Abstract

Apesar de iodização do sal é o método mais comum usado para obter alimento enriquecido com iodo, distúrbios por deficiência de iodo ainda são um problema global de saúde e afetam profundamente a qualidade de vida humana. O iodo é necessário para a síntese de hormonas da tiróide, que são reguladores cruciais do metabolismo humano, o crescimento celular, a proliferação, a apoptose e têm sido relatados para ser envolvidos na carcinogénese. Neste estudo, pela primeira vez, avaliou-se o efeito de alface Biofortified-iodo no perfil do transcriptoma de linha celular de cancro de Caco-2 através da aplicação do ensaio do Genoma Humano Microarray inteiro. Nós mostramos 1326 diferencialmente expressos Caco-2 transcrições após o tratamento com Biofortified-iodo (BFL) e (NFL) extratos não fortificada de alface. Foram analisadas as vias, funções moleculares, processos biológicos e classes de proteínas com base na comparação entre os genes específicos BFL e NFL. O iodo, o que era esperado para agir como um ião livre (KI-NFL) ou, pelo menos, em parte, para ser incorporado em macromoléculas de alface (BFL), diferentemente vias reguladas de inúmeros factores de transcrição que conduzem a diferentes efeitos celulares. Neste estudo, mostrou a inibição da proliferação de células Caco-2 de células após o tratamento com BFL, mas não iodeto de potássio (KI), e indução de apoptose mitocondrial e /ou a diferenciação de células BFL-mediada. Os nossos resultados mostraram que as plantas de iodo-biofortificada pode ser eficazmente utilizada por células como uma fonte alternativa deste oligoelemento. Além disso, as diferenças observadas na ação de ambas as fontes de iodo pode sugerir um potencial de BFL no tratamento do câncer

Citation:. Koronowicz AA, Kopeć A, Mestre A, Smoleń S, Piątkowska E, Bieżanowska-Kopeć R, et ai. (2016) transcriptoma Profiling da Linha Cancer Cell Caco-2 após o tratamento com extratos de iodo-Biofortified alface (

Lactuca sativa L.

). PLoS ONE 11 (1): e0147336. doi: 10.1371 /journal.pone.0147336

editor: Maria Cristina Vinci, Centro Cardiológico Monzino, ITALY

Recebido: 30 de julho de 2015; Aceite: 31 de dezembro de 2015; Publicação: 22 de janeiro de 2016

Direitos de autor: © 2016 Koronowicz et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Os dados são disponível a partir do Omnibus Gene Expression. O número GEO é: GSE7160

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo Polish National Science Center 2012-2015, conceder nenhuma. DEC-2011/03 /D /NZ9 /05560, “Eu e Se biofortificação de vegetais selecionados, incluindo a influência destes microelementos sobre a qualidade da produção, bem como a avaliação da absorção de iodo e parâmetros bioquímicos selecionados em ratos alimentados com vegetais biofortificadas com iodo. “

Conflito de interesses: Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

ingestão insuficiente de iodo na dieta pode resultar em deficiência de iodo, que pode causar muitos saúde adverso. efeitos [1, 2, 3, 4]. Actualmente, o modo mais eficaz de controlar a deficiências de iodo é uma iodização generalizada de sal de mesa. No entanto, na maioria dos países industrializados o consumo excessivo de sal está se tornando um fator de risco de doenças cardiovasculares, osteoporose ou até mesmo câncer de estômago [5, 6]. Além disso, deve ser considerado que certas quantidades de iodo podem ser perdidos durante a preparação e a transformação de produtos alimentares, por exemplo, devido ao uso de altas temperaturas [7]. iodo inorgânico é volátil e é difícil controlar a sua perda durante o armazenamento e transporte, assim como a cozedura, especialmente com o uso de óleos de alta temperatura. Neste contexto, a biofortificação de legumes com iodo durante o seu cultivo é uma forma considerável para aumentar o consumo de iodo, especialmente porque iodo presente em alimentos podem ser facilmente assimilados [8] e quase inteiramente absorvida [7]. Biofortificação de plantas é bem conhecido e compreendido através de alguns métodos biotecnológicos ou agronómicos [9, 8, 10, 11, 12]. Cenoura, tomate, batata e alface são consumidos diariamente na maioria das famílias. Por conseguinte, fortalecer estes vegetais com iodo é uma maneira vantajosa de melhorar o estado nutricional de iodo de consumidores sem o risco da sua ingestão excessiva. A alface é um vegetal de folhas, que geralmente é consumido cru, sem risco de perda de iodo, por isso é uma boa colheita para o estudo de iodo-biofortificação [13].

Em nossos estudos anteriores que mostraram alta eficiência de biofortificação de iodo de alface por fertilização do solo com iodeto de potássio (KI). Além disso, também observaram um aumento na concentração de iodo na urina, bem como em tecidos seleccionados de ratos experimentais, como um resultado de complementar suas dietas com tais alface iodo-biofortificada [14].

literatura disponível indica que a deficiência aumenta iodo o risco de tireóide [15, 7], estômago [16, 17], de mama [18, 19] e próstata [20] câncer. Efeitos antitumorais de iodo pode resultar da sua antioxidante, anti-proliferativo, anti-inflamatórios, assim como pró-apoptóticas e pro-diferenciadores [21, 22, 23] efeitos. No presente estudo, determinou-se que os extratos de alface Biofortified-iodo (BFL) reduziu a proliferação de linha celular de cancro do cólon. Suspeita-se, que pode ser relacionado com a alteração na expressão de genes envolvidos na proliferação e ciclo celular.

Para compreender melhor mecanismo molecular subjacente de acção BFL aplicou-se, pela primeira vez, uma análise do genoma inteiro de microarray do perfil de transcrição de células Caco-2 humanos. Nós comparamos diferente regulada genes em células tratadas com extratos de alface quer iodo-biofortificada ou não fortificada. Finalmente, determinadas e analisadas as vias potencialmente afectadas celulares, processos biológicos, funções moleculares e classes de proteínas.

Materiais e Métodos

Preparação de extratos de biofortificada alface alface

‘Melodion ‘ cv. foi cultivado e adubado com KI como descrito por Kopeć et al. [14]. A concentração de iodo foi de 0,50 mg /100 g de massa seca (D.) para a alface biofortificada e 0,12 mg /100 g D.M. para a alface controle [14]. alface fresca (10 g) foi triturada utilizando um homogeneizador (tipo CAT X 120, EUA) e em seguida transferida para o balão Erlenmaier com água de temperatura de 90-100 ° C. materiais de alface foram extraídos por agitação (Elpan, banho de água agitador tipo 357, Polónia) a 100 ° C Temp. durante 2 h, e no próximo solução foi centrifugada (tipo Centrífuga MPW-340, Polônia). Em seguida, a parte dos extractos foi utilizado para a medição de iodo e outras partes foram armazenadas a -80 ° C para estudos de culturas celulares.

Determinação da concentração de extracto de iodo

Digestão de 10 cm

3 amostras de extrato de alface na mistura de 10 cm

3 65% HNO

3 (superpure, Merck, Whitehouse Station, NJ, EUA) e 0,8 cm

3 70% HClO

4 ( superpure, POCH, Gliwice, Polônia) foi realizado no sistema de microondas CEM MARS-5 Xpress. O teor de iodo (I

-) foi analisada pela técnica de geração de vapor frio com o uso de alta dispersão ICP-OES (plasma indutivamente acoplado Espectrometria de Emissão Óptica) Prodigy espectrômetro-Leeman Labs, New Hampshire, Massachusetts, EUA [24 , 25]

Condições de cultura de células

linha de células de cólon humano Caco-2 (adenocarcinoma colorretal; HTB-37). foi adquirido da American Type Culture Collections (ATCC, Manassas, VA, EUA). As células foram cultivadas numa incubadora, em condições controladas (temperatura, 37 ° C;. Do ar, 95%; CO

2, 5%), no de Eagle Meio Essencial Mínimo (Sigma, Saint Louis, MO, EUA), com a soro fetal de bovino (FBS) (Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) a uma concentração final de 20%, de acordo com o procedimento ATCC.

tratamentos com células

As células foram semeadas em 96 cavidades placas de cultura (Becton, Dickinson and Company, Warszawa, Polónia) para a viabilidade e proliferação celular ou 6 placas de cultura (Becton, Dickinson and Company, Warszawa, Polónia) para isolamento de RNA durante 24 h, de acordo com o protocolo de Roche (Basileia , Suíça) e A A Biotecnologia (Gdynia, Polónia), respectivamente. Após esse tempo, meio de cultura foi substituído por meio contendo a) extrair do não-fortificada alface (alface controle, NFL) com teor de iodo 27,6 mg /dm

3, b) extrato de alface biofortifed-iodo (BFL) com iodo teor de 186,7 ug de DM

3, c) iodeto /potássio adicionado a NFL (KI-NFL) na concentração de 186,7 g /dm

3. A concentração final de iodo em meio de cultura foi 107,33 nmol /dm

3 para NFL e 441,37 nmol /dm

3 para BFL. Uma concentração final de iodo no grupo KI-NFL foi o mesmo que no grupo de BFL. Em todos os estudos, pelo menos, 4 poços foram examinados por tratamento. As experiências foram repetidas 3 vezes.

A viabilidade celular e a proliferação

viabilidade celular foi medida utilizando Kit de Detecção de Citotoxicidade (LDH) (Roche, Basel, Suiça), de acordo com o protocolo do fabricante. A citotoxicidade foi avaliada em extratos de BFL com concentrações finais de iodo no valor de 147,12; 294,25 e 441,37 nmol, a intervalos de tempo de 24, 48 e 72 horas e calculada de acordo com a fórmula:

A proliferação celular foi determinada utilizando Etiquetagem 5′-bromo-2′-desoxi-uridina e kit de detecção III ( Roche, Basel, Suiça), de acordo com as instruções do fabricante. A proliferação foi padronizado para 100% do controle. A análise das amostras foi realizada em triplicado e em três experiências independentes. A análise estatística foi realizada utilizando um teste t de Student bicaudal.

isolamento de ARN, a validação, a etiquetagem e a hibridação

O ARN total foi isolado a partir das células usando o kit de isolamento de ARN a partir de culturas de células ( A A Biotecnologia, Gdynia, Polónia). quantidade de ARN foi medida com NanoDrop (NanoDrop Technologies, EUA). A análise da qualidade final de ARN e integridade foi realizada com um Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA). Para garantir a qualidade dos dados ideal, apenas amostras com número de integridade do RNA (RIN) ≥8.0 foram incluídos na análise. A análise de perfil de expressão genética foi realizada utilizando Human Gene Expression SurePrint G3 8x60K V2 Microarray (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA). Cada slide continha 8 microarrays que representam cerca de 50 mil conjuntos de sondas. A baixa de entrada rápida Amp Labeling Kit, de duas cores (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA) foi utilizado para amplificar ARN alvo e rótulo para gerar ARN complementar (ARNc) para microarranjos de oligo utilizados no perfil de expressão do gene. Experimento foi realizado utilizando um design de referência comum, onde a referência comum era um conjunto de montantes iguais de ARN a partir de células de controlo.

Em cada um dos microarrays de duas cores, nós hybridized 300 ng de cRNA da piscina (marcado Cy3) e 300 ng de cRNA (marcado com Cy5). No total, fizemos 12 microarrays e três para cada grupo experimental. hibridação microarray foi realizada com o Kit de hibridação Gene Expression (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA), de acordo com os protocolos do fabricante. ARN pico de Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA) foi usada como um controlo interno. Aquisição e análise de intensidades de hibridação foram realizadas utilizando o scanner de DNA microarrays Agilent (G2565CA, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA).

Detecção de sinal e análise estatística

Os dados foram extraídos e fundo subtraídos usando os procedimentos padrões contidos no Agilent recurso de extração (FE) Software versão 10.7.3.1. FE executa uma normalização Lowess. A análise estatística foi realizada utilizando software Gene Primavera 12.6.1 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA). As amostras foram submetidos a controlo de qualidade e os resultados mostraram que cada amostra tinha um perfil de métrica QC semelhante. O próximo passo foi filtrar conjuntos de sondas por bandeiras para remover sondas de baixa qualidade (bandeiras ausentes). A significância estatística das diferenças foi avaliada utilizando uma ANOVA one-way e teste HSD post-hoc de Tukey (p 0,05). A correção de testes múltiplos foi realizada utilizando Benjamini e Hochberg Falso Taxa Discovery (FDR) 5%. dados de microarranjos foram depositados no Gene Expression Omnibus repositório de dados com o número de GSE71605 e seguiu os requisitos Miame. Para identificar vias de sinalização e funções dos genes os dados microarray foi analisada utilizando Panther Sistema de Classificação de-um banco de dados online.

análise de PCR RT e em tempo real

A transcrição reversa foi realizada utilizando 1 ug de RNA total isolado a partir das células com o kit de Máximos de síntese de ADNc de primeira cadeia para RT-qPCR (Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA). verificação quantitativa de genes foi realizada utilizando o CFX96 toque

™ instrumento Real-Time PCR Detection System (Bio Rad, Hercules, CA, EUA), utilizando o kit SYBR Green Precision Melt Supermix (Bio-Rad). Condições de reações de PCR individuais foram otimizados para determinado par de primers de oligonucleotídeos (S1 Table, informações de apoio), com base em condições como segue: 95 ° C, 10 min; 45 ciclos de PCR a 95 ° C, 15 s; 59 ° C, 15 s; 72 ° C, 15 s, seguido de análise da curva de fusão (65-97 ° C com velocidade de rampa de 0,11 ° C e 5 por aquisições 1 ° C). Os resultados foram normalizados utilizando

GAPDH

,

ACTB Comprar e

HPRT

genes de referência. Diferenças na expressão genética entre os grupos BFL e NFL foram avaliados por testes t de Student.

Resultados

A viabilidade celular e proliferação

Nós determinamos que o extrato de alface iodo-biofortificada suprimiu a proliferação de células Caco-2 de forma mais eficaz do que o extracto de alface não fortificada (Fig 1). teste de citotoxicidade LDH verificou que efeito observado não foi causada por necrose. Não foi encontrada nenhuma citotoxicidade significativa de LDH de extracto de BFL na linha de células Caco-2 em qualquer estudada concentração de iodo (dados não mostrados). A proliferação celular não foi afetada pelo KI além de extrato de NFL. Além disso, a influência de BFL e NFL sobre a proliferação de linha celular FHC normal foi examinado e não foi observada nenhuma diminuição na proliferação celular (dados não mostrados).

Os valores são expressos como média ± SEM para N ≥ 9 , estandarizado para NC como 100%. A significância estatística foi baseada na do teste t de Student * p 0,05 contra (vs). NC e ^ p 0,05 vs. NFL.

genes específicos alface iodo-biofortificada em linha de células Caco-2

Um total de 2603 transcrições foram analisadas. Mostrámos que cerca de 50% dos transcritos (1326 de 2603) foram expressos diferencialmente entre as células tratadas com BFL e NFL (Tabela 1). A lista de transcritos específicos BFL é apresentado em Informações de Apoio (S2 Mesa, Informações de Apoio). Entre eles, usando um programa de Estúdio Pathway, determinou-se (Tabela 2) e visualizadas as interações entre genes e proteínas em resposta ao iodo (Figuras 1 e 2).

Genes especialmente regulado pelo extrato de alface iodo-biofortificada na linha de células Caco-2

Interações de genes específicos BFL (S2 Tabela de Informação de Apoio) em resposta ao iodo (Figura 2) foram gerados automaticamente usando um programa Estúdio Caminho. Como mostrado na Figura 2, iodo afeta:

IGF1

,

TG

,

PPARG

,

GPX1

,

FOS

,

SLC6A4

,

NOS2

, e

THRB

meio para cima /para baixo-regulação da sua expressão e /ou outras funções moleculares. Iodo acção indirecta reflecte-se principalmente através da tireoglobulina (TG), que resíduos de tirosina são iodados na via de síntese de hormônios da tireóide (TH). Assim, TG está directamente envolvido no metabolismo de iodo e tem sido relatada a ser associada com numerosas doenças de deficiência de iodo [26, 27]. De acordo com o Caminho Programa Studio, iodo, que é covalentemente ligado a TH e seu análogo sintético (levotiroxina), pode influenciar a expressão ou actividade de

NOS2

,

HMOX1

,

NPPB

,

TXN

,

ABCB1

,

G6PD

,

mylk

, bem como

THRB

que codifica o receptor beta de hormona da tiróide (TRβ1). No nível genômico, TRβ1, que é um fator de transcrição TH-liganded, podem influenciar os níveis de mRNA de vários genes, incluindo regulada positivamente tipo 1 iodotironina deiodinase

DIO1

e

fator de transcrição regulados negativamente E2F1

envolvidos na progressão do ciclo celular (Figura 2). Este receptor também é pensado para ser um mediador da acção de TH não genômica que é responsável pela activação da membrana plasmática integrina avp3 seguido pela activação de vias a jusante que conduzem a fosforilação de ERK1 /ERK2 e proteínas TRβ1. Além disso, a formação mediada por complexos de T3 TRβ1 citoplasmáticos com subunidade p85 de PI3K pode activar percursos a jusante de mTOR-dependente que podem explicar as acções pleiotrópicas de TH [28]. Todas estas relações directas e indirectas entre os genes influenciados pelas moléculas contendo iodo pode corresponder, pelo menos em parte, com os nossos resultados mostram diferenças na acção do sal de iodeto de potássio (Kl) e iodo que podem ser incorporados em macromoléculas de alface biofortificada.

Além disso, inter-relações entre genes específicos BFL em resposta ao iodo em células Caco-2 (Tabela 2) são apresentados na Figura 3.

PCR em tempo real

análise de PCR em tempo real foi realizada para os receptores nucleares de hormona da tiróide (TRs): receptores da hormona da tiróide, alfa (

THRA

) codificação TRa isoformas da proteína e do receptor da hormona da tiróide, beta (

THRB

) que codifica receptores TRp, bem como para DIO1, que é regulada positivamente pela TRS e regulados negativamente E2F1. Para determinar se as alterações na expressão de genes em BFL pode ser um resultado de ião iodeto (I

-) ação, Kl na mesma concentração que no BFL foi adicionado a NFL. Como resultado, os níveis de mRNA TRβ1 foram diminuiu em ambos os extratos e não houve mudanças significativas em transcrições TRa. Um aumento significativo de mRNA DIO1 foi observada em linhas de células tratadas com extractos de BFL e Kl-NFL. Expressão de ARNm de E2F1 foi diminuída em extracto de BFL e aumentado em extracto de KI-NFL (Tabela 3). Os dados obtidos com o Real-Time PCR mostrou a mesma tendência, verificando os resultados de microarray.

Gene Ontology molecular análise completa

Em seguida, examinamos Gene Ontology (GO) para todos BFL vs . NFL transcritos diferencialmente regulados (S2 Mesa, Informações de Apoio), utilizando Panther Sistema de Classificação. Os resultados obtidos a partir da análise das vias de sinalização são apresentados na Tabela 4. GO processos biológicos, funções moleculares e classes de proteínas são apresentadas em Informações de Apoio (Tabelas S3-S5).

Discussão

para nosso melhor conhecimento, nosso estudo é o primeiro a avaliar o efeito da alface Biofortified-iodo, no perfil de transcriptoma da linha de células Caco-2. Também é o primeiro a mostrar a inibição da proliferação de células de cancro do cólon, em resposta ao tratamento com extracto de alface iodo-biofortificada (Fig 1). Nós suspeitamos que a redução da viabilidade das células pode ser causado pela presença de iodo, a qual foi incorporada na estrutura da planta. A adição de Kl ao extracto NFL não afectou a redução da síntese de BrdU. Isto pode sugerir que na BFL, o iodo é covalentemente a lípidos ou proteínas de membranas de cloroplastos [29,30,31,32], embora sejam necessários mais estudos. Esta forma orgânica de iodo pode interferir com vias que levam à redução da viabilidade das células. É indicado, que os tratamentos de iodo inibir a proliferação celular através da geração de iodo-lípidos, incluindo o ácido 6-iodo-5-hidroxi-8,11,14-eicosatrienóico (um ácido araquidónico iodado) e iodohexadecanal [33, 34]. Estes compostos foram detectados após iodo (I

2) suplementação, e presume-se que eles podem ser activadores potentes do receptor de tipo de peroxisoma gama activado por proliferador (PPAR) [35]. No nosso estudo, observou-se a diminuição de ARNm após o tratamento com PPARy BFL, bem como a mesma tendência de genes alvo de PPARy (ácido gordo proteína de ligação 4,

FABP4;

proteína Desacoplamento 1,

UCP- 1