Abstract

Fundo

Estudos anteriores demonstraram que microRNAs estão desregulados na tireóide câncer e desempenham um papel importante na regulação pós-transcricional de oncogenes-alvo e /ou genes supressores de tumor.

Metodologia /Principais achados

Nós estudamos a função de miR-126-3p no cancro da tiróide células, e como um marcador de a agressividade da doença. Descobrimos que a expressão de miR-126-3p foi significativamente menor nos tumores maiores, em amostras de tumores com invasão extratireoidiana, e em maior cancro da tiróide grupo de risco em 496 amostras de câncer de tireóide papilar a partir do estudo de coorte Cancer Genome Atlas. Num conjunto de amostras independentes, menor expressão de miR-126-3p foi observada em cancros da tiróide folicular (que têm capsular e angioinvasion), em comparação com os adenomas foliculares. a proliferação de células do cancro de tiróide mecanicamente, a sobre-expressão ectópica de miR-126-3p significativamente inibido,

in vitro

(p 0,01) e

in vivo

(p 0,01), a formação de colónias (p 0,01), formação de esferóides do tumor (p 0,05), a migração celular (p 0,05), o VEGF e a secreção de formação do tubo endotelial, e metástase pulmonar

in vivo

. Encontramos 14 previu genes-alvo, que foram significativamente alterados após a transfecção miR-126-3p em células de câncer de tireóide, e que estão envolvidos na biologia do câncer. Desses 14 genes,

SLC7A5

e

ADAM9

foram confirmados para ser inibida por sobre-expressão de miR-126-3p e ser alvos diretos de miR-136-3p.

conclusões /Significado

para nosso conhecimento, este é o primeiro estudo a demonstrar que miR-126-3p tem uma função tumor-supressora em células de câncer de tireóide, e está associada com fenótipo doença agressiva.

Citação: Xiong Y, Kotian S, Zeiger MA, Zhang L, Kebebew e (2015) miR-126-3p inibe o crescimento celular do cancro de tiróide e metástase, e está associada com o cancro de tiróide agressivo. PLoS ONE 10 (8): e0130496. doi: 10.1371 /journal.pone.0130496

editor: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, CHINA

Recebido: 20 Março, 2015; Aceito: 19 de maio de 2015; Publicação: 05 de agosto de 2015

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho está disponível sob a licença Creative Commons CC0 domínio público dedicação

Data Availability:. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento: Esta pesquisa foi apoiada pela intramural programa de pesquisa do Centro de pesquisa do Câncer, National Cancer Institute, National Institutes of Health. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Os autores não têm conflitos de interesses de divulgar

Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O câncer de tireóide é o câncer mais comum do sistema endócrino. e um dos que crescem mais rapidamente diagnósticos de cancro nos Estados Unidos [1,2]. cancros da tiróide se originam de células parafoliculares (medular) e células foliculares (não-medular), que respondem por mais de 95% de todos os casos de câncer de tireóide e são classificados em quatro grandes grupos histológicos: carcinoma folicular (FTC), câncer de tireóide papilar (PTC ), o câncer anaplásico da tireóide (ATC), e carcinoma Hürthle celular (HCC).

Os microRNAs (miRNAs) são pequenos, não codificante RNAs que são cerca de 21 nucleótidos de comprimento e regulam a expressão gênica [3,4]. miARNs desempenhar um papel significativo na tumorigénese e mostrar a especificidade do tecido notável, e miARNs também foram encontrados para ser bons biomarcadores de cancro [5]. Estudos anteriores têm mostrado que vários miARNs estão desreguladas em cancros da tiróide originários a partir de células foliculares [6-8]. No nosso estudo anterior, verificou-se que a expressão de miR-126-3p foi regulada negativamente em amostras de tumores malignos da tiróide, em comparação com amostras de tumores benignos da tiróide [9,10]. Subregulado expressão de miR-126-3p foi observada em FTC e HCC, que só são histologicamente distinguível de folicular ou adenomas celulares Hürthle quando capsular invasão e /ou angioinvasion estão presentes. O papel de miR-126-3p no cancro da tiróide não foi estudado anteriormente, mas a análise de expressão em amostras de cancro da tiróide sugere que a perda de miR-126-3p pode estar associada com a progressão do cancro da tiróide, e que ele pode funcionar como um supressor de tumor.

Neste estudo, testou-se a hipótese de que o miR-126-3p é um supressor tumoral e está associada com o fenótipo da doença. Nós determinamos a função de miR-126-3p em células de cancro da tiróide, usando tanto

in vitro

e

In vivo

modelos. Descobrimos que a sobre-expressão de miR-proliferação 126-3p significativamente inibido de células de câncer de tireóide, a formação de colónias, formação esferóide tumor, a migração, a secreção de VEGF e formação do tubo HUVEC, e metástases pulmonares

in vivo

. Além disso, descobrimos que o miR-126-3p regula a expressão de muitos genes relacionados com o cancro, incluindo aqueles que codificam soluto transportadora família 7 membros 5 (

SLC7A5

) e uma proteína contendo o domínio desintegrina e metaloproteinase 9 (

ADAM9

), e que ele atinge diretamente esses genes. Por último, a expressão de miR-126-3p foi encontrado para ser associado com a agressividade da doença.

Métodos

O Comitê do Instituto Nacional do Câncer animal Cuidado e Uso, Institutos Nacionais de Saúde aprovou o estudo de animais protocolo. Quando os ratos chegaram a eutanásia critérios humanos, os murganhos foram fotografadas, e sacrificados por inalação de CO2. O estudo foi aprovado pelo Escritório de Proteção humano de investigação e informação do paciente foi coletado prospectivamente ao abrigo de um protocolo aprovado-board revisão institucional no National Institutes of Health Clinical Center (Bethesda, Maryland), após a obtenção do consentimento informado por escrito.

amostras de tumores da tiróide humana, linhas de células e condições de cultura

o tecido da tiróide humana foi obtido no momento da remoção do tumor, congelado e armazenado a -80 ° C imediatamente. secções de tecido em série foram utilizadas para extracção de ARN e coradas com hematoxilina e eosina para confirmar o diagnóstico e que o conteúdo da célula de tumor foi de 80% ou superior. O estudo foi aprovado pelo Escritório de Proteção humano de investigação e informação do paciente foi coletado prospectivamente ao abrigo de um protocolo aprovado-board revisão institucional dos Institutos Nacionais de Saúde, após a obtenção do consentimento informado por escrito.

linhas celulares de cancro da tiróide humana XTC- 1 (HCC), FTC-133 (FTC), e TPC-1 (PTC) foram mantidas em DMEM com 4500 mg /L de D-glucose e L-glutamina, e 110 mg /L de piruvato de sódio, suplementado com 10% soro fetal de bovino (FBS),-hormona estimuladora da tiróide (10 mU /mL), penicilina (10000 U /ml), estreptomicina (10.000 U /mL), Fungizona (250 mg /mL) e insulina (10 ug /ml) numa incubadora humidificada padrão, a 37 ° C em 5% de CO

% O 2 e 95

2 atmosfera. células de FTC-133-Luc2 foram gerados por transfecção de células de FTC-133 com um vector que expressa luciferase, e as células foram cultivadas no mesmo meio com G418 na concentração de 200 ug /mL [11]. As linhas celulares foram autenticados usando short em tandem repeat profiling

miRNA transfecção

A miRNA imitar para hsa-miR-126-3p (miRNA imitar, Assay ID:. MC12841; Applied Biosystems, Foster City , CA) foi transfectado para células a uma concentração de 25 nM utilizando Lipofectamina RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA), seguindo o protocolo do fabricante. Um oligonucleótido não representa qualquer conhecido miARN (miARN Mimic Controlo Negativo # 1; Applied Biosystems). Foi utilizado como um controlo negativo

Isolamento de ARN e quantitativo em tempo real de RT-PCR

O ARN total foi isolado a partir das linhas celulares e amostras de tecido, utilizando o reagente TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA). A TaqMan MicroRNA Ensaio (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) foi utilizado para medir o nível de expressão de miR-126-3p (HSA-miR-126-3p, Ensaio ID: 002228). O ARN total foi transcrito de forma inversa com um iniciador específico do miARN, seguido por PCR em tempo real utilizando sondas TaqMan. U6 foi usado como um controle endógeno. As quantidades relativas de

ADAM9

e

SLC7A5

mRNAs foram determinadas usando o TaqMan Assay (Applied Biosystems) em um sistema HT ABI 7900; humana

GAPDH

foi usado como um controle endógeno. O método ΔΔ Ct foi usado para calcular os níveis de expressão.

Western blot

lisado de células inteiras foi preparado com tampão RIPA (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) e foi utilizado para a detecção de proteína ADAM9 por transferência de Western utilizando um anticorpo policlonal de coelho anti-ADAM9 anticorpo (diluição 1: 1000; Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA) e para a detecção de proteína SLC7A5 por transferência de Western utilizando um anticorpo policlonal de coelho anti-SLC7A5 (diluição 1: 500; Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA). proteína GAPDH, um controlo, foi detectado usando um (# 0411) de anticorpo anti-GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). monoclonal de ratinho

Ensaio de Proliferação

A proliferação celular foi determinada usando o Ensaio de Proliferação celular CyQUANT (Invitrogen), de acordo com o protocolo do fabricante. A intensidade de fluorescência foi medida utilizando um leitor de fluorescência de microplacas (Molecular Devices, Sunnyvale, CA), com excitação a 485 nm de detecção e emissão a 538 nm.

ensaio de migração

migração celular foi medida usando uma secção BD (Catálogo # 354578, BD Biosciences, Bedford, MA), de acordo com as instruções do fabricante. meio de cultura celular com 10% de FBS foi utilizado como um quimioatractivo na parte inferior do poço de câmara de Boyden. células de cancro da tiróide foram semeadas no compartimento superior da câmara em meio isento de soro (4 × 10

4 células por poço). Após incubação a 37 ° C em 5% de CO

2 durante 22 horas, as células não-migração foram removidos a partir da superfície superior, e as células que migraram através da membrana para a superfície inferior foram corados com Diff-Quik manchar Set (Siemens Healthcare Diagnostics, Inc., Newark, DE). As imagens foram tiradas a partir da membrana de cada inserção sob um microscópio (ampliação de 50 x), utilizando uma câmara digital. As imagens foram visualizadas no ecrã do computador e as células em cinco campos de cada inserto foram contadas.

cultura esferoidal

Dois dias após miARN transfecção, as células foram tripsinizadas, contadas, ressuspensas em meio de cultura , e plaqueadas numa placa Ultra Baixa Cluster (Costar, Corning, NY) a 3,5 × 10

4 células por poço. As placas foram cultivadas a 37 ° C em 5% de CO

2, e o meio foi mudado a cada 2 a 3 dias. Após 2 semanas de cultura, as células foram coradas com violeta de cristal e fotografadas sob um microscópio. A área total ocupada por esferóides dentro de uma imagem foi medida por circunscrever o perímetro de cada esferóide, marcando toda a área, e calcular os números de pixel usando software ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, EUA).

ensaio de agar mole para formação de colónias

Três dias após a transfecção miARN, células FTC-133 foram tratadas com tripsina, contadas, e ressuspensas em meio de cultura. Duas camadas ensaios de agar mole foram realizados em placas de seis poços. A camada de fundo de agar (2 mL /poço) continham% de agar 0,6 (Difco ágar nobre; BD Diagnostics, Sparks, MD) em F 12-forma de Ham, suplementado com 10% de FBS, penicilina (100 U /mL), estreptomicina ( 10.000 U /ml) e Fungizona (250 ng /mL). Trinta mil células foram misturadas com 1 ml de solução de agar superior (0,35% de agar em meio de cultura). Depois de 30 minutos, 1 mL de meio de cultura foi adicionado a cada poço. As placas foram cultivadas a 37 ° C em 5% de CO

2, e o meio foi mudado duas vezes por semana. Depois de duas semanas de cultura, as colónias de células foram coradas com violeta de cristal e examinada sob um microscópio. contagem de colônias foi realizado em três campos diferentes.

estudos Tumor de xenotransplante

células FTC-133 contendo o gene repórter luciferase

luc2

foram transfectadas com miR-126-3p ou miR- NC e inoculadas por via subcutânea (10

6 células viáveis) nos flancos esquerdo e direito de ratinhos nus atimicos. Os tumores foram medidos com compassos em diferentes pontos de tempo, e os volumes foram calculados como comprimento x largura x altura. amostras de tumor de autópsia foram fotografadas para documentar a morfologia grosseira, e, em seguida, as amostras foram pesadas. FTC-133-

luc2

células (7,5 x 10

5) transfectadas com o miR-126-3p e miR-NC foram injectadas em ratinhos nus atímicos através da veia da cauda, ​​e os ratinhos foram fotografadas usando semanal um sistema Xenogen IVIS 100.

cicatrização de feridas ensaio

migração de células de câncer de tireóide foi avaliada usando uma ferida zero ensaio [12] em que 150.000 células foram transfectadas com miRNAs, banhado na cura de seis poços placas, e deixadas a aderir e crescer durante 44 horas (miARNs). Em seguida, três feridas verticais foram feitas com uma ponta de pipeta estéril de 10-mL, e em seguida uma linha horizontal foi feito através das três linhas de modo que as células puderam ser observadas no mesmo ponto. As células foram inspecionados a cada 12 horas e largura medidas tomadas até 24 horas.

VEGF ELISA

O sobrenadante da cultura de mídia foi recolhido 72 horas após a transfecção de células de câncer de tiróide com miR-NC ou miR- 126-3p. os níveis de VEGF foram medidos utilizando o kit de ELISA de VEGF humano Quantikine (R D Systems, Minneapolis, MN). os níveis de VEGF foram normalizadas para os níveis totais de proteína, utilizando o kit de ensaio de proteína BCA Pierce (Pierce Biotechnology, Rockford, IL).

A imuno-histoquímica

secções embebidas em parafina de tecido pulmonar de ratos injectados com FTC-133- células Luc2 transfectadas com miR-NC ou miR-126-3p foram de-parafinado e reidratadas. As secções foram então tratadas com anti-VEGF (ab46154, Abcam, Cambridge, MA). As lâminas foram digitalizados usando um ScanScope XT scanner de slides digitais, e analisados ​​utilizando software ImageScope (Aperio Technologies, Inc., Vista, CA).

formação do tubo endotelial ensaio

As células transfectadas com miR-NC e miR-126-3p foram plaqueadas a uma densidade de 3000-4000 células em uma placa de 96 poços, 48 ​​horas após a transfecção. As células foram deixadas a ligar durante a noite, e a matriz Matrigel porão (BD Biosciences) foi colocado sobre as células. células HUVEC (Lonza, Walkersville, MD) foram então adicionado no topo da camada de matrigel a uma densidade de 60.000 células por poço. Observou-se a formação de tubos endoteliais e fotografados ao longo do tempo.

matriz de expressão de ARNm de Genome-wide

células TPC-1 e FTC-133 foram transfectadas com o miR-126-3p e miR-NC . Três dias após a transfecção, as células foram colhidas e o RNA total foi extraído a partir de células usando o reagente TRIzol (Invitrogen, EUA). Cento cinquenta nanogramas de RNA total foram usadas para executar cDNA transcrição reversa, a síntese, a amplificação, fragmentação e rotulagem terminal usando GeneChip WT Sense alvo Labeling e reagentes de controlo (Affymetrix, Santa Clara, CA). Aproximadamente 25 ng /mL de cDNA foi hibridado com um gene humano Affymetrix GeneChip 1,0 ST matriz. As matrizes foram lavadas e coradas utilizando o protocolo fluídica FS450_0007 procedimento em uma estação Fluidics Affymetrix 450. As intensidades de sonda foram digitalizados com o Scanner GeneChip 3000. Os dados brutos foram normalizados e analisados ​​utilizando software Partek Genomic Suite (Partek, Inc., St. Louis, MO). A análise de variação foi utilizada para determinar os conjuntos de sondas que eram significativamente diferentes entre os dois grupos. A lista gene foi filtrada com um corte de dobra de troca de 1,3 e ajustado p 0,05. O sistema Ingenuity Pathway Analysis (IPA) (Ingenuity Systems, Redwood City, CA) foi utilizado para análise via

previsões alvo de miRNA-126-3p

TargetScan 5.1 (http: //. TargetScan .org /) foi utilizada para identificar potenciais genes alvo direto de miR-126-3p.

repórter luciferase ensaio

O par 1.573-base de 3′-UTR do ser humano

ADAM9

foi clonado num vector repórter de luciferase vazio, pEZX-MT01 (GeneCopoeia, Rockville, MD), gerando um tipo selvagem

ADAM9

3′-UTR construção repórter de luciferase (pEZX-ADAM9-3’UTR) . O par 2.947-base de 3′-UTR do ser humano

SLC7A5

também foi clonado pEZX-MT01, gerando um tipo selvagem

SLC7A5

3′-UTR construção repórter luciferase (pEZX-SLC7A5- 3’UTR). Para o ensaio da luciferase dupla, células FTC-133 foram plaqueadas em triplicado em placas de 24 poços e co-transfectadas com 0,25 ug da construção repórter e 15 pmol de miR-126-3p ou miR-NC usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) . Às 24 horas, as células foram lisadas e ensaiadas para ambos pirilampo e

Renilla

actividade da luciferase utilizando o Kit de Ensaio de Luciferase miR (GeneCopoeia) num leitor de microplacas SpectraMax M5E (Molecular Devices, Sunnyvale, CA), de acordo com o as instruções dos fabricantes.

a análise dos dados

cancer Genome Atlas do Instituto Nacional do câncer (TCGA) conjunto de dados de câncer de tireóide foi utilizado para determinar uma associação entre miR-126-3p expressão e doença agressividade (dados portal, https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/). valores de intensidade normalizada (log 10) para a expressão de miR-126-3p foram obtidos a partir de 454 amostras de câncer de tireóide papilar. Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média. Para determinar a significância estatística, foram utilizados numa análise de variância e do teste t, quando apropriado. Um valor p inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

expressão de miR-126-3p em carcinoma da tiróide está associada com fenótipo da doença agressiva e tumores com capsular e angioinvasion

O hotel tinha anteriormente identificado miR-126-3p a ser reprimidos em cancros da tiróide de origem das células foliculares e em tipos de tumores que eram difíceis de diagnosticar por exame de biópsia do tumor como a invasão capsular e angioinvasion não pode ser determinar por citologia. Assim, estávamos interessados ​​em determinar se a expressão de miR-126-3p foi associada com a agressividade da doença e, especificamente nos tumores com invasão capsular e angioinvasion. Para investigar isso, foi utilizado o conjunto de dados TCGA para o câncer de tireóide papilar. Descobrimos que a expressão de miR-126-3p foi menor nos tumores primários maiores (Figura 1A), em amostras de tumor com invasão extratireoidiana (Fig 1B), e em alto risco de cancro da tiróide grupo (Fig 1C). Dada a associação de miR-126-3p com câncer de tireóide papilar mais agressivo, o próximo perguntou se a expressão de miR-126-3p foi menor nos tumores localizados com invasão capsular e angioinvasion usando amostras de cancro da tiróide folicular e adenomas para o qual a malignidade é apenas por estabelecida a presença destas duas características de cancro. Encontramos miR-126-3p foi significativamente menor no cancro da tiróide folicular localizada em comparação com adenomas foliculares (Fig 1D). Estes achados em conjunto sugerem que miR-126-3p pode ter um papel importante na iniciação e ou progressão do cancro da tiróide.

(A) miR-126-3p é significativamente menor em maior câncer papilar de tireóide (T3 comparado com T2 e T1). Os dados para as amostras TCGA com dados de tamanho de tumor disponíveis. T1 tumores menos de 2 cm e não crescer fora da tireóide, tumores T2 2 centímetros, mas 4 centímetros e não crescer fora da tireóide, tumores T3 medição 4 centímetros ou em crescimento fora da tireóide. ** Indica P 0,01, *** indica P 0,001. eixo Y é log

10 expressão normalizada. (B) a expressão de miR-126-3p é significativamente menor no câncer de tireóide papilar com invasão extratireoidiana mínimo e moderada. ** Indica P 0,01, *** indica P 0,001. eixo Y é log

10 expressão normalizada. expressão (C) miR-126-3p é significativamente menor em macis câncer de tireóide papilar alto e médio risco, em comparação com tumores de baixo risco macis. Macis é um sistema de pontuação usado prognóstico na base de dados TCGA que se baseia na presença de metástases, a idade do paciente, Abrangência da ressecção, invasão local e tamanho do tumor. ** Indica P 0,01, *** indica P 0,001. eixo Y é log

10 expressão normalizada. expressão (D) miR-126-3p é significativamente menor no cancro da tiróide folicular de adenoma folicular. Tudo caso carcinoma folicular apresentaram evidência histológica de capsular ea invasão vascular e os adenomas não têm qualquer evidência de capsular ea invasão vascular. ** Indica P 0,01. eixo Y é 2 ^ -. (ΔΔCt)

miR-126-3p regula a proliferação da tiróide célula cancerosa, colônia e formação esferóide e migração celular

Dada a associação entre miR- expressão 126-3p e cancro da tiróide fenótipo da doença agressiva, queríamos determinar se a função de miR-126-3p em carcinoma da tiróide poderia mecanicamente explicar esta associação. Nós overexpressed miR-126-3p em três linhas de células de cancro da tiróide bem caracterizados e autenticados (TPC-1, FTC-133 e XTC-1) usando o miR-NC como um controlo negativo para determinar o seu efeito sobre a proliferação celular. miR-126-3p superexpressão proliferação celular significativamente inibida em TPC-1 e FTC-133 células em 120 horas, por 52% (p 0,001) e 37% (p 0,001), respectivamente; no entanto, inibiu a proliferação apenas por 16% em células XTC-1 a 168 horas (p 0,001) (Fig 2A, 2B e 2C). Um ensaio de formação de colónia em agar mole foi realizado para avaliar o crescimento independente de ancoragem em FTC-133, que é uma linha celular de cancro da tiróide de formação de colónias. Encontramos um número significativamente menor de colônias em linhas celulares FTC-133 superexpressam miR-126-3p (Fig 2D). Nós também estudou o efeito de miR-126-3p na formação esferóide tumor de células de câncer de tireóide. As linhas celulares FTC-133 e XTC-1 formar esferóides quando cultivadas em ultra-baixas frascos de cultura aderentes, e após transfecção com miR-126-3p, o número eo tamanho dos esferóides foram significativamente menores (Fig 2E).

(A-C) proliferação de linha celular de cancro de tiróide com superexpressão de miR-126-3p. O eixo Y representa o número de células. As barras de erro representam o erro padrão da média (SEM). (* Indica P 0,05; ** indica p 0,01; *** indica P 0,001). superexpressão (D) miR-126-3p inibe a formação de colónias em células de cancro da tiróide. número de colónias em linhas celulares FTC-133. O eixo Y representa o número de colónias por campo. As barras de erro representam SEM (*** indica P 0,001). superexpressão (E) miR-126-3p diminui o tamanho e número de esferóides. Painel superior: imagem representativa de esferóides em cultura com miR-126-3p superexpressão (células FTC-133). painel inferior: Quantificação de diferenças esferóides entre XTC-1 e células FTC-133 com sobre-expressão de miR-126-3p. A área total ocupada pelas esferóides dentro de uma imagem foi medida por que circunscreve o perímetro de cada esferóide, marcação toda a área, e calculando o número de pixels com o software ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, EUA). O eixo Y representa o tamanho e número dos esferóides. As barras de erro representam SEM (* indica p 0,05).

A seguir, determinou o efeito de miR-126-3p na migração celular utilizando o ensaio de cicatrização de feridas zero. Verificou-se que a sobre-expressão de miR 126-3p-fechamento da ferida significativamente inibida em células TPC-1 (p 0,001), as células de FTC-133 (p 0,001), e células XTC-1 (p 0,01) (Fig 3A). Para confirmar os nossos resultados, foi também utilizado um ensaio de câmara de Boyden para estudar o efeito de miR-126-3p sobre a migração celular. Verificou-se que a sobre-expressão de miR-126-3p também inibiram a migração de células de forma significativa (Figura 3B).

Wound ensaio (A) e ensaio de câmara de Boyden (B) dados de cura. superexpressão de miR-126-3p diminuiu significativamente fechamento da ferida largura às 24 horas em todas as linhas celulares de cancro da tiróide estudados. O eixo Y representa a distância ferida. As barras de erro representam SEM (** indica p 0,01; *** indica P 0,001). a sobre-expressão de miR-126-3p diminuiu significativamente o número de células migradas em todas as células de cancro da tiróide no ensaio de câmara de Boyden. O eixo Y representa o número de células que migraram por campo. As barras de erro representam SEM (* indica p 0,05; ** indica p 0,01; *** indica p 0,001).

miR-126-3p regula o crescimento de tumores da tiróide e metástase

in vivo

Dada a nossa

in vitro

dados, queríamos avaliar o efeito de miR-126-3p no crescimento do tumor

in vivo

e determinar se transitoriamente níveis elevados de miR-126-3p poderia ter, um efeito fenotípico sustentada a longo prazo. Descobrimos que xenoenxertos de tumor derivado de FTC-133-

luc2

células transfectadas com miR-126-3p foram significativamente menor e pesava menos de xenoenxertos de tumor do grupo de miR-NC (p 0,01) (Fig 4A) . Porque um dos efeitos mais dramáticos da superexpressão de miR-126-3p

in vitro

foi sobre a migração celular, nós próxima determinado se metástase regulamentado miR-126-3p

in vivo

. Para determinar se a sobre-expressão de miR-126-3p poderia inibir metástase de tumor

in vivo

, FTC-133-

luc2

células transfectadas com miR-126-3p e miR-NC foram injetados atímicos ratinhos nude via a veia da cauda, ​​e os ratinhos foram obtidas imagens de todas as semanas. Verificou-se que a sobre-expressão de metástases do pulmão de miR-126-3p dramaticamente suprimida neste modelo (Fig 4B).

(a) O crescimento de xenoenxertos de tumores em ratinhos nus. Painel esquerdo: imagens representativas de tamanho ratos xenotransplante na autópsia. painel central e direita: atividade luciferase tumor e medição do volume do tumor e peso. células de FTC-133-Luc2 transfectadas com miR-126-3p e miR-NC foram inoculados subcutaneamente nos flancos de ratinhos nus atimicos. (B) a metástase do tumor. Painel esquerdo: Imagens representativas de ratos com metástases mostrando sinal de luminescência. painel médio: Quantificação de diferenças de intensidade de sinal de luminescência entre miR-126-3p e miR-NC. células de FTC-133-Luc2 transfectadas com miR-126-3p e miR-NC foram injectadas em ratinhos nus atímicos através da veia da cauda, ​​e os ratinhos foram fotografadas com um sistema Xenogen IVIS 100. O sinal de luminescência relativa de cada rato é calculado como a relação de sinal original com o sinal de tomada 14 dias pós-injecção. As imagens apresentadas aqui foram tomadas após 7 semanas veia injecção de células tumorais. As barras de erro representam SEM (* indica P 0,05; ** indica p 0,01; *** indica P 0,001). Todas as experiências com animais foram repetidos duas vezes. seção E-manchado de tumor de pulmão metastático induzida pela FTC; Uma imagem microscópica representante (hematoxilina e eosina [H E] coloração) de tumor de pulmão metastático induzida por células FTC-133-Luc2 transfectadas com miR-NC e um H 0,01), mas não com a expressão de ARNm ADAM9 (Figura 5E).

(a) Imunotransferência de SLC7A5 e GAPDH em TPC-1 e linhas de células XTC-1, que foram transfectadas, quer com o miR-126-3p ou para miR-NC 72 horas. A linha de células FTC-133 não tinha a expressão da proteína detectável para SLC7A5. (B) imuno para ADAM9 e GAPDH em TPC-1, as linhas celulares XTC-1 FTC-133 e, que foram transfectadas com miR-126-3p ou miR-NC por 72 horas

in vitro

. (C) para a detecção imuno ADAM9 e GAPDH em xenoenxertos tumorais FTC-133-Luc2 que tinham sido inoculados subcutaneamente nos flancos de ratinhos nus atímicos e deixada desenvolver durante 10 dias. A actividade da luciferase (D) de pEZX-SLC7A5-3’UTR e pEZX-SLC7A5-3’UTR em células de FTC-133 quando co-transfectado com o miR-126-3p ou miR-NC. Todas as medições de luciferase foram feitas em triplicado e as leituras foram realizadas 24 horas após a transfecção. As barras de erro representam SEM (*** indica P 0,001). (E) O nível de miR-126-3p expressão é significativamente inversamente associado com o nível de expressão

SLC7A5

em 481 amostras de câncer de tireóide papilar do conjunto de dados TCGA. *** Indica p . 0.001

miR-126-3p reduz a secreção de VEGF e formação do tubo endotelial

Uma vez que encontramos a expressão de miR-126-3p é menor em folicular localizada cancro de tiróide com capsular ea invasão vascular, e miR-126-3p foi relatado para regular a angiogénese e alvo

VEGF

, nós próxima determinado se miR-126-3p regula a angiogénese em células de cancro da tiróide [17-20] . Descobrimos que a sobre-expressão de miR-126-3p diminuiu significativamente a secreção de VEGF em duas das três células de câncer de tireóide

in vitro

(Fig 6A). Um dos principais factores determinantes para o crescimento do tumor bem sucedida é a capacidade de recrutamento de novos vasos sanguíneos. Assim, analisamos o nível de expressão da proteína VEGF nos tumores metastáticos do pulmão do

In vivo

estudos e formação do tubo endotelial utilizando o ensaio HUVEC

in vitro

.