knockdown

Todos os plasmídeos necessários para RNAi knockdown mediado foram fornecidos pela Unidade Nacional de RNAi Núcleo (Academia Sinica, Taiwan). Os vectores de dois pLKO.1-shRNA usada para knockdown e PSAP LAMP2 foram como se segue: TRCN0000217974 (shPSAP), e TRCN0000029263 (shLAMP2). O reagente de transfeco Lipofectamina

® 2000 (Thermo Fisher Scientific) foi usada para transferir ADN de plasmídeo em células HCT116. As células foram colhidas 3 dias após a transfecção para análise.

Sacarose sedimentação gradiente e polissoma perfis

As células foram recolhidas em PBS frio contendo 100 ug /ml de ciclo-heximida. Todos os passos subsequentes foram realizados a 4 ° C. Os sedimentos celulares foram ressuspensos em RSB-150 (Tris-HCl a 10 (pH 7,4), MgCl 3 mM de

2, e NaCl 150 mM) contendo 100 ug /ml de ciclo-heximida, 40 ug /ml de digitonina (Calbiochem), 20 U /ml, RNasina (Promega), e mistura de inibidores de protease de 1X (Thermo Fisher Scientific). Após incubação em gelo durante 5 min, as células foram rebentadas por passagem através de uma agulha de calibre 26, cinco vezes. extractos citoplasmáticos foram recolhidos por centrifugação a 3000 × g durante 2 min e clarificada por centrifugação adicional a 11.000 × g durante 15 min. As amostras foram carregadas num gradiente linear de sacarose 15-40% e centrifugado a 38000 rpm durante 3 h, num rotor Beckman SW41. Após centrifugação, o ARN total foi extraído a partir de cada fracção utilizando extracção com fenol /clorofórmio, na presença de SDS a 1% e NaCl 0,25 M, seguido por precipitação com etanol. Para análise do perfil de polissoma, os gradientes foram monitorizados a 254 nm, utilizando um sistema de fraccionamento de ISCO (Lincoln, NE).

imunotransferência

As proteínas foram transferidas para uma membrana de transferência de PVDF (PerkinElmer). manchas de proteína foram bloqueados com 3% de leite desnatado em tampão TBST (Tris-HCl 100 (pH 7,6), NaCl a 150 mM e 0,05% de Tween 20) à temperatura ambiente durante 1 h. Os anticorpos primários de coelho incluídos anti-fosfo-eIF2α (Ser51) (diluição 1: 1000; Cell Signaling), de ratinho anti-eIF2α (0,4 ug /ml; Santa Cruz Biotechnology), de coelho anti-fosfo-4E-BP1 (Thr37 /46 ) (diluição 1: 1000; Cell Signaling), de ratinho anti-4E-BP1 (0,4 ug /ml; Santa Cruz Biotechnology), de ratinho anti-β-actina (1: 2500 de diluição; Sigma-Aldrich), de ratinho anti-HIF- 1a (0,2 ug /ml; BD Transduction Laboratories), anticorpo de cabra anti-GLUT1 (1 ug /ml; Santa Cruz Biotechnology), de coelho anti-VEGF (0,4 ug /ml; Santa Cruz Biotechnology), de coelho anti-LC3B (1: 1000 diluição; Cell Signaling), de coelho anti-p62 (1: 2000 de diluição, MBL), anticorpo de coelho anti-α-tubulina (1: 2000 de diluição; Cell Signaling), de coelho anti-GNS (diluição 1: 200; GeneTex), anti-coelho -PSAP (diluição 1: 1000; GeneTex), de ratinho anti-TPP1 (1 ug /ml; Abcam), de ratinho anti-ATPB (0,5 ug /ml; Abcam), de coelho anti-LAMP2 (diluição 1: 1000; GeneTex), de coelho anti-eIF4E (1 ug /ml; Abcam) e de coelho anti-eIF4A1 (1 ug /ml; Abcam). As membranas foram incubadas com anticorpos primários em tampão de bloqueio à temperatura ambiente durante 2 h, seguido por incubação com anticorpos secundários conjugados com HRP à TA, durante 2 h. A detecção foi realizada utilizando Immobilon Ocidental Quimioluminescentes HRP Substrato (Millipore) para a exposição filme de raios-X.

análise Microarray

Para a análise de microarray, RNA isolado foi limpo com o RNeasy Mini kit (Qiagen) . Cerca de 6 ug de RNA total foi transcrito de forma inversa em ADNc utilizando um iniciador oligo d (T), que contém a sequência do promotor de ARN polimerase de T7 na extremidade 3 ‘. -Biotina marcado com ARN complementar (ARNc) foi produzido por

In vitro

transcrição seguido por hidrólise induzida por metais, a 94 ° C. Subsequentemente, ARNc fragmentado foi hibridada em Affymetrix Human Genome U133 matriz mais 2,0 a 45 ° C durante 16 h. subsequente lavagem e coloração foram realizados com um Fluidic Station-450 e GeneChips são digitalizados com Affymetrix GeneChip Scanner 7G. dados de microarray em bruto foram posteriormente analisados ​​usando software GeneSpring GX 10 (Silicon Genetics).

RT-PCR quantitativo e em tempo real, PCR

RT-PCR foi utilizado para detectar o nível de expressão de ARNm. O ARN foi extraído transcritos de modo inverso em ADNc utilizando o High-Capacity cDNA de transcrição reversa Kits (Thermo Fisher Scientific) de acordo com as instruções do fabricante. O cDNA resultante foi sujeito a PCR convencional ou análise quantitativa por PCR em tempo real. PCR convencional foi realizada utilizando polimerase de ADN GoTaq (Promega) e os iniciadores directo e inverso: p-actina (iniciador directo (FP): 5’CATCCACGAAACTACCTTCAACT3 ‘e iniciador (RP) Reverso: 5’TCTCCTTAGAGAGAAGTGGGGTG3’), HIF-1α (FP : 5’TGGACTCTGATC ATCTGACC3 “e RP: 5’CTCAAGTTGCTGGTCATCAG3 ‘), e VEGFA (FP: 5’CCTGGT GGACATCTTCCAGGAGTACC3” e RP: 5’GAAGCTCATCTCTCCTATGTGCT GGC3’.) [38]

Quantitative PCR em tempo real foi realizada utilizando StepOnePlus

™ tempo real, sistemas de PCR de acordo com as recomendações dos fornecedores (Thermo Fisher Scientific). Os iniciadores utilizados para quantitativa PCR em tempo real estão listadas na Tabela S1. Os níveis de mRNAs foram detectados com SYBR rápido

® Verde Mix Master (Thermo Fisher Scientific). A análise quantitativa foi realizada por meio da medição dos valores Ct durante a fase exponencial da amplificação. valores quantificação relativa foram calculados utilizando o

método -ΔΔCT 2 [39].

análise de enriquecimento Pathway

anotação funcional de genes regulados por hipóxia foi realizada utilizando o publicamente disponível DAVID Bioinformatics Recursos Versão 6,7 software (https://david.abcc.ncifcrf.gov/) com a Enciclopédia Kyoto de Genes e banco de dados via Genomas (KEGG). A significância estatística foi avaliada pelo teste exacto de Fisher modificado. P-value = 0 representa o enriquecimento perfeito. Valor P 0,05 é considerado fortemente enriquecida nas categorias de anotação

análise de citometria de fluxo

As culturas celulares foram vitalmente coradas com laranja de acridina. (AO; Sigma-Aldrich) a uma concentração de 5 ug /ml durante 15 min e, em seguida, lavadas com PBS. AO é um corante catiónico fluorescente que pode ser utilizado para medir os níveis de organelos vesiculares ácidas (lisossomas) no interior das células. Os níveis de organelas vesiculares ácidas foram analisados ​​utilizando o FACSCalibur (BD Biosciences) com excitação fixado em 488 nm e emissão a partir AO fluorescente foi detectado por FL-3 canal (670 nm).

O potencial de membrana mitocondrial foi determinada utilizando éster de metilo de tetrametilrodamina (TMRM). As culturas celulares foram coradas com 0,5 vitalmente TMRM? M durante 30 min a 37 ° C e depois lavadas com PBS. A intensidade de fluorescência de TMRM foram analisados ​​utilizando citometria de fluxo com FL-2 canal (564 ~ 606 nm). As amostras foram analisadas usando CellQuest 4.0.2 software Pro (BD Biosciences) e quantificação foi realizada utilizando software WinMDI 2,9 (Instituto Scripps Research, La Jolla, CA, EUA).

Lyso Tracker coloração

A Lyso Tracker vermelho DND-99 (Thermo Fisher Scientific) é usado para investigar a biossíntese e acumulação de lisossomas de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as células HCT116 cultivadas em lamelas foram marcadas com vermelho Lyso Tracker DND-99 (diluição 1: 5000) durante 1 h sob condições de crescimento. Após marcação, as células foram lavadas com PBS frio e fixadas com formaldeído a 3% em PBS durante 30 min. Após extensa lavagem com PBS, as amostras foram montadas imediatamente e observado utilizando um microscópio de fluorescência invertido (Zeiss Axio Observer A1, Alemanha) equipado com uma câmera CCD.

A análise estatística

Todos os dados foram apresentados como ± erro padrão da média e analisados ​​utilizando GraphPad Prism software 4.0 (GraphPad software Inc., La Jolla, CA, EUA). A análise estatística foi realizada utilizando um teste t não pareado. P-value 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

Tradução Geral é suscetível à hipóxia em células HCT116

Tem sido relatado que a tradução geral é inibida pela hipóxia. em vários tipos de células, mas genes hipoxia-responsive pode escapar da repressão de translação durante a hipóxia [32-34, 40]. Aqui, foi realizada polissoma perfilamento e RT-PCR para detectar a distribuição polissomal de mRNAs específicos. Os complexos /ribossoma de ARNm foram separadas em fracções de 11 utilizando um 15-40% de centrifugação em gradiente de sacarose linear (Fig 1A). A distribuição de um mARN dentro das fracções polissomal é o reflexo da sua eficiência de translação. Em primeiro lugar, utilizou-se diversas linhas celulares de cancro colorrectal para estudar os efeitos de hipóxia no tradução e observou-se que a hipoxia prolongada (1% O

2, ≧ 16 h) provocaram uma inibição dramática da tradução geral em células HCT116 (S1 FIG). eficiência de translação do gene doméstico de p-actina mudanças de ~ 60% para ~ 30% dentro de 16 horas de exposição a hipoxia (Figura 1B). Porque quinases PERK mTOR e têm sido propostos como factores importantes na regulação de translação durante a hipóxia [27], que, por conseguinte, analisada a estado de fosforilação dos substratos a jusante, as suas eIF2α e 4E-BP1, em células HCT116 sob hipóxia. A análise de imunotransferência mostrou que a hipoxia prolongada conduz a um ligeiro aumento da fosforilação eIF2α (Figura 1C), e 4E-BP1 desfosforilado é gradualmente dentro de 16 horas de exposição a hipoxia em células HCT116. Isto indica que a hipóxia inibe a tradução em geral, pelo menos em parte, através da ativação de PERK e inativação de mTOR em células HCT116.

A. extractos citoplasmáticos foram carregadas num ultracentrifugação em gradiente de sacarose 15-40% linear. Após centrifugação, o perfil de polissoma foi representada por A

254 valores (superior), e o ARN foi extraído a partir de cada fracção para análise. O RNA purificado foi resolvido num gel de formaldeído /agarose a 1%, e de rRNA foi visualizado por coloração com brometo de etídio (inferior). A distribuição de subunidades ribossomais e polissomas são indicados. B. células HCT116 foram tratadas com hipoxia (1% de O

2) durante 0, 4, 8, 16, e 24 h. A distribuição de mRNA polissomal β-actina foi detectada por perfis em polissoma e RT-PCR. eficiência de tradução do ARNm de β-actina foi calculada e mostrada como uma percentagem em diferentes pontos de tempo. C. O estado de fosforilação de eIF2α e 4E-BP1 foi determinada por análise de imunotransferência de células HCT116 expostas a hipoxia durante o período de tempo indicado. Os níveis de fosforilada (PI-) e as proteínas totais foram detectadas por anticorpos específicos contra fosfo-eIF2α (Ser51), eIF2α, fosfo-4E-BP1 (Thr37 /46), e 4E-BP1. Detecção de proteína β-actina serviu como um controlo de carregamento. D. Análise de imunotransferência de HIF-1α, GLUT1, VEGFA, e proteínas de p-actina em células HCT116 expostas a hipoxia durante 16 h. Detecção de proteína β-actina serviu como um controlo de carregamento. células de E. HCT116 foram cultivadas sob normoxia (21% de O

2) ou hipoxia (1% de O

2) durante 16 h. As células foram colhidas e lisadas em tampão RSB-150. extractos citoplasmáticos foram carregadas num ultracentrifugação em gradiente de sacarose 15-40% linear e recolhidos em 11 fracções (1 ml /fracção). ARN isolado a partir de cada fracção foi detectada por RT-PCR, e submetido a electroforese em gel de agarose. A região do gradiente polissomal inclui fracções 7-11. eficiência de translação de β-actina, HIF-1α, e VEGFA mRNAs foi calculado e apresentado como uma percentagem. 28S e 18S ARNr foram directamente visualizadas por coloração com brometo de etídio. A distribuição das subunidades ribossomais e polissomos são indicados.

Para investigar as mudanças na tradução durante a hipóxia, as células HCT116 foram cultivadas sob normóxica (21% O

2) e hipóxia (1% O

2) condições de cultura durante 16 h. Como esperado, a hipoxia estabiliza proteína HIF-1α e induz a expressão de HIF-1 genes alvo GLUT1 e VEGFA em células HCT116 (Figura 1D). Nós também realizada polissoma perfilamento e RT-PCR para avaliar a eficiência de tradução do ARNm seleccionados. Electroforese em gel desnaturante de agarose de rRNA mostrou uma mudança de mRNAs a partir dos polissomas em complexos de iniciação de tradução (Figura 1E, painel inferior). A acumulação de 18S e 28S rRNAs em baixas frações de peso molecular ribossomais (fracções 5-6; hipoxia) indicou a repressão de translação durante a hipóxia. A distribuição de mRNA polissomal β-actina foi evidentemente diminuída em células HCT116 hipóxicas como comparado com o controlo normóxica (Fig 1E, painel superior). Uma grande porção do ARNm β-actina (68,7%) estava associado com polissomas em células HCT116 normóxicas, ao passo que apenas 32,0% do ARNm β-actina permaneceu associada com polissomas em células HCT116 hipóxicas. Em contraste, a distribuição polissomal de HIF-1α e VEGFA mRNAs foram relativamente pouco afectados pela hipoxia (Figura 1E, painéis do meio). Mais da metade dos HIF-1α (58,1%) e VEGFA (53,8%) mRNAs permaneceu associado com polissomos após 16 h de exposição à hipóxia. De acordo com estudos anteriores [33, 34], HIF-1α e mRNAs VEGFA têm a capacidade de escapar da repressão de translação durante a hipóxia. Portanto, assumimos que mRNAs selecionados permanecem eficientemente traduzido em células HCT116 em condições de hipóxia.

regulação Translational de mRNAs selecionados em células HCT116 durante a hipóxia

Para investigar o impacto da hipóxia sobre a tradução, nós exploramos perfilamento polissoma acoplado a análise de cDNA microarray para pesquisar genes regulados por hipoxia. Ambos os ARNm associado a polissomas e ARN total de células HCT116 de normóxia e de hipóxia foram isoladas e submetidas a hibridação de micromatriz. ARNm associado a polissomas foram isolados a partir de um conjunto de fracções polissomal (Fig 1A, fracções 8-11) para a análise de translatome. O ARN total foi extraído a partir das mesmas amostras para a análise de transcriptoma. A mudança de translação de um ARNm foi medido pela alteração na abundância de ARN polissomal normalizada para a alteração na abundância de ARN total para cada ARNm (Figura 2, polissomal /total). Genes com alterações ≧ duas vezes após exposição a hipoxia foram considerados como genes candidatos regulado por hipoxia. Todos os genes candidatos foram divididos em quatro categorias: supra-regulados e regulados negativamente os genes, quer ao nível translacional ou da transcrição (Figura 2). Como resultado, 1,036 genes supra-regulados e 480 genes regulados negativamente foram identificados por análise translatome. A análise do transcriptoma paralelo identificados 144 genes up-regulamentados e 134 genes regulados negativamente. No entanto, apenas ~ 32% dos genes regulados por hipóxia nos sinais nível de exposição de transcrição de co-regulação de translação em células HCT116 durante a hipóxia (Fig 2, diagramas de Venn). Isto indica que a hipóxia pode afetar diferentes subconjuntos de genes-alvo entre translatome e transcriptoma.

Os resultados da análise microarray foram analisados ​​utilizando GeneSpring GX 10 software. Genes com ≧ alteração de 2 vezes na razão ARN polissomal /ou total de ARN total foram definidos como genes regulados por hipoxia. Os resultados foram obtidos a partir de três experiências independentes. genes regulados por hipoxia foram divididos em quatro categorias: supra-regulados e os genes regulados negativamente na translacional (translatome) e os níveis de transcrição (transcriptoma), respectivamente. diagramas de Venn mostrar a sobreposição de genes regulados por hipóxia entre translatome e transcriptoma. Os números em áreas sobrepostas indicam genes regulados por hipóxia em níveis tanto a translação e transcrição em células HCT116.

Validação de genes candidatos cuja tradução é sobre-regulada por hipóxia em células HCT116

para verificar os dados de microarray, vários genes candidatos foram analisados ​​por meio de perfis em polissoma e quantitativo em tempo real de RT-PCR. A associação polissomal de ARNm β-actina foi evidentemente diminuída em células HCT116 expostas a hipoxia (Figura 3A). Em contraste, os mRNAs associada-polissomas de ambos em translação e transcricionalmente regulados positivamente genes de

GLUT1

,

ADM

, e

VEGFA

foram aumentados em células HCT116 durante a hipóxia como comparado a normoxia (Fig 3B), indicando que os três genes permanecem eficientemente traduzido em condições de hipoxia. Resultados semelhantes foram obtidos a partir de translação mas não transcricionalmente regulados positivamente genes

HSPA5,

VCAN

, e

Gpr126

(Fig 3C). Após o cálculo, estes genes em translação sobre-regulada mostrou um aumento na eficiência de translação durante a hipóxia, em comparação com a normoxia (Fig 3D). Os resultados dos experimentos de validação são razoavelmente consistentes com as medidas de microarray. Isso indica que muitos genes pode escapar da repressão translacional e permanecem eficientemente traduzido em células HCT116 durante a hipóxia.

Vários genes regulados positivamente no nível de translação (translatome) em células HCT116 hipóxicos foram validados. ARN isolado por fraccionamento em gradiente de sacarose foi analisada por quantitativo em tempo real de RT-PCR. A distribuição de ARNm em cada uma das fracções foi calculada e apresentada como uma percentagem (%). A. Perfil do polissomal de β-actina serviu como um controlo negativo. perfis B. polissomal de genes up-regulamentados tanto a nível da translação e transcrição (

GLUT1

,

ADM

, e

VEGFA

). perfis C. polissomal de genes up-regulamentados no translacional, mas não nível da transcrição (

HSPA5

,

VCAN

, e

Gpr126

). D. eficiência de translação da β-actina, GLUT1, a ADM, VEGFA, HSPA5, VCAN, e Gpr126 mRNAs foi calculada e apresentada como uma percentagem (%) em células HCT116 sob normoxia e hipoxia. Os gráficos de barras mostram ± erro padrão da média de pelo menos três experiências independentes (* P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001)

análise de enriquecimento Caminho de hipóxia. genes -regulated ao nível da tradução

a fim de obter insights sobre as funções biológicas dos genes regulados por hipóxia, análise de enriquecimento via foi realizada utilizando 6,7 software David Bioinformática Recursos para mapear genes de vias biológicas como definido pela banco de dados via KEGG. Os resultados mostraram que a hipoxia leva a translacional sobre-regulação de genes que funcionam no lisossoma, o metabolismo lipídico e glicano, processamento e apresentação de antigénios, adesão celular, e a remodelação da matriz extracelular (ECM) e citoesqueleto (Tabela 1). Em contraste, hipoxia sub-regula a tradução de genes envolvidos na apoptose, a proteólise mediada por ubiquitina, e fosforilação oxidativa (Tabela 2). Uma função principal de lisossomas é o autofagia digestivo em células eucarióticas. Portanto, assumimos que a hipóxia induz a autofagia lisossômico e reorganização metabólica para manter a homeostase energética através de um mecanismo de translação.

hipóxia induz a autofagia lisossômico e disfunção mitocondrial através da regulação de translação em células HCT116

identificaram 35 genes sobre-regulada em translação que funcionam na via lisossomal em células HCT116 expostas a hipoxia (Tabela 1). Curiosamente, todos os genes lisossomais 35 foram regulados positivamente durante a hipóxia ao nível da tradução independente de transcrição (Tabela 3). Isto indica que a regulação de translação pode desempenhar um papel crucial na autofagia induzida por hipoxia. Lisossomas pode ser quantificada por citometria de fluxo, após coloração das células com laranja de acridina (AO), uma base fraca que se acumula lysosomotropic dentro dos organelos vesiculares ácidas de células vivas. A intensidade de fluorescência de AO foi significativamente aumentado nas células HCT116 depois de exposição a hipoxia durante 24 h (Figura 4A), sugerindo que a hipóxia leva a um aumento do teor de lisossomas. Nós próxima utilizado Lyso Tracker Red DND-99, um corante fluorescente para acidotropic rotulagem e rastreamento organelas ácidas em células vivas, para manchar lisossomos. Lisossomas foram corados de vermelho brilhante em células HCT116, hipoxia e dá origem a lisossomas aumentados em comparação com a normoxia (Fig 4B). Os resultados indicam que a hipoxia aumenta o tamanho do volume do lisossoma. Examinamos ainda mais a indução de autofagia, monitorando a autofagia cadeia leve proteína marcadora 3 (LC3) em células HCT116 sob hipóxia comparado a normoxia. Conversão de LC3-I lc3-II e degradação de LC3 total (LC3-I mais LC3-II) foram usadas para determinar as alterações na dimensão da autofagia [41]. A análise de imunotransferência mostrou que LC3-I lc3-II de conversão (LC3-II /LC3-I rácio) foi aumentada e a quantidade total de LC3 foi diminuída em células HCT116 expostas a hipoxia durante 24 h e 48 h Figura 4C, o painel (esquerda ), sugerindo autofagia induzida por hipoxia. Nós também detectou a p62 proteína autofagia marcador, que é degradada durante a autofagia [41]. Consistentemente, a quantidade de p62 também mostraram uma diminuição marcada em células HCT116 hipóxicas (Figura 4C, painel da direita). Para verificar a translação induzida por hipoxia-regulação de proteínas lisossómicas (Tabela 3), foram detectados níveis tanto da proteína e de mARN de genes lisossomais glucosamina (N-acetil) -6-sulfatase (

GNS

), prosaposina (

PSAP

) e tripeptidil peptidase 1 (

TPP1

). Depois de exposição a hipoxia durante 24 horas, o nível de GNS e proteínas PSAP foi aumentado em ~ 2 vezes em comparação com a normoxia (Figura 5A). O nível de proteína TPP1 também foi ligeiramente aumentada durante a hipóxia. Um ensaio quantitativo mostrou que os níveis de mRNA de GNS, PSAP, e TPP1 não são significativamente afectadas por hipoxia (Figura 5A). Os resultados indicam que a hipóxia enriquece proteínas lisossomais por meio de mecanismos de translação.

A. As células HCT116 foram cultivadas sob normoxia (21% de O

2) ou hipoxia (1% de O

2) durante 24 h. As células foram coradas com laranja de acridina (AO) e analisadas por citometria de fluxo para medir o teor de lisossomas. Os gráficos de barras mostra a intensidade de fluorescência média de AO a partir de pelo menos três experiências independentes (** p 0,01). B. células HCT116 foram cultivadas sob normoxia (21% de O

2) ou hipoxia (1% de O

2) durante 24 h. Lisossomos foram marcadas com Lyso Tracker Red DND-99 para 1 h em células vivas e observado por um microscópio de fluorescência invertido. C. As células HCT116 foram expostas a hipoxia (H) ou normoxia (N), durante 24 h e 48 h. Os extractos celulares totais foram analisados ​​por imunotransferência com anticorpos LC3 e p-actina (painel esquerdo). As bandas LC3-I e LC3-II foram quantificados, e autofagia foi medida por variações na proporção de LC3-II /LC3-I e a quantidade total de LC3 (LC3-I mais LC3-II) normalizado para p-actina durante cada condição. Os gráficos de barras mostram o nível de proteína LC3 relativo normalizado para p-actina a partir de pelo menos três experiências independentes (** p 0,01). As amostras acima foram também analisados ​​por imunotransferência com anticorpos de p62 e α-tubulina (painel direito).