Abstract

Vários estudos epidemiológicos têm relacionado o uso de drogas anti-inflamatórias não-esteróides (AINEs) com o risco reduzido de câncer de ovário, o câncer ginecológico mais letal, diagnosticada geralmente em fases tardias da doença. Foi anteriormente demonstrado que a pró-apoptótica diferenciação de citocinas associado a melanoma gene-7 /Interleucina-24 (

MDA

-7 /IL-24) é um mediador importante da apoptose induzida por NSAID na próstata, mama, renal e as células de câncer de estômago. Neste relatório nós avaliamos vários NSAIDs estruturalmente diferentes para as suas eficácias para induzir a apoptose e

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-7 /expressão de IL-24 em células de cancro do ovário. Enquanto vários NSAIDs apoptose induzida, sulindac sulfureto e Diclofenac mais potente apoptose induzida e reduziu o crescimento do tumor. Uma combinação destes agentes resulta num efeito sinérgico. Além disso,

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IL-24 indução -7 /por NSAIDs é essencial para a morte celular programada, uma vez que a inibição da

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-7 /IL-24 pelo pequeno RNA de interferência anula apoptose.

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-7 /IL-24 ativação leva a regulação positiva de parada do crescimento e dano ao DNA inducible (GADD) 45 α e γ e ativação de JNK. A família NF-kB dos factores de transcrição tem sido implicado no desenvolvimento do cancro do ovário. Nós previamente estabelecido de sinalização de NF-kB /IkB como um passo essencial para a sobrevivência celular em células cancerosas e a hipótese de que a segmentação de NF-kB podia potenciar a indução de apoptose mediada por NSAID em células de cancro do ovário. De facto, a combinação AINE tratamento com inibidores do NF-kB levou à indução de apoptose aumentada. Os nossos resultados indicam que a inibição do NF-kB em combinação com a activação de

MDA

-7 /IL-24 de expressão pode levar a uma nova terapia combinatória para o cancro do ovário

citação:. Zerbini LF, Tamura RE, Correa RG, Czibere A, Cordeiro J, Bhasin M, et al. (2011) Combinatória efeito da não-esteróides anti-inflamatórias e NF-kB inibidores na terapia do cancro do ovário. PLoS ONE 6 (9): e24285. doi: 10.1371 /journal.pone.0024285

editor: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., Estados Unidos da América

Recebido: 12 de abril de 2011; Aceito: 05 de agosto de 2011; Publicação: 12 de setembro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Zerbini et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. RET é um destinatário do ICGEB pós-doutoramento comunhão. Esta pesquisa foi apoiada pelo Instituto Nacional de Saúde concede 1R01 CA85467, CA090381 P50, CA105009 P50 e da Fundação Hershey (TAL), NIH bolsas 1R01 CA097318, 1R01 CA127641, CA104177 P01, o Cancer Research Foundation Samuel Waxman (PBF) eo Departamento de Defesa subvenções PC051217 e OC0060439 (LFZ). DS é um Scholar Harrison em Cancer Research e um erudito Blick na VCU Massey Cancer Center e da Escola de Medicina da VCU. PBF é titular da cadeira Thelma Newmeyer Corman em Cancer Research na VCU Massey Cancer Center e é um investigador SWCRF. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de ovário representa o câncer ginecológico mais letal ea 5

th principal causa de mulheres morte relacionada ao câncer nos Estados Unidos [1]. O diagnóstico tardio é um dos principais obstáculos para o tratamento de câncer de ovário, como quase 70% das mulheres apresentam-se com um estágio avançado da doença no momento do diagnóstico [2]. Vários estudos epidemiológicos sugeriram que o uso de NSAIDs em concentrações clinicamente relevantes reduz colorrectal [3], da mama [4] e os riscos de cancro do ovário [5], [6], [7], embora controvérsia ainda permanece [8], [9 ]. Um dos principais alvos da acção NSAID é a inibição da ciclo-oxigenase (COX), que são responsáveis ​​pela conversão de ácidos araquidónico em prostaglandinas e empregar uma variedade de diferentes mecanismos. Os dois genes da COX, COX-1 e COX-2, são praticamente idênticos; No entanto, uma diferença significativa é que a COX-1 a expressão é constitutiva, enquanto que a COX-2 de expressão é induzida por factores de crescimento e estímulos pró-inflamatórios [10]. AINEs são normalmente classificados como inibidores COX-2 específicos ou inibidores de COX não-específicos. No cancro do ovário de COX-1, mas não COX-2, foi encontrada a ser sobre-expressa [11], [12], todavia, outros estudos relataram que a COX-2, também é regulada positivamente [13], [14]. elevada expressão de COX-1 em cancro do ovário se correlaciona fortemente com níveis elevados de Factor de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF) [15], [16], [17] e os AINEs inibem a produção de VEGF em linhas celulares de cancro do ovário [12], [18], que indica que a COX-1 pode regular a expressão de VEGF. A angiogénese e a expressão de VEGF estão implicados na formação de ascite [19] e de metástases do cancro do ovário [20], enquanto que a sua inibição previne a formação de ascite e inibe o crescimento do cancro disseminado [21].

O nosso estudo anterior demonstra que os AINE também induzir apoptose das células cancerosas através da indução de

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-7 expressão /IL-24 [22], levando a expressão aumentada de dois membros da parada do crescimento e DNA-Dano 45 (GADD45) da família [23]. A família do gene GADD45 codifica três proteínas estruturalmente relacionadas altamente arrest- crescimento e dano do ADN-induzível, GADD45 α, β e γ desempenhar um papel na fase G2 /M do ponto de verificação em resposta a danos no ADN [24]. Sob condições fisiológicas normais,

MDA

-7 /IL-24 é expresso em células do sistema imunitário e os melanócitos normais [25]. Altos níveis de

MDA

-7 /IL-24 foi demonstrada para induzir especificamente a apoptose das células cancerosas e, por conseguinte,

MDA

-7 /IL-24 tem sido referida como uma “bala mágica” [26], [27]. Além disso, vários estudos indicaram que a sobre-expressão de

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-7 /IL-24 por um recombinante resultados de adenovírus em apoptose de células cancerígenas e benefícios terapêuticos no câncer de ovário [28], [29].

sinalização de NF-kB /IkB é uma outra via que tem sido implicado na resistência à droga e sobrevivência no cancro do ovário [30], [31]. A via NF-kB /IkB está emergindo como jogador-chave na tumorigênese, invasão e metástase para vários tipos de câncer [30], [31] e é um passo crítico para células cancerosas para escapar da morte celular programada [32]. Além disso, a resistência das células cancerosas a agentes quimioterapêuticos, tem sido associada com a activação de NF-kB desregulada [33]. Além disso, temos mostrado que a inibição da constitutivamente activa NF-kB por expressão adenoviral de IkB induz a apoptose em células de cancro da próstata e inibe a formação de tumores em ratinhos SCID [34].

Neste relatório, nós comparamos um amplo conjunto de AINEs para as suas eficácias de induzir apoptose de células de cancro do ovário. Como nosso estudo anterior demonstrou um papel para

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-7 /IL-24 na morte celular mediada por NSAID, também avaliamos se a indução de apoptose por NSAIDs é devido à indução da

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-7 expressão /IL-24. entrega viral

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-7 /IL-24 é usado atualmente em ensaios clínicos para vários tipos de câncer [27]. Identificação de medicamentos que são mais eficientes no

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IL-24 indução -7 /pode fornecer uma alternativa para a entrega viral para explorar os efeitos anti-neoplásicos de

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-7 /IL-24 . Nós também a hipótese de que a combinação de AINEs com inibidores da via NF-kB pode potenciar os efeitos dos AINEs, contra o cancro do ovário. Nós, portanto, testados inibidores farmacológicos da via de NF-kB para a sua capacidade para induzir apoptose em células de cancro do ovário. Aqui, demonstramos que sulindaco sulfeto e Diclofenac são os AINEs mais potentes que induzem a apoptose de cancro do ovário através de

mda

-7 /IL-24 expressão e também reduzir o crescimento do tumor

in vivo

.

mda

-7 /IL-24 expressão leva a GADD45α e regulação positiva γ e ativação de JNK quinase. Vários inibidores farmacológicos NF-kB também induzir a apoptose de células de cancro do ovário e em combinação com AINEs potenciar o efeito apoptótica de NSAIDs.

Resultados

AINEs são indutores potentes do

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-7 /IL-24 e apoptose em células de cancro do ovário

Um amplo painel de AINEs foi testado por suas habilidades para induzir apoptose e

MDA

7 /IL-24 de expressão de genes em cada quatro ovário linhas celulares de cancro, SKOV-3, Caov-3, SW626 e 36m2. As concentrações para todos os AINEs drogas utilizadas neste estudo foram seleccionadas para ser comparáveis ​​às concentrações no plasma alcançáveis ​​fisiológicos [35] – [49]. A apoptose foi medida 24 horas após o tratamento de células SKOV-3, Caov-3, células de cancro do ovário e SW626 36m2 com este conjunto de AINEs, revelando que uma variedade de, mas nem todos os AINEs induziu apoptose (Figura 1A e S1a). Consistentemente fortes indutores de apoptose em todas as linhas celulares de quatro incluídos sulindac sulfureto, Diclofenac, Naproxeno Ebselen e quando em comparação com os controlos de solvente. Alguns NSAIDs resultou na indução significativa da apoptose num subconjunto de linhas celulares de cancro do ovário, incluindo sulindac sulfona, acetaminofeno, aspirina e Flurbiprofeno enquanto que o tratamento com o NS-398, o ibuprofeno, finasterida, ácido flufenâmico e meloxicam resultou apenas em marginal ou sem indução de apoptose ( Figura 1a e S1a).

SKOV-3 linha de células após o tratamento com aspirina 5 mM, 200 mM Ibuprofeno, paracetamol 1 mM, 200 mM Naproxeno, 200 um NS-398, 200? M diclofenac, 50 mM Finasteride, 200 uM de ácido flufenâmico, 40 uM de meloxicam, 50 uM ebselen, 20 nM flurbiprofeno, 50 uM sulindac sulfureto e sulindac sulfona 50 uM ou DMSO como controlo. ensaio (A) a apoptose de células de cancro do ovário, após tratamento com AINEs. Dados significa DP ± de triplicar experimentos independentes para cada tratamento. indução (B) dependente da dose da apoptose por AINEs em células de cancro do ovário. Ensaio de apoptose de células cancerosas do ovário SW626. As células foram tratadas com 50, 25, 10 e 5? M de sulindaco sulfeto; 200, 100, 40 e 20 uM de Diclofenac; 200, 100, 40 e 20 uM de naproxeno e 50, 25, 10 e 5? M de Ebselen ou DMSO. A apoptose foi medida 24 horas pós-tratamento. Dados significa DP ± de triplicar experimentos independentes para cada tratamento. (C) em tempo real de análise de PCR de

mda

-7 /expressão de IL-24 em células SKOV-3 após 24 horas de tratamento com diferentes NSAIDs. Cada amostra foi normalizada para hGAPDH. (D) Ensaio de apoptose de Caov-3 células de cancro do ovário após tratamento NSAID ou DMSO e infecção com codificação lentivírus

mda

-7 /IL-24 ARNic em cadeia dupla. Dados significa DP ± de infecção independentes em triplicado para cada vector de cada tratamento.

Para cada um dos quatro indutores de apoptose mais consistentes Foi determinada a menor dose que ainda induz a morte celular programada de células de cancro do ovário. As concentrações dos NSAIDs seleccionados foram testados aos 2, 5 e 10 vezes mais baixas concentrações do que as doses fisiologicamente atingíveis utilizadas nas experiências para a Figura 1A e S1a. A apoptose foi medida em células de cancro do ovário 24 horas após o tratamento com diferentes doses dos quatro AINEs. Nossos resultados mostram que as concentrações de sulindaco sulfeto, diclofenac e naproxeno mesmo em 5 vezes menor dose eficaz ainda induzir a apoptose, enquanto Ebselen pode ser reduzida apenas 2 vezes (Figura 1b).

Com base em nossas observações anteriores em outros tipos de câncer determinamos se a indução de apoptose por NSAIDs correlaciona-se com

mda

IL-24 indução -7 /. Medimos os níveis de expressão de mRNA de

MDA

7 /IL-24 mRNA em resposta a diferentes NSAIDs em Skov-3 células por PCR em tempo real análise demonstrando que

MDA

7 /IL-24 (máximo de indução de 12 vezes) a expressão é normalmente induzida por AINEs que promovem a apoptose em células de cancro do ovário (Figura 1C). Estes resultados também foram confirmados em duas linhas celulares de cancro do ovário adicionais. Em Caov-3 e SW626 linhas celulares de cancro do ovário e

MDA

7 /IL-24 também é induzida fortemente (máximo de indução 77 vezes na Caov-3 células) (Figura S1b). AINEs que fortemente melhoradas apoptose, tais como sulindac sulfureto, naproxeno, ebselen, e diclofenac (Figura 1a) induziu significativamente

MDA

7 /IL-24 de expressão (Figura 1c), enquanto que os AINE que apenas marginalmente a apoptose induzida por (Figura 1a ) não aumentou significativamente

mda

-7 /IL-24 expressão, exceto ibuprofeno que induzidas

mda

-7 /IL-24, mas não induziu apoptose (Figura 1c).

e outros têm mostrado que a sobre-expressão de

MDA

-7 /IL-24 após a infecção com um adenovirus carregando a apoptose

MDA

-7 /gene de IL-24 induz a proliferação de células e inibe em câncer de células [50], [51]. A fim de avaliar se a indução de apoptose em células cancerosas por NSAIDs é dependente de

mda

-7 /IL-24 sobre-regulação, realizamos experimentos com um lentivírus que codifica uma siRNA contra o

mda

-7 /IL-24 que foi gerado anteriormente pelo nosso grupo [23]. A infecção de células SKOV-3 com o

MDA

-7 /IL-24 siRNA lentivírus reduziu a apoptose induzida por AINEs por 40-70% em relação ao controle de lentivírus (Figura 1D), apoiando ainda mais a noção de que NSAID- apoptose mediada é pelo menos parcialmente dependente

MDA de Il-24, indução -7 /. Os mesmos resultados foram observados em Caov-3 células (dados não mostrados).

Os efeitos sinérgicos de combinações de AINEs

Usando a menor dose de cada NSAID que afetou a apoptose de células de cancro do ovário (Figura 1B ), foram analisadas sistematicamente indução de apoptose após combinação de baixas doses de NSAIDs. Um painel de NSAIDs incluindo diclofenac, sulindac sulfureto, o naproxeno e o Ebselen foram testados quanto à sua capacidade para induzir apoptose sozinho e em combinação. SKOV-3 de células de cancro do ovário foram tratadas com 10? M sulindac sulfureto, 40 uM Diclofenac, 25 pM ou 40 pM Ebselen naproxeno e suas combinações. A apoptose foi medida 24 horas após o tratamento, revelando que a maioria das combinações de AINEs testados induziu a apoptose significativamente mais do que qualquer um sozinho os AINEs em células de cancro do ovário (Figura 2A). Certas combinações tais como sulindaco sulfeto e Diclofenac, sulindac sulfureto e naproxeno e diclofenaco e naproxeno foram mais eficazes na indução de apoptose do que outros (Figura 2a). Nós validado esses resultados em linhas celulares Caov-3 e SW626 (Figura S2). análise de isobolograma usando combinações de diclofenac e sulindac Sulfeto indica que as combinações das drogas resulta em um efeito sinérgico (Figura 2b).

(A) Ensaio de apoptose de células SKOV-3 após o tratamento com 10 uM sulindac sulfureto, 40 Diclofenac uM, 25 uM Ebselen ou 40 uM naproxeno e uma combinação dos mesmos ou DMSO. A apoptose foi medida 24 horas pós-tratamento. Dados significa DP ± de triplicar experimentos independentes para cada tratamento. (B) isobolograma Normalizada obtido pelo software Compusyn. Caov-3 células tratadas com uma combinação de 5? M sulindaco sulfeto e 20 mM Diclofenac mostra efeito sinérgico.

tratamento AINE reduz o crescimento de xenotransplante de cancro do ovário em ratos SCID

Para determinar se NSAIDs reduzir o crescimento do tumor

in vivo por via subcutânea

, SKOV-3 células de câncer de ovário foram injectadas em ratinhos SCID. Os ratinhos foram divididos aleatoriamente em 3 grupos, alimentados com uma de três dietas ao longo de todo o experimento: AIN-93G como o controlo e a dieta AIN-93G suplementado ou com 200ppm sulindac sulfureto ou 100ppm diclofenac. Dois meses mais tarde, os animais foram examinados quanto à formação do tumor e o peso do tumor. Todos os ratinhos desenvolveram tumores, indicando que esta dose particular de NSAID não impediu a formação de tumores. No entanto, como pode ser visto na Figura 3, sulindac sulfureto e tratamento Diclofenac reduziu o volume médio do tumor em 30% e 20%, respectivamente, quando comparada com a dieta de controlo com um valor de p . 0,05, confirmando a sua eficácia anti-tumoral

Para cada inoculação, 2 × 10

6 SKOV-3 células foram injectadas subcutaneamente em ratinhos SCID. Os ratinhos foram divididos aleatoriamente em três grupos (n = 7 /grupo) e alimentados com uma de três dietas através de toda a experiência: AIN-93G, como controlo, a dieta AIN-93G suplementado com 200 ppm de sulindac sulfureto ou a dieta AIN-93G suplementado com 100 ppm de diclofenac. O tamanho dos tumores e tumores peso foram medidos depois de 2 meses. Valores que não partilham as mesmas letras são estatisticamente significativos com valores de p, pelo menos, 0,05

Indução de GADD45 α e γ gene expressão e ativação de JNK no cancro do ovário por NSAIDs

. Descrevemos previamente que a indução de apoptose por AINEs é rigidamente ligada à indução de

MDA

-7 /IL-24 e, consequentemente, a expressão α GADD45 e regulação positiva γ em várias linhas celulares de cancro [23]. Como AINEs induzir

mda

-7 /expressão de IL-24 em células de cancro do ovário (Figura 1C e s1c), avaliou mudanças na α GADD45 e expressão do gene γ.

Para avaliar se o Regulamento de GADD45 genes está envolvida na apoptose mediada por NSAID, a expressão de GADD45 α e y ARNm foi medido por PCR em tempo real em SKOV-3, Caov-3, e células SW626 tratada com AINEs. Os AINEs com o mais forte atividade pró-apoptótica incluindo sulindaco sulfeto, Diclofenac, Naproxeno e Ebselen fortemente reforçada α GADD45 e γ expressão, indicando que o aumento da α GADD45 e γ expressão estreitamente correlacionada com atividade pró-apoptótica de AINEs (Figura S3A e S3B). expressão lentiviral de siRNA contra o

mda

-7 /IL-24 em células de cancro do ovário demonstrou que knockdown de

mda

-7 /IL-24 reduz α GADD45 induzida por diclofenaco e expressão do gene γ, indicando que GADD45α e indução γ é pelo menos parcialmente dependente

MDA

-7 /IL-24 de expressão (Figura S3C).

uma vez que os outros e que tinha mostrado que a activação de JNK desempenha um papel na apoptose indução em células cancerosas e α GADD45 e γ interagir com a quinase a montante de JNK, MTK1 [52], avaliou-se a activação da JNK durante a apoptose mediada por NSAID. A actividade de JNK quinase foi testado em extractos proteicos obtidos a partir Caov-3 e SKOV-3 células tratadas com sulindac sulfureto (50 uM), diclofenac (200 uM) ou DMSO durante 24 horas por um

In vitro

ensaio de cinase. análise de Western blot revelou muito pouca actividade de JNK em células de controlo não tratadas e um forte aumento da actividade de JNK em ambas as linhas celulares após tratamento com sulindac sulfureto e Diclofenac (Figura 4a e 4b). Corroborando esta evidência um fraco indutor de

MDA

-7 /IL-24, e GADD45 α γ e apoptose, flurbiprofeno, demonstrou apenas uma indução marginal da actividade de JNK (dados não mostrados). Para elucidar a importância funcional do α GADD45 e γ e

MDA

-7 /IL-24 para a indução de JNK mediada por NSAID e apoptose no cancro do ovário, a actividade de JNK quinase foi testado em extractos proteicos obtidos a partir de

Caov -3

células tratadas com sulindaco sulfeto e Diclofenac e infectados com a codificação lentivírus siRNA contra α GADD45 e

mda IL-24 genes

-7 /. análise de Western blot revelou activação JNK quinase por sulindaco sulfeto e Diclofenac foi marcadamente dependente de α GADD45 e

mda

IL-24 indução -7 /, desde que a atividade quinase JNK em sulindaco sulfeto e Diclofenac tratados

mda

-7 /IL-24 – /- células foi abolido quando comparado com

MDA

-7 /IL-24 + /+ células (Figura 4b). De modo a caracterizar ainda mais o efeito de AINEs na indução de apoptose, os níveis de activação de PARP foram medidos por Western-blot, o que indica que sulindac sulfureto e diclofenac são fortes indutores da clivagem de PARP (Figura S4a).

(A ) lisado total antes da imunoprecipitação. (B) ensaio de quinase que mostra a indução de actividade de quinase JNK por AINEs. A indução da activação de JNK por sulindac sulfureto e diclofenac foi analisada em lisados ​​celulares de células SKOV-3 e Caov-3 células tratadas com 50 pM sulindac sulfureto, 100 uM diclofenac ou DMSO, utilizando o kit de ensaio de SAPK /JNK (Cell Signaling). Análise (C) Western Blot usando anticorpo anti-fosfo JNK de lisados ​​celulares Caov-3 a partir de células tratadas com 50 pM sulindac sulfureto, 100 uM diclofenac ou DMSO e infecção por lentivírus codificação

MDA

-7 /IL-24 siRNA, GADD45α e GFP duplexes.

tratamento Combinatória de inibidores farmacológicos da via NF-kB com AINEs induzir a apoptose em células de cancro do ovário

Nós investigamos a relevância biológica da NF- kB via em células de câncer de ovário e determinou as consequências funcionais da sua inibição. Em vez de utilizar a entrega adenoviral do inibidor de IkB foi transferida para um modelo clinicamente mais relevante e usado inibidores farmacológicos da via NF-kB. Inibidores da via de NF-kB foram testados quanto à sua capacidade para induzir apoptose em células de cancro do ovário. A apoptose foi medida 24 horas após o tratamento de células SKOV-3, Caov-3 e células de cancro do ovário SW626 com quatro inibidores diferentes de NF-kB, 5 nM de 6-amino-4- (4-phenoxyphenylethylamino) quinazolina [53], 50 uM Isohelenin [54], 50 uM de IKK-2 inibidor SC-514 [55], e 200 uM de inibidor de IKK II Wedelolactone (7-metoxi-5,11,12-tri-hidroxi-coumestan) [56] ou DMSO (controlo). 6-Amino-4- (4-phenoxyphenylethylamino) quinazolina foi um indutor eficaz de apoptose em todas as três linhas de células, e o inibidor de IKK II Wedelolactone (7-metoxi-5,11,12-tri-hidroxi-coumestan) apoptose induzida em dois de as três linhas de células. O tratamento com Isohelenin ou inibidor de IKK-2 SC-514 resultou apenas na marginal ou sem indução de apoptose (Figura 5a). Além disso, a análise por PCR em tempo real indica que Wedelolactone (7-metoxi-5,11,12-tri-hidroxi-coumestan) induz forte activação do gene α GADD45 e γ expressão (Figura S4B), e promove a fosforilação de JNK (Figura S4C) e clivagem da PARP (Figura S4a).

inibidores (a) Farmacológica NF-kB induzir a apoptose em células de cancro do ovário. SW626, Caov-3 e SKOV-3 de células após o tratamento com 5 nM de 6-amino-4- (4-phenoxyphenylethylamino) quinazolina (6-amino), 50 uM Isohelenin, 50 uM de IKK-2 inibidor SC-514, e 200 uM de inibidor de IKK II Wedelolactone (7-metoxi-5,11,12-tri-hidroxi-coumestan) ou DMSO como controlo. Dados significa DP ± de triplicar experimentos independentes para cada tratamento. indução (B) dependente da dose da apoptose por inibidores do NF-kB em células de cancro do ovário. Ensaio de apoptose de SKOV-3 células de cancro do ovário. As células foram tratadas com 5, 2,5, 1 e 0,5 nM de 6-amino-4- (4-phenoxyphenylethylamino) quinazolina (6-amino) 50, 25, 10 e 5? M de Isohelenin, 50, 25, 10 e 5? M de inibidor de IKK II Wedelolactone (7-metoxi-5,11,12-tri-hidroxi-coumestan) (Wedelolactone), 50, 25, 10 e 5 | iM de inibidor de IKK-2 SC-514 ou DMSO. A apoptose foi medida 24 horas pós-tratamento. Dados significa DP ± de triplicar experimentos independentes para cada tratamento. (C) a apoptose em células de cancro do ovário, após o tratamento de NSAID em combinação com inibidores de NF-kB. SW626, Caov-3 e SKOV-3 de células após o tratamento com 10 uM sulindac sulfureto, 40 uM Diclofenac, 25 uM Ebselen, 40 uM naproxeno, 1 nM de 6-amino-4- (4 phenoxyphenylethylamino) quinazolina (6-amino), e inibidor de IKK Wedelolactone II 200 uM e uma combinação destes. A apoptose foi medida 24 horas após o tratamento. Dados significa DP ± de triplicar experimentos independentes para cada tratamento. (D) Normalizada isobolograma obtido por software Compusyn. Caov-3 células tratadas com uma combinação de 10 uM sulindac sulfureto e 2,5 nM 6-amino mostra efeito sinérgico.

Quanto aos AINEs foi realizada uma análise de resposta à dose para a 6-amino-4- ( 4-phenoxyphenylethylamino) quinazolina e Wedelolactone (7-metoxi-5,11,12-tri-hidroxi-coumestan) para determinar a dose mais baixa que ainda induz a morte celular programada de células de cancro do ovário. Reduzir a concentração de 6-amino-4- (4-phenoxyphenylethylamino) quinazolina de 5 nm a 1 nm ainda induzida a apoptose, enquanto que doses reduzidas de Wedelolactone resultou na perda de indução de apoptose (Figura 5b).

Para determinar se os inibidores de NF-kB 6-Amino-4- (4-phenoxyphenylethylamino) quinazolina e Wedelolactone (7-metoxi-5,11,12-tri-hidroxi-coumestan) melhorar as actividades pro-apoptóticos de AINEs que combinado as doses mais baixas de cada dos quatro NSAID, sulindac sulfureto, Diclofenac, Ebselen, e naproxeno com as doses mais baixas dos dois inibidores de NF-kB que ainda induzir apoptose (Figura 1B e 5b, respectivamente). Os inibidores de NSAIDs e NF-kB foram testados quanto à sua capacidade para induzir apoptose sozinho e em combinação. células de cancro do ovário SKOV-3, Caov-3 e SW626 foram tratadas com 10? M sulindac sulfureto, 40 uM Diclofenac, 25 uM Ebselen, 40 uM naproxeno, 1 nM de 6-amino-4- (4 phenoxyphenylethylamino) quinazolina e 200 uM Wedelolactone . A apoptose foi medida 24 horas após o tratamento, revelando que as combinações de AINEs com o NF-kB inibidor de 6-amino-4- (4 phenoxyphenylethylamino) quinazolina aumentou significativamente a apoptose em células de cancro do ovário em comparação com qualquer um dos fármacos sozinhos (Figura 5c). Em contraste, Wedelolactone aumentou os efeitos pró-apoptóticos única de alguns dos AINEs e menos eficientemente em células SKOV-3 (Figura 5c). análise de isobolograma indica que a combinação de 6-amino-4- quinazolina (4 phenoxyphenylethylamino) com resultados sulindac sulfureto no um efeito sinérgico (Figura 5D).

Discussão

AINEs surgiram como potenciais drogas para quimioprevenção do câncer, mas os seus benefícios ainda estão em questão. Alguns AINEs tradicionais, como Sulindac estão actualmente a ser testado em ensaios clínicos para vários tipos de câncer. Com efeito, estudos pré-clínicos proporcionam evidência consistente que os AINEs podem inibir eficazmente a tumorigénese em especial através da inibição da ciclo-oxigenase-2 (COX-2). É importante ressaltar que o uso de aspirina foi associada a uma diminuição do risco de cancro da mama recorrência distante e morte por câncer de mama [57].

Estudos epidemiológicos indicam associação inversa entre o uso de medicamentos anti-inflamatórios não esteróides (AINE) e a incidência de cancro do ovário [5], [6], [7]. Vários relatórios sugerem que certas AINEs induzem a paragem do ciclo celular e a apoptose em células de cancro do ovário humano, mas o mecanismo molecular exacto pelo qual os AINEs induzem actividade anti-tumorigénica não é clara. Anteriormente, os nossos grupos descreveram uma nova via pela qual AINEs induzir a apreensão apoptose e crescimento em células cancerosas. Foi demonstrado que a indução da citoquina pró-apoptótica MDA-7 /IL-24 por NSAIDs é crucial para a morte celular programada induzida por AINEs [23]. No entanto, este estudo não incluiu células de cancro do ovário.

Vários relatórios utilizando um adenovírus que codifica o

mda

gene -7 /IL-24 (Ad-

mda

-7 ) mostram a sua actividade anticancerígena profunda e selectiva em modelos animais [26], [27], [50], [58], [59], [60], incluindo um relatório da morte celular induzida selectivamente das células de cancro do ovário, que resulta na supressão do crescimento do tumor

in vivo

[58]. No entanto, a expressão transiente, as reacções imunitárias potencialmente adversos (mediadas por adenovírus) e problemas com a entrega sistémica restringir a utilização generalizada de entrega adenoviral de

MDA

-7 /IL-24, particularmente quando administrados por via sistémica como um não-replicante adenovírus.

neste contexto, os nossos resultados que os AINEs com atividade anti-câncer de induzir altos níveis de

mda

-7 /IL-24 em células de cancro do ovário fornecer uma nova estratégia terapêutica para melhorar

mda

-7 /IL-24 níveis em um nível sistêmico. Na verdade, temos obtido uma visão abrangente das consequências de todo um painel de NSAIDs na sobrevivência de células de cancro do ovário, comparando as suas eficácias para induzir a apoptose e

mda

-7 /IL-24 expressão. Os indutores mais potentes de

mda expressão do gene

-7 /IL-24 incluem sulindaco sulfeto e Diclofenac. A nossa descoberta corresponde com os relatórios anteriores que demonstraram que o tratamento de xenoenxertos de tumores de pulmão humano em ratinhos nu com Ad-

mda

-7 além Sulindac reduziu o crescimento do tumor de forma mais eficiente do que o Ad-

mda viajantes – 7 [50]. Além disso, estes resultados corroboram as nossas descobertas anteriores de que a indução de apoptose da citocina pró-apoptótica

MDA

-7 /IL-24 medeia a indução de α GADD45 e γ actividade e expressão de JNK em outros tipos de cancro [23]. Enquanto sulindaco sulfeto e Diclofenac em si podem não ser as drogas ideais para induzir

mda

-7 /IL-24 e apoptose em células de cancro do ovário e, particularmente, Diclofenac provoca muitos efeitos adversos em pacientes que limitam seu uso em pacientes com câncer , deve ser exequível para gerar versões modificadas destas drogas que sejam mais potentes nas suas actividades anti-cancerígenas e com reduzidos efeitos adversos e fora do alvo. De facto, uma versão modificada de sulindac foi recentemente relatado para ser mais activos contra as células cancerígenas sem inibir COX 1 e 2 [61].

O diclofenac tem sido mostrado previamente para induzir apoptose em cólon e carcinoma de células escamosas e de inibir crescimento do tumor pancreático [62], [63]. No entanto, não existem relatórios sobre a sua utilização no cancro do ovário. Aqui, demonstramos que o diclofenaco, bem como sulindac Sulfeto induzir a apoptose e inibem o crescimento do tumor de cancro do ovário. Estes dados convincentes reforçam a noção dos benefícios potenciais do tratamento AINE para o câncer de ovário.

Também identificamos Naproxeno e Ebselen como indutores moderadas de apoptose e

mda

-7 /IL-24 expressão em células de câncer de ovário. Enquanto Naproxeno ajuda a prevenir a bexiga e cólon carcinogénese [64], Ebselen foi mostrado para reduzir a toxicidade do tratamento com cisplatina, em modelos de cancro do ovário de ratos, que aumenta a actividade anti-tumoral e melhorar a mortalidade, morbidade e resultado [65]. Como mencionado antes, nós relataram que a indução de

mda

-7 /IL-24 por estruturalmente diferentes NSAIDs é crucial para a indução de apoptose de mama, próstata, células de câncer renal e de estômago [23]. No entanto, no presente estudo anterior, o naproxeno e o Ebselen teve apenas efeitos marginais sobre a indução de apoptose. Neste relatório, observou-se diferentes actividades de drogas para Naproxeno e Ebselen. Ebselen e naproxeno apoptose induzida e

mda

-7 /expressão de IL-24 em células de cancro do ovário e também em sinergia com as NSAIDs mais potentes, Diclofenac e sulindaco sulfeto, sugerindo utilidade clínica potencial na terapia de câncer de ovário.

Temos demonstrado anteriormente que a inibição do NF-kB em células cancerosas aumenta a apoptose sem promover

mda

IL-24 de produção -7 /[23]. Um dos principais circuitos transcricionais implicados na inflamação é a via de NF-kB /IkB [66]. Além disso, o NF-kB tem sido implicada na sobrevivência de células cancerosas e escapar da morte programada de células e é activada por agentes quimioterapêuticos em células cancerosas [30], [31], [33]. Mutações em genes diferentes da via de NF-kB e constitutivamente activa NF-kB são frequentemente observadas em diversos tipos de cancro [33]. De facto, as células de cancro do ovário contêm frequentemente activada de NF-kB antes da terapia e são, por conseguinte, deverá ser resistente à quimioterapia

a priori. 5′CTGTCTAGACAAAAACTTTGTTCTCATCGTGTCATCTCTTGAATGACACGATGAGAACAAAGGGGGATCTGTGGTCTCATACA-3′.

Animal