Abstract

cancro da bexiga urinária (UBC) ocupa a nona posição no câncer em todo o mundo. No Egito, o padrão de câncer de bexiga é o único que ambos os tipos de células transicionais e escamosas prevalecer. Apesar de muita pesquisa sobre o tema, ainda é difícil prever a progressão do tumor, a terapia ideal e resultado clínico. O transportador de folato reduzido (RFC /SLC19A1) é o sistema de transporte principal para folatos em células e tecidos de mamíferos. RFC também é o principal meio de captação celular de câncer antifolate medicamentos quimioterápicos, no entanto, transporte de membrana de antifolates pela RFC é considerado como uma limitação à atividade antitumoral. O objetivo deste estudo foi comparar o nível de expressão de mRNA do RFC /SLC19A1 em uroteliais e não uroteliais variantes do carcinoma da bexiga. A quantificação de ARNm RFC na mucosa de 41 pacientes de cancro da bexiga não tratados foi realizada por meio de RT-qPCR. ARNm RFC níveis de estado estacionário foram ~ 9 vezes maior (n = 39; P 0,0001) em espécimes de tumor da bexiga em relação ao ARNm normal da bexiga. RFC regulação positiva estava fortemente correlacionada com o tipo de tumor (urotelial

vs

não urotelial;. P 0,05), onde mediana expressão de ARNm RFC foi significativamente (p 0,05) maior no urotelial (~14 vezes) em comparação com o não-urotelial (~ 4 vezes) variante. Isto pode explicar a variação em resposta a regimes contendo antifolato utilizados no tratamento de qualquer um dos tipos. Os níveis de ARNm RFC não foram associados com o grau do tumor (I, II e III) ou fase (músculo-invasivo

vs.

não-invasiva do músculo) implicando que o RFC não pode ser utilizado para fins de prognóstico no carcinoma da bexiga e o seu aumento expressão é um evento precoce na patogénese tumores de bexiga humana. Além disso, RFC pode ser considerado como um potencial marcador para prever a resposta ao anti-folato quimioterapia em carcinomas uroteliais

Citation:. Abdel-Haleem AM, El-Zeiry MI, Mahran LG, Abou-Aisha K, Rady MH, Rohde J, et ai. (2011) Expressão da RFC /SLC19A1 está associado com o tipo de tumor na bexiga pacientes com câncer. PLoS ONE 6 (7): e21820. doi: 10.1371 /journal.pone.0021820

editor: Hassan Ashktorab, Howard University, Estados Unidos da América

Recebido: 19 Janeiro, 2011; Aceito: 12 de junho de 2011; Publicação: 08 de julho de 2011

Direitos de autor: © 2011 Abdel-Haleem et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo DAAD, bem como GUC como o financiamento do projecto MSC. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

20-60% da incidência de câncer em todo o mundo tem sido associada a fatores nutricionais [1]. Entre os nutrientes mais estudados envolvidos na etiologia do cancro é a vitamina ácido fólico. Os folatos são essenciais para a vida, e deficiência de folato contribui para uma série de problemas de saúde, incluindo doenças cardiovasculares, anormalidades fetais, distúrbios neurológicos e câncer [1], [2].

Cancro da bexiga é o nono mais câncer comum em todo o mundo. A maioria (77%) dos tumores da bexiga ocorrem em homens. É a sétima neoplasia maligna mais comum em homens e 17 em mulheres [3]. O espectro de tumores de bexiga é amplo e inclui o carcinoma de células transicionais (TCC), carcinoma espinocelular (SCC), adenocarcinoma e carcinoma de células pequenas. CTP é, de longe, o mais prevalente e melhor estudada. Nos Estados Unidos, 90% dos tumores da bexiga são da variante urotelial que evolui a partir de células de transição. Por outro lado, no Egito, o tipo histológico mais comum de cancro da bexiga costumava ser SCC [4], constituindo de 59% para 81% dos cancros da bexiga relatados entre 1960 e 1980 [4], [5]. Ao contrário do que a principal etiologia do tabagismo e exposições ocupacionais em países ocidentais, infecção da bexiga crônica com

Schistosoma haematobium

, tem sido o fator de risco mais importante para o câncer de bexiga no Egito [5]. No entanto, estudos recentes [5], [6] relatou que a SCC no Egito parece ter diminuído de 78% em 1980 para 27% em 2005.

amostras de biópsia de lesões tumorais de bexiga pode ser facilmente obtido por trans ressecção -urethral (TUR) antes do tratamento. Apesar de muita pesquisa sobre o tema, ainda é difícil prever a progressão do tumor, a terapia ideal e resultado clínico [7]. O estadiamento do tumor (sistema TNM) é considerado como sendo o melhor marcador de prognóstico; No entanto, a incapacidade de prever com precisão progressão ou recorrência é freqüentemente experimentada [8]. Além disso, o insucesso do tratamento é uma área importante em que a investigação do cancro da bexiga translacional poderia beneficiar pacientes. Por exemplo, o regime MVAC (um regime contendo antifolate) exibe somente a atividade antitumoral limitada contra o câncer de células não-transição, enquanto as taxas de resposta de até ~ 70% foram relatados em TCC no mesmo estudo [9]. Se discrepâncias genéticas entre as duas variantes do carcinoma da bexiga afectar a sua progressão e /ou resposta à quimioterapia, em seguida, a pergunta é; quais marcador genético (s) é (são) os mais críticos?

O transportador folato reduzido ubiquamente expressa (RFC) é considerada a principal via de transporte para folatos em concentrações cofactor fisiológicos mesmo quando vários sistemas de captação estão presentes [ ,,,0],1], [10], [11]. Perda de expressão ou função RFC prenuncia potencialmente profunda fisiológico e consequências para o desenvolvimento [1], [12]. RFC também é um importante transportador de drogas antifolato utilizados para quimioterapia do cancro, tais como o metotrexato (MTX), pemetrexedo e Raltitrexeda. A eficácia da quimioterapia com estes agentes está estreitamente relacionada com os níveis de actividade e de CRF em ambos os tumores e tecidos normais [13], [14]. MTX, por exemplo, continua a ser um componente importante no arsenal de quimioterapêutico para uma variedade de doenças malignas, incluindo cancro da bexiga [15], [16]. O pemetrexed também foi recentemente considerado para uso no tratamento de cancro da bexiga [16]. transporte de membrana destas antifolatos é crítica para Actividade Antitumoral uma vez que este proporciona suficiente (não ligada) de droga intracelular para sustentar a inibição máxima de enzimas-alvo (por exemplo, DHFR, dihidrofolato reductase) e para a síntese de derivados de poliglutamato necessários para a ligação de alta afinidade para enzimas intracelulares [13 ]. A expressão de gene do transportador de folato reduzido podem ser estudados de forma fiável ao nível do ARNm, e com base numa série de estudos [13], [14], [17], [18], [19], [20], [21] a expressão é susceptível de reflectir a actividade do CRF em ambos os tumores e tecidos normais. Assim, inspecionando discrepâncias na expressão RFC entre os diferentes tipos de cancros da bexiga pode abrir o caminho para uma possível melhoria da quimioterapia contendo antifolato com base racionalmente.

O presente estudo foi, portanto, realizado para investigar a expressão do mRNA e potencial clínico relevância (ou seja, as associações com o estágio do tumor, grau e /ou tipo histológico) do grande transportador de folato, RFC, em um grupo de tumores da bexiga humanos de diferentes tipos histológicos.

Materiais e Métodos

Ethical declaração

Um número inicial de 61 pacientes com câncer de bexiga foram incluídos neste estudo. Todos os pacientes ‘dados foram analisados ​​de forma anónima e pacientes “consentimento foi obtido para incluir tecido excisado para o estudo atual através do departamento de patologia do Instituto Nacional do Câncer (NCI), Cairo, Egito. Todos os protocolos de pesquisa foram aprovados pelos conselhos de revisão institucionais do NCI e Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Alemã do Cairo.

Os pacientes

Sessenta e um biópsias de tumores foram obtidos por TUR no NCI durante no período de março de 2009 a janeiro de 2010. 17 espécimes foram posteriormente excluídos do estudo durante a etapa de verificação de qualidade de RNA (ver abaixo). Para as 44 amostras restantes, estágio do tumor e grau foram atribuídos de acordo com o TNM [4] pela unidade de patologia na NCI .. Os pacientes incluídos no estudo (n = 44; 31 machos, 11 fêmeas e 2 não identificada; faixa etária: 31 a 79) foram divididos em dois grupos principais, dependendo do tipo histológico do tumor: grupo ‘tumores uroteliais; TCC e TCC com metaplasia escamosa; e não-urothelial grupo ‘tumores; SCC e adenocarcinoma. No momento da inclusão, nenhum dos pacientes tinham recebido tratamento de qualquer formato. As características clínicas dos pacientes com câncer de bexiga incluídos neste estudo estão listados na Tabela S1.

extração de RNA total e transcrição reversa

biópsias de tumores excisados ​​utilizados para análise mRNA foram imediatamente colocados em RNA

depois

® ARN Estabilização Reagent (Qiagen, Alemanha), foi mantida a -4 ° C durante a noite, em seguida, armazenada a -20 ° C. O ARN total foi extraído a partir de biópsias congeladas (~ 30 mg) usando o Mini-prep kit Absolutely RNA (Stratagene, Alemanha) de acordo com as instruções dos fabricantes. a integridade de ARN foi isolado por electroforese verificadas por coloração com brometo de etídio e por A

260 Uma razão de absorção /

280 (gama 1,8-2,0) (A260 nm = 1 corresponde a 40 ug /mL de ARN). A proporção 02:01 intensidade entre 28S e 18S rRNA foi considerado uma referência para RNA intacto (Figura S1). 17 amostras de tumor foram excluídos do estudo com base no seu perfil de integridade do RNA (Figura S1). 5 ug ARN total foi transcrito de forma inversa com a Sprint ™ RT produtos completos kit (Clontech, Alemanha) num volume de 20 uL de acordo com as instruções dos fabricantes.

RT-qPCR quantificação de ARNm RFC

o protocolo RT-qPCR seguida neste estudo foi estruturado em torno de as informações mínimas que publicação de quantitativos Experimentos PCR em Tempo real orientações (MIQE), publicado pela Bustin

et al.

[22]. RFC mRNA foi quantificado por RT-qPCR no instrumento Mx3005P ™ (Stratagene, EUA). Transcrições de β-actina foi quantificada como um controlo de RNA endógeno [7], [23] para eliminar variações na quantidade e /ou qualidade do RNA total adicionado a cada mistura de reacção e cada amostra foi normalizada com base na sua β-actina teor de ARNm. Todas as quantificações neste estudo são apresentados como a razão entre o gene-alvo e β-actina. As sequências dos iniciadores, a temperatura de recozimento e de PCR de tamanho produtos para o RFC gene alvo e o gene de referência β-actina estão apresentados na Tabela 1. A especificidade de cada par de iniciadores foi confirmada por análise da curva de fusão (Figura S2), que resultou em um produto único de fusão específico temperaturas.

Cada par de primers foi avaliada em estruturas secundárias e SNPs pela

in silico

ferramenta de avaliação no RTPrimerDB (https://medgen.ugent.be/rtprimerdb). iniciador livre de sal altamente purificada para RFC e β-actina (Tabela 1) foram gerados comercialmente (Metabion GmbH, Alemanha) e optimizado para uma de duas etapas (temperatura combinada de hibridação /prolongamento) protocolo de PCR. Um conjunto de amostras de ADNc de cancro da bexiga 3 foi utilizada para a optimização de ensaio e avaliação da eficiência de amplificação (Tabela 1) utilizando a “curva padrão” método. Uma curva padrão para cada gene foi então gerada automaticamente pelo software Mx3005P ™ onde o log da concentração alvo foi representada graficamente contra o valor correspondente ciclo de quantificação (CQ) [22]. Condições para todos os PCRs foram otimizados em relação a encaminhar e reverter as concentrações de primers e várias temperaturas de recozimento (55-66 ° C). Real-time PCR mastermix dos seguintes componentes de reacção foi preparado para o fim-concentração indicada: 12,5 ul de alimentação SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Reino Unido), 0,2 ul de iniciador directo RFC (100 nM), 0,2 ul de iniciador reverso RFC (100 nM) e 11,1 uL de água livre de nuclease para o gene alvo; e 12,5 ul da mistura de alimentação SYBR® verde PCR Master, 0,75 ul de iniciador forward β-actina (300 nM), 0,75 ul de iniciador reverso β-actina (300 nM) e 10 ul de água isenta de nuclease para o gene de referência. 24 ul da mastermix preparadas foram pipetadas por poço numa placa de 96 poços. 1 ul de ADNc molde foi depois adicionada a cada poço de reacção. Aplicações da entrada total de ADNc foram realizadas em duplicado. A placa de 96 poços foi selado por uma película adesiva óptica de PCR (Eppendorf AG, Alemanha). O seguinte perfil térmico optimizados foi utilizado: programa de desnaturação (95 ° C durante 10 min), o programa de amplificação e quantificação repetido 40 vezes (95 ° C durante 15 s, 60 ° C durante 1 min, com uma única medição de fluorescência), que funde curva programa (55-95 ° C com uma taxa de aquecimento de 0,1 ° C por segundo e uma medição de fluorescência contínua). Os dados de fluorescência foram recolhidas e o ARNm quantificado com software Mx3005P ™ versão 4.1. valores CQ foram calculadas automaticamente de acordo com o “método de ponto de ajuste”; Cq, onde é definida como o número de ciclos fraccionada na qual a curva cinética de PCR atinge um valor limite definido pelo programa de fluorescência.

A mudança vezes na expressão de β-actina foi estimado de acordo com o método de Schmittgen e Livak [24]. Como mostrado na Tabela 2, a variação na expressão β-actina foi mínima entre os grupos uroteliais e não-uroteliais.

Análise estatística

Os dados foram testados quanto à normalidade utilizando o teste de Shapiro teste de normalidade -Wilk. Testes não paramétricos foram decididos em conformidade. Os valores de p inferiores a 0,05 foram considerados significativos. O U-teste de Mann-Whitney e Kruskal-Wallis foram usadas para correlacionar a expressão da RFC com o estágio do tumor, grau e tipo. O software

Graph Pad Prism

(versão 5) foi utilizado para a análise estatística.

Resultados

expressão de mRNA do RFC

A expressão de mRNA do folato transportador RFC foi quantificado em amostras de cancro da bexiga 41, três amostras sem evidência de malignidade obtida a partir de mucosa da bexiga adjacente ao tecido canceroso, e um ARN de bexiga de referência disponíveis comercialmente reunido de 26 caucasianos macho /fêmea; idade 22-70 (Clonetech, Alemanha). O último será referido como o calibrador nas secções seguintes.

RFC expressão de ARNm foi detectada em todas as amostras de bexiga utilizados neste estudo. Os níveis de expressão de estado estacionário de mRNA RFC foram significativamente (

P Art 0,0001) maior nas amostras de cancro da bexiga por ~ 9 vezes (8.661, faixa de 0,98-50, N = 39) do que no calibrador .

Clinical

vs.

hisotpathological parâmetros

a análise multivariada foi realizada para determinar os fatores mais significativos com que a expressão do mRNA RFC foi associado. A correlação entre os níveis de mRNA RFC e os parâmetros clínico testados de câncer de bexiga são resumidos na Tabela 3. nível de expressão relativa RFC foi significativamente (

P Art 0,05). Maior em urotelial

vs

não carcinomas da bexiga -urothelial onde ARNm RFC foi aumentada por ~14 vezes (13,27; N = 27) em tumores uroteliais, em comparação com 4 vezes (4,083; N = 10) aumentam apenas nas variantes não uroteliais (Figura 1A). O nível de expressão mediana de RFC na espécimes TCC foi 17,48; n = 23, em comparação com 5,538; n = 6 em amostras classificadas como TCC com metaplasia escamosa ou carcinomas de células escamosas de transição e mistos. No entanto, houve diferença estatisticamente significativa entre a expressão do mRNA RFC em amostras de cancro da bexiga classificados como pura TCC

vs.

Aqueles que têm TCC com metaplasia de células escamosas (Figura 1D). Isto mostra que a expressão de ARNm em RFC tumores uroteliais não é muito menor do que os seus homólogos em uroteliais e o componente escamoso está predominantemente associada com a expressão de ARNm RFC reduzida. O nível de expressão de CRF em amostras de cancro da bexiga contendo óvulos bilharzial foi comparado com aqueles sem evidência de infecção bilharzial onde RFC mRNA foi significativamente (

P Art 0,05) diminuiu em (BA) espécimes bilharzial-associado de cancro da bexiga (3,13; N = 7) em comparação com o grupo não-bilharzial-associado (9,76; N = 32). (Figura 1E)

linhas horizontais sólidas demonstrar a mediana de cada grupo individual. Todos os dados estão apresentados como a razão entre o gene-alvo e beta-actina. *

P

-valor, não paramétrico, Mann-Whitney ou Kruskal-Wallis. BA, Bilharizal associada

Nós examinamos a correlação entre os níveis de expressão de mRNA RFC e marcadores de agressividade do tumor. (Ou seja, grau e estágio). A expressão de mRNA RFC não se correlacionou com o grau do tumor (Figura 1B), onde não houve diferença estatisticamente significativa (

P

= 0,3008) detectados entre os graus I, II ou III. Além disso, a expressão RFC não foi estatisticamente alterada (

P

= 0,2666) entre músculo-invasivo e não-musculares espécimes invasoras (Figura 1C). Notavelmente, todos os espécimes SCC (n = 8) foram classificados como tumores músculo-invasivo, que aponta para a natureza mais agressiva de SCC e carcinomas não-uroteliais. Além disso, não houve diferença estatisticamente significativa (

P

= 0,2162) entre as idades de pacientes com carcinomas uroteliais (média = 60,42)

vs.

Os do grupo não-urotelial (média = 52,88).

Discussão

Uma vez que as células de mamíferos não podem sintetizar folatos

de novo

, os processos de captação celular fortemente regulada evoluíram para sustentar níveis suficientes de folatos intracelulares [25], [26]. No contexto de neoplasia maligna, o principal sistema transportador de folato, RFC, o aumento da expressão é consistente com a necessidade de aumentar a retenção celular de folatos para suportar os requisitos de que as células cancerosas se dividem rapidamente para a síntese de ADN e replicação. No presente estudo, as nossas descobertas em biópsias de cancro da bexiga humano estavam de acordo com esta noção, onde a expressão do mRNA RFC foi significativamente aumentado pela ~14 vezes em carcinomas da bexiga uroteliais (CTP e de CTP com metaplasia escamosa) e por ~ 4 vezes na variantes não uroteliais (SCC adenocarcinoma). expressão alterada de RFC foi também relatado em leucemias, especialmente B-precursor ALL [11], [26], [27], osteossarcoma [17], câncer colorretal e linfomas do sistema nervoso central primários [1], tanto a transcrição e proteínas níveis.

a discrepância na expressão de mRNA RFC entre urotelial e tumores de bexiga não-uroteliais, relatados no estudo atual, poderia ser atribuída a montante eventos genéticos que ocorrem em cada tipo, que podem afetar a regulação da transcrição do transportador. Ambos TFs ubíquos e específicos de tecidos que transactivar ou reprimir a transcrição em resposta aos requisitos de cofactores de folato controlar os níveis de transcritos de líquidos RFC tecidos em [1], [18]. Literatura e mineração caminho usando o

LitInspector

software [28] mostrou que RFC (SLC19A1) tem potenciais interações com (proteína 1 de ligação elemento responsivo CAMP) CREB1. CRE /AP-1 semelhante a sequência de consenso é um dos dois locais principais de regulação dos promotores RFC basais [18]. CREB, que se liga ao CRE /AP-1, está entre os TFs activados pela ERK (MAPK), que são componentes da via de sinalização RTK-RAS. Acumulando evidências indicam que os principais componentes desta via de sinalização são frequentemente ativada em carcinomas uroteliais humanos [29], mas não nos tipos não-uroteliais [30], [31]. Em células de fibrossarcoma humano, CREB-1 e c-Jun foram os factores de transcrição específicos de células envolvidas na ligação de CRE no promotor RFC. Descobertas similares foram reportados para CREB-1 e ATF-1 em células de carcinoma hepatocelular humano e células de leucemia humana [18], [32]. Além disso, dois terços das linhas celulares resistentes antifolato apresentado uma diminuição acentuada no factor de transcrição de ligação a um único local CRE presente no promotor mínimo do gene Um RFC [33]. Por isso, há cada vez mais evidências que sugerem que a ligação do CREB-1 para CRE no promotor RFC é um importante contribuinte para a indução da expressão do gene RFC em linhas celulares de cancro e tumores malignos [18], [32], [33]. Portanto, a hipótese de que a ativação constitutiva da via RTK-RAS é provavelmente um fator que explica o aumento da expressão do mRNA RFC em carcinomas uroteliais. Em carcinomas não-uroteliais, no entanto, mutações RAS são raras e outras mutações entram em jogo (p16 p15 exclusão [31], [32], Bax, Bak EGFR superexpressão e p53 inactivação [32]). Por isso, esperamos que diferentes eventos genéticos ter levado ao aumento modesto no nível de mRNA RFC em carcinomas não-uroteliais, e possivelmente diferentes TFs envolvidos na activação da transcrição RFC. Isto é ainda suportado pelo facto de que a expressão aumentada RFC é muito susceptível de ser associada com a inactivação de genes supressores de tumores, em que 5-metil tetra-hidrofolato (5-CH3-THF) é um cof actor na síntese de novo de S-adenosilmetionina que participa na metilação de ilhas CpG. RFC é a principal via de entrada para THF e aumento da expressão RFC seria consequentemente levar a uma acumulação do folato reduzido metilado [11], [15], que pode eventualmente levar à inactivação de vários genes supressores de tumor como; p16, p15 e /ou p53 [34], [35].

Além disso, com base em nossos achados, RFC superexpressão implica que carcinomas da bexiga urothelial seria intrinsecamente mais sensíveis a antifolates enquanto carcinomas não-uroteliais mostraria uma resposta menos favorável aos anti-folato quimioterapia. Essa especulação pode explicar porque a exposições no regime só atividade antitumoral limitada MVAC contra o câncer de células não-transição, enquanto as taxas de resposta até ~ 70% foram relatados em TCC no mesmo estudo [9].

Nossas descobertas mostrando que RFC aumento da expressão de mRNA não está relacionado com o grau do tumor ou implicada fase que a expressão aumentada de ARNm RFC parece ocorrer no início do processo de progressão do tumor multi-passo. Esta hipótese é reforçada pelo aumento da expressão de mRNA RFC consistentes entre os diferentes grupos de idade em nosso estudo. No entanto, tem sido relatado que apenas ~ 15% dos tumores superficiais de baixo grau prosseguirá para infiltrar a massa muscular e que os tumores músculo-invasivo de elevado grau, quer originários de carcinoma plana in situ (CIS) /displasia de alto grau ou surgem

de novo

[29]. Assim, uma hipótese alternativa pode ser que um aumento da expressão de mRNA RFC ocorre como uma consequência de eventos independentes entre os diferentes tipos de carcinomas da bexiga. Curiosamente, todos os biópsias de tumores uroteliais não utilizados neste estudo foram apontador músculo-invasivo para as funções de diagnóstico desfavoráveis ​​de tumores uroteliais não como já foi sugerido por Erdemir

et ai.

[19]. O significado clínico da diferenciação escamosa parece ser uma característica prognóstico desfavorável devido à sua associação com tumores invasivos alto grau.

Embora foi detectada uma diferença significativa entre os níveis de expressão RFC em cancros da bexiga bilharzial- e não bilharzial-associado , esta conclusão não pode ser conclusivo uma vez que apenas 7 casos (18% do total) de câncer de bexiga bilharzial-associadas foram incluídas neste estudo (cf 32 caso não bilharzial-associado). Além disso, o nível mais elevado de expressão de mRNA RFC na BA-TCC (2 amostras)

contra

o SCC ou tipos mistos (5 peças) pode também implicar que RFC aumento da expressão do mRNA é realmente independente da infecção bilharzial.

Vale a pena mencionar (uma vez que este suporta a relevância) é que as características das amostras de cancro da bexiga utilizados neste estudo eram representativos da população dos pacientes com cancro da bexiga com relação a sexo, idade e tipo histológico. A proporção de pacientes female:male foi ~1:3. A idade média de todos os pacientes de cancro da bexiga incluídos no estudo foi de 60, onde a idade média dos grupos não-uroteliais foi menor do que a dos pacientes de carcinoma da bexiga uroteliais (53

vs.

60) indicando a agressiva natureza das variantes não-uroteliais de câncer de bexiga. Além disso, 64% dos pacientes tiveram carcinomas uroteliais, enquanto que apenas 24% apresentavam as variantes não uroteliais. Estes dados demográficos estavam de acordo com o padrão de mudança de cancro da bexiga no Egito já foi relatado por Felix

et al.

Em 2008 [5], assim, destacando o surgimento ea prevalência do tipo de células transicionais e retração da tipos non-urothelial.

Conclusivamente, expressão RFC podem ser considerados como uma arma de dois gumes (Figura 2). O aumento da expressão RFC iria promover a quimiossensibilidade antifolatos tempo, expandir o tamanho da piscina folato intracelular; o que pode conduzir a resistência adquirida. Esta noção é ainda apoiada pela descoberta de que a perda de exportadores folato levou a resistência a antifolatos através de uma expansão do tamanho do conjunto de folato [21]. Particularmente, em carcinomas da bexiga, Rady

et al.

, (Resultados não publicados) informou que BCRP (exportações mono-, di-, e triglutamates de folatos) expressão foi diminuiu, enquanto MRP3, que têm restringido capacidade de exportar apenas folatos monoglutamate, foi encontrado para ser sobre-expresso [trabalho não publicado por Rady et al. 2009]. Além disso, MRP3 foi significativamente maior no urotelial em relação à variante de carcinoma da bexiga não urotelial [trabalho não publicado por Rady et ai. 2009]. Estas variações nos níveis de bombas de efluxo e influxo antifolatos expressão implica que a utilização de um painel de marcadores genéticos para cada tipo de tumor pode ser mais apropriado para definir a resposta à quimioterapia, em vez de um único marcador genético independente.

A diagrama que representa o papel de dois gumes proposta de RFC na quimioterapia do cancro. Aumento da expressão é preditiva de antifolatos de transporte (MTX). Ao mesmo tempo, o aumento da expressão da RFC levará a expansão tamanho da piscina folato forçando uma inibição do feedback negativo sobre a absorção dos antifolatos.

Conclusões e Direções Futuras

O presente estudo foi realizado para investigar alterações na expressão RFC entre as diferentes variantes do carcinoma da bexiga. RFC expressão de ARNm foi demonstrado ser stage- mas dependente do tipo e independente de grau. Embora a diferenciação entre urotelial e carcinomas da bexiga não-uroteliais pode ser feito através de exame microscópico, o nosso objetivo final seria integrar diagnóstico molecular na prática clínica. avaliação prospectiva de um painel de transportadores de folato (como; RFC, BCRP e MRP3), pode prever a resposta aos anti-folato terapia, sugerir novas estratégias terapêuticas e, consequentemente, melhorar o resultado do tratamento para pacientes com câncer de bexiga individuais. As diferenças descritas entre carcinomas uroteliais e não uroteliais da bexiga pode refletir diferentes etiologias e /ou fatores de risco. Um estudo mais amplo projetado para fornecer correlações da extensão do RFC metilação com características clinicopatológicas, tais como idade, sexo, grau histológico, estágio, e progressão poderia fornecer informações adicionais úteis sobre a etiologia dos níveis RFC alterado de expressão entre os diferentes tipos de cancros da bexiga. Outros alvos de metilação do DNA conhecidos na bexiga também pode ser incluído para ver o efeito de maior expressão da RFC e maior transporte de folato na metilação do DNA.

Informações de Apoio

Figura S1.

Avaliação da Qualidade RNA. Electroforese em gel de agarose do total das mini-preparações de ARN. Lanes ‘espécimes são rotulados de acordo com seu número de código atribuído a eles após a coleta. Observando bandas afiadas das rRNA 28S (4,8 kb) e 18S rRNA (1,8 kb) foi a indicação do RNA intacto (T82, T65, T22 e T38). S22 e S38 conter vestígios de ADN genómico, no entanto, os iniciadores e RFC β-actina foram concebidos para abranger junção exão /intrão para minimizar a amplificação de ADN genómico. T118 mostrou degradação parcial, mas as bandas de 28S e 18S foram muito fraco; o rendimento total de ARN T118 foi de apenas 2 ug. T107 mostrou ARN degradado e foi excluído de análises posteriores. De ARN (setas) e marcadores de tamanho de ADN (1031-1080 pb) foram incluídos para comparação. Esta imagem foi fotografada usando o sistema de aquisição de imagem UVIsoft (Tóquio, Japão)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0021820.s001

(TIF)

Figura S2.

fusão análises Curva. Derretendo análise da curva para demonstrar a especificidade dos primers. Painel A: Tintura de fluorescência diminui rapidamente quando o ADN derrete. O ponto de fusão é definida como o ponto de inflexão da curva de fusão, que é mais fácil determinado como o máximo na primeira derivada negativa da curva de fusão. As curvas de dissociação, tanto para o alvo (RFC) e referência (ACTB) genes são mostrados. Cada produto exibe um único pico bem definido, indicando a especificidade dos pares de iniciadores e ausência de dimeros de iniciadores ou os produtos de amplificação não específicos. NTC ou não se registar um valor de Ct Ct ou valores registados no intervalo entre (35-38), que diferem por mais de 5cycles do mais alto valor de Ct gravado pelas amostras (não mostrada). As curvas planas do corante passiva ROX indicam nenhuma cravação (não mostrado). Painel B: electroforese em gel de agarose do produto de PCR convencional, utilizando ADNc transcrito inverso de uma amostra de tumor (T42) e ADNc transcrito de forma inversa do calibrador (disponível comercialmente, ARN de bexiga normal, Clonetech). bandas individuais com os tamanhos corretos para RFC e o gene de referência indicam a especificidade dos produtos a partir de doi:. 10.1371 /journal.pone.0021820.s002

(TIF)

Tabela S1.

As características clínicas dos pacientes com câncer de bexiga.

doi: 10.1371 /journal.pone.0021820.s003

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Reconhecimentos

Nós apreciamos muito o apoio do Prof. Ashraf Zaghloul e Dr. Ahmed Moustafa do Instituto nacional do câncer, no fornecimento de amostras de pacientes de câncer de bexiga. Agradecemos Prof Raid Amin, diretor de Serviços de Consultoria Estatística UWF, por sua ajuda com a análise estatística dos resultados. Prof. Stephen Bustin e Prof. Sanaa Eissa contribuiu através de muitas discussões frutíferas e elaborou sobre muitos aspectos do RT-qPCR. Estamos também gratos a Shady Saad e Deena Amr por sua ajuda com o estabelecimento de metodologias e desenho experimental do estudo.