Sumário

receptor metabotrópico de glutamato 1 sinalização (GRM1) tem sido implicada nos distúrbios benignos e malignos, incluindo o cancro da próstata (CaP). Para explorar ainda mais o papel de alterações genéticas de

GRM1

em APC, nós analisamos toda a humana

gene GRM1

incluindo codificação junções sequência, exão-intrão, e flanqueando regiões não traduzidas (UTRs) para o presença de mutações e polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) em várias linhas de células APC e tecidos tumorais do normal combinados de americanos caucasianos (CAs) e afro-americanos (AA). Usamos sequenciamento bidirecional, PCR alelo-específico, e bioinformática para identificar as alterações genéticas em

GRM1

e prever o seu papel funcional. Uma nova mutação missense identificado pelo C1744T (582 Pro Ser) posição de

gene GRM1

em uma linha de células AA-PCA primário (E006AA) foi previsto para afectar a estabilidade da proteína e funções. Outra nova mutação identificada na junção exão-intrão do exão-8 na linha de células C4-2B resultou na alteração do

GRM1

sítio de splicing dador. Além disso, encontramos missense SNP na T2977C (993 Ser Pro) posição e múltiplas mutações não-codificantes e SNPs em 3′-UTR de

gene GRM1

em linhas de células APC e tecidos. Estas novas mutações podem contribuir para a doença por alterações na

GRM1

de splicing do gene, a activação do receptor, e a sinalização a jusante pós-receptor

citação:. Ali S, Shourideh H, Koochekpour S (2014) identificação de novos

GRM1

mutações e polimorfismos de nucleotídeo único no câncer de próstata linhas de células e tecidos. PLoS ONE 9 (7): e103204. doi: 10.1371 /journal.pone.0103204

editor: Mohammad Saleem, Instituto Hormel da Universidade de Minnesota, Estados Unidos da América

Recebido: 16 de abril de 2014; Aceito: 25 de junho de 2014; Publicação: 25 de julho de 2014

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Data Availability:. Os autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por R01MD005824, R21CA183892, e concede R21CA181152 ao Dr. Shahriar Koochekpour. Apoio adicional foi fornecida por Roswell Park Cancer Institute e do National Cancer Institute conceder # P30 CA016056. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

sinalização de glutamato leva à ativação de múltiplas cascatas de sinalização a jusante. Essas cascatas de sinalização a jusante incluem (i) a ativação de canais iónicos dependentes de ligante (conhecido como ionotrópicos receptores de glutamato (iGluRs)) e influxo de Ca

2 + e /ou K

+ íons nos sistemas nervosos central e periférico [ ,,,0],1], (ii) a activação dos receptores de glutamato metabotrópicos (mGluRs) conhecidos como receptores acoplados à proteína G (GPCRs) e segunda vias de mensageiro, como a fosfolipase C (PLC), fosfatidilinositol 3-quinase /retrovírus AK timoma /mTOR (PI3K /AKT /mTOR) [2], e (iii) a activação de vias de transdução de sinal da proteína G-independentes, mitogen activated protein kinase (MAPK) e a proteína quinase C (PKC) /ERK1 /2 vias [3], [4]. Últimas duas cascatas de sinalização, PI3K /AKT /mTOR e MAPK /ERK extensivamente sido implicado em vários cancros humanos e enfatizar o papel da sinalização de glutamato na tumorigênese [4]

mGluRs compreendem uma arquitetura característica básica:. Um grande domínio bi lóbulos extracelular amino-terminal (ATD), também conhecida como “Vénus mosca armadilha” com uma sequência específica de 24 aminoácidos para o local de ligação do glutamato, um domínio rico em cisteína 70 aminoácidos (CRD) necessária para a dimerização, após activação, seguido por clássico domínio transmembranar sete alfa-helicoidal, e um domínio citoplasmático intracelular cauda (CTD) [5]. Várias isoformas de mGluRs do Grupo I (mGluR1) foram identificados de acordo com o comprimento de domínio C-terminal [5]. Este domínio C-terminal compreende um motivo rico em prolina Homer1 ligação (isoforma a), que envolve em interacções proteína-proteína complexos e formação de complexos com moléculas de [6] a jusante. A truncagem do CTD leva à perda de motivo de ligação Homer1 em isoformas b-d e, portanto, afecta a interacção com outras moléculas de sinalização a jusante e vias [5]. Presença de diferentes isoformas de comprimento de

gene GRM1

com variados papel na subsequente activação de vias de sinalização a jusante, destacam a importância de mecanismos de processamento em

GRM1

função do gene [5].

mGluRs sinalização foi inicialmente implicadas na proliferação celular de células de glioma [7] e desenvolvimento de melanoma [8], quer em

in vitro

ou

in vivo

estudos e, posteriormente, este receptor foi mostrado para desempenhar um papel crucial em diversos tipos de cancros [9], [10], [11], [12] função oncogénica de mGluR1 foi mostrado pela indução de fenótipo transformado com sobre-expressão de

gene GRM1

em melanócitos [13] . Da mesma forma, no nosso estudo anterior, foi investigada a expressão de mGluR1 em linhas celulares de CaP primários e metastáticos e tecidos [10]. dependência do crescimento de células APC sobre

GRM1

-signalling também foi demonstrado pelo bloqueio glutamato ou uso de Riluzol, como um antagonista GRM1 ou um inibidor da liberação de glutamato. O riluzol reduziu o CaP células de proliferação, migração, invasão e apoptose induzida como mostrado pelo aumento do nível de caspase-9, -7, -3 clivada, PARP expressão, e phopho-H2AX

ser139 [10].

mutações somáticas foram identificados em diferentes domínios de mGluR, incluindo o domínio de ligação ao ligando, um domínio transmembranar e um domínio citosólico em vários tipos de cancro [4]. Mutações de mGluR identificados em diferentes domínios pode ter relevância biológica em cancros. De facto, mutações somáticas nos mGluRs têm sido relatados para a promoção do cancro da mama, melanoma e carcinoma de células renais crescimento e progressão

In vivo

[11], [12], [14]. Esseltine e colega [15] estudaram as conseqüências funcionais de múltiplas mutações missense identificados em diferentes domínios de mGluRs em vários tipos de cancros, incluindo adenocarcinoma de pulmão, carcinoma de células escamosas, astrocitoma de alto grau e cânceres de mama. Estas mutações missense em diferentes domínios de mGluRs afetam a expressão do receptor e proporcionar vantagem seletiva para diferentes vias de sinalização a jusante (por exemplo, via PI3K /Akt /mTOR, ERK1 /2 ativação) e alterações na morfologia celular.

Existem poucos relatórios para mutações GRM1 e polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) em linhas celulares de CaP ou tecidos. Estes estudos estão limitados a sequenciação de todo o exome e análise do transcriptoma. Estes ensaios de alto rendimento são incapazes de identificar junções intrão-exão ou variantes não-codificantes e necessitam de validação ainda experimental das mutações identificadas. Além disso, estes estudos não incluem American Africano (AA) amostras -PCa e linhas de células de mutação GRM1 ou detecção SNP. Para superar essas limitações, nós analisamos gene GRM1 de corpo inteiro, incluindo todos os exons, junções exon-intron, e o acompanhamento não codificante 5 ‘e as regiões 3’ não traduzidas (UTRs) para identificar alterações genéticas em várias linhas de células de tumor APC e combinados tecidos -Normal em AAs e americanos caucasianos (CAs). Foram identificadas novas mutações e SNPs no gene do GRM1. consequências funcionais destas mutações foram previstas usando ferramentas de bioinformática disponíveis on-line.

Materiais e Métodos

Linhas Celulares

exibiu o DNA genômico de dez linhas de células CaP (PC-3 , E006AA, DU-145, MDA-PCa2b, 22RV1, LAPC4, VCaP, CWR-R1, LNCaP, C4-2B) e células epiteliais da próstata normal para detecção de mutações e polimorfismos na região de codificação, flanqueando regiões não traduzidas (5’e 3′- UTRs) e junções exão-intrão de comprimento total

gene GRM1

.

Castro-resistente (PC-3, DU-145, MDA-PCa2b, VCap e 22RV1) e androgénio estimulada (LNCaP e LAPC4) linhas celulares de CaP foram adquiridos da American Type Culture Collection (ATCC, Manassa, VA) [16], [17]. As células normais da próstata (NL-Pr.EC epiteliais) e linhas de células C4-2B foram adquiridos a partir de Clonetics (Bio Whittaker, Walkersville, MD) e UROCOR (Grupo Uroscience, Oklahoma City, OK), respectivamente. E006AA foi estabelecida a partir de um paciente com PCA AA confinado ao órgão [16]. linha de células CWR-R1 foi fornecido como um presente do Dr. Elizabeth Wilson (Universidade da Carolina do Norte, Chapel Hill, NC, EUA) [18]. PC-3, linhas celulares DU-145, e VCaP foram mantidas em DMEM suplementado com Soro Fetal de Bovino (FBS, 10%) e antibióticos (1%). E006AA, 22RV1, CWR-R1, C4-2B, e linhas de células LNCaP foram cultivadas em RPMI 1640 com FBS (10%) e antibiótico (1%). A linha celular MDA-PCa2b foi cultivada em meio de definir como recomendado pelo fabricante (ATCC, Manassa, VA). linhas celulares LAPC4 foi a cultura em IMDM suplementado com 10% FBS e 1% de antibiótico.

amostras de tumores e Declaração de Ética

Para avaliar as alterações genéticas em

gene GRM1

, incluímos um total de 21 amostras de tumor de próstata normais obtidas a partir de combinados AA (n = 10) e AC (n = 11). Todos os tecidos biospecimens foram obtidos de instalação do núcleo biospecimen no Cancer Research Consortium Louisiana (LCRC) filiada à Tulane Medical School e School of Medicine, Louisiana State University Centro de Ciências da Saúde (LSUHSC, Nova Orleans, LA). termo de consentimento pré-informado foi obtido de cada paciente durante a coleta de amostras para o uso de suas amostras em descobertas científicas e o estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional (IRB) em LSUHSC. tecidos tumorais normais pareados estavam disponíveis para oito casos (N3-T3; N4-T4; N5-T5; N13-T13; N21-T21; N35-T35; N52-T52; N71-T71) de CAs e seis casos (N2 -T2; N6-T6, N26-T26; N27-T27; N32-T32; N38-T38) de pacientes com AA

isolamento do DNA genômico, Polymerase Chain Reaction, e sequenciamento de

GRM1

Gene

ADNs genómicos foram isolados a partir de tecidos da próstata e linhas celulares utilizando AllPrep ADN /ARN Quigen kit (Qiagen, Valencia, CA). Full-length

GRM1

gene (α isoforma) foi selecionado (NM_000838.3) para desenhar os iniciadores que abrangem todos os exons, junções exon-intron, e 5’e 3′-UTRs. Esta transcrição compreende total de nove exons. Com base em mutações e SNPs descobertos no exão-8 e -9 em linhas de células APC, foram selecionados nessas regiões para posterior sequenciamento em tecidos tumorais do normal combinados. concepção Primer foi realizada utilizando a ferramenta PrimerSelect de DNASTAR Lasergene 9 núcleo terno (DNASTAR, Madison, WI). Um total de 9492 pb foi amplificado em dezasseis amplicões incluindo a 50-100 pb que flanqueia a sequência de exão cobrindo-intrónica. detalhes Primer (sequência, temperatura de fusão e tamanho amplicon) são fornecidos na Tabela S1. Cada amostra de ADN genómico (total de 25 ng) foi amplificada por 32 ciclos em 10 ul de volume total de reacção em cadeia da polimerase (PCR) contendo iniciadores específicos (0,2 mM), dNTP (0,2 mM), MgCl2 (1,5 mM); GoTaq polimerase de ADN (0,75 L) em tampão de PCR 1x (Promega, Madison, WI, EUA). Os produtos de PCR foram purificados por tratamento com 5 U de exonuclease I (Exo-1) e 2 U de fosfatase alcalina de camarão (SAP), juntamente com tampão 1x a 37 ° C durante 2-3 horas, seguido de inactivação pelo calor das enzimas a 85 ° C durante 20 minutos. Após o tratamento Exo-SAP, os produtos de PCR foram diluídos a 15 ng /mL de concentração. PCR especificidade do produto, quantidade e qualidade foram analisados ​​por electroforese em gel de agarose a 1,2%. sequenciação bi-direccional dos produtos de PCR foi realizada a facilidade genómico núcleo (RPCI, Buffalo) utilizando ABI 3130XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems, CA). Os dados foram analisados ​​usando o software de análise de sequência e verificado por exame visual das variantes identificadas em electrofograma.

O alelo-específico Genotipagem de C1744T mutação em amostras de tumor

Nós desenvolvemos uma base de PCR alelo-específico método de genotipagem para avaliar a mutação não-sinónimo identificado por sequenciação directa de

gene GRM1 Restaurant at C1744T (582 Pro Ser) posição na linha de células E006AA. Para a amplificação bidireccional de esta mutação específica, quatro iniciadores foram desenhados (Tabela S1, números de iniciadores de 19 a 22), dois iniciadores externos e dois iniciadores internos específicos de alelo (AS) com a sua especificidade 3’final para cada alelo (C T). C-alelo é amplificado em uma direcção com um iniciador COMO interior e um par de iniciadores externos (# 19 e # 20; tamanho amplicão 439 pb), enquanto mutante alelo T é amplificado na direcção oposta, com o outro par de iniciadores interno e externo (# 21 e # 22; tamanho amplicon 297 pb). Os dois iniciadores externos também amplificar um fragmento constante (# 20 e # 22; tamanho amplicon 736 pb), que servem como controlos positivos para PCR. Todos os quatro iniciadores foram utilizados na reacção de PCR único e as condições foram optimizadas através do ajuste da concentração de cada um dos iniciadores e temperaturas de recozimento (Tabela S1). Em cada conjunto de reação de PCR, que incluiu uma amostra de controlo negativo para observar a eficiência do AS-genótipo positivo e.

análise bioinformática de Identifica Novel

GRM1

Mutações

mutações Novel identificados no

GRM1

foram testados bioinformatically para diferentes possíveis efeitos sobre a estrutura da proteína, função e variante local de splicing. O efeito da mutação missense (serina para prolina) em 582 posição aa foi testada usando ferramentas on-line; (I) PolyPhen2 (https://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/) [19], (ii) Peneirar (https://sift.jcvi.org/) [20], e (iii) Phd- SNP (https://gpcr2.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/PhD-SNP/PhD-SNP.cgi) [21].

Para prever a consequência potencial estrutural da mutação identificada no exon -intron junções de exon-8 em

gene GRM1

, foram utilizados dois diferentes ferramentas de bioinformática on-line: (a) splicing Humano Finder (https://www.umd.be/HSF/) [22] e ( b) ESEfinder (https://rulai.cshl.edu/tools/ESE/) [23]. sequência de ADN que compreende tipo selvagem ou alelo mutante foi usado como uma consulta na ferramenta Human Splice Finder para prever o local dador de splicing ou receptor.

Resultados

identificação de novos

GRM1

mutações e SNPs em linhas celulares de cancro da próstata

O sequenciamento dos exons inteiras de

gene GRM1

em 10 linhas de células CaP apresentou 18 alterações genéticas que incluem a recém-identificadas mutações não sinónimas, variações emenda do local, não sinónima, sinônimos, e não codificante polimorfismos (Figura 1 e 2; Tabela 1-2). Uma nova mutação não sinónima em C1744T (582 Pro Ser) posição do exão-8 foi detectada em E006AA, uma linha de células AA-PCA principal (Figura 1). Esta mutação foi apareceu no estado heterozigoto (CC CT) e localizado perto de transmembrana domínio em extra de lado celular do receptor GRM1 e resultou em prolina (aminoácido hidrofílico, códon-CCT) para serina (aminoácido neutro, códon-TCT) amino mudança do ácido (Figura 2). Em segundo lugar nova mutação foi identificada na junção exão-intrão do exão 8 da-C4-2B, uma linha de castração-resistente CaP de células (Figura 1, Tabela 1). Esta mutação resultou na conversão de G para T no início do intrão-8 e apareceu em condição heterozigótica. Cinco mutações não-codificantes também foram encontrados em 3′-UTR região do exão-9 da

gene GRM1

em duas linhas diferentes CaP celulares (LAPC4 e MDA-PCa2b) (Tabela 2). Uma destas mutações está localizado na 2149 pb a jusante do codão de paragem em LAPC4 e relatado na base de dados NCBI (dbSNP construir 139) como rs41285865. Enquanto outras quatro mutações localizadas em 221 pb, 486 pb, 2664 pb e 2737 pb a jusante para parar códon na linha de células MDA-PCa2b (Tabela 2). Estas mutações relatadas na base de dados NCBI (dbSNP construir 139) como rs362827, rs6918099, rs79394543 e rs362829 respectivamente.

Para além destas mutações, uma missense SNP (rs6923492 ) foi identificado na posição de aminoácido 993 em linhas celulares investigadas. Homozigótica genótipo TT, foi observada em linhas de células de PC-3 22RV1, CWR-R1, e NL-Pr.EC. genótipo heterozigoto TC foi descoberto em linhas de células MDA-VCaP PCa2b e, eo genótipo homozigoto CC em E006AA, DU-145, LAPC4, C4-2B, linhas de células LNCaP. Neste locus, mudança de T para nucleotídeo C resultou em Serina (TCC) para prolina de conversão (CCC). Este polimorfismo missense está localizado no domínio citoplasmático do receptor de GRM1 entre o domínio transmembranar e motivo de espiral enrolada (Figura 2). Quatro polimorfismos sinónimas previamente relatados foram também identificadas na sequência do exão 9-em 931 (rs2942), 1056 (rs6923864), 1071 (rs1047006) e as posições de aminoácidos 1165 (rs9373491) (Tabela 1) que codifica. Seis SNPs não-codificantes foram encontrados em 3′-UTR de

GRM1

gene e esses polimorfismos estão localizados em 637 pb (rs362819), 1277 bp (rs3804294), 1278 bp (rs3804293), 1369 bp (rs362820) , 2392 bp (rs362821) e 2616 pb (rs362822) a jusante para parar códon (Tabela 2).

Identificação

GRM1

Mutações e SNPs em Prostate Cancer tecidos

Sequencing de exons-8 selecionados e -9 de

gene GRM1

em tecidos tumorais de próstata mostrou várias alterações genéticas. Um estado genótipo homozigoto (genótipo CC) em comparação com o genótipo heterozigótico (CT genótipo) no tecido normal adjacente a 637 pb a jusante (rs362819) ao codão de terminação foi encontrado em um tumor AA (amostras N38-T38, Quadro 3). Outros dois genótipos (CC e GA) foram encontrados na região 3′-UTR apenas em amostras de AA na posição 221 pb (rs362827; N2-T2) e 486 pb (rs6918099; N6-T6, N32-T32 e T38-N38) a jusante ao codão de paragem. No entanto, estas alterações eram de origem da linha germinativa. Uma vez que o genótipo heterozigótico (GA em rs6918099) a 486 pb a jusante de codão de terminação foi encontrado em 3 dos 11 AA, que parece ser um genótipo específico-étnica. O genótipo homozigoto CC (rs362827) que existe apenas em um único AA-paciente pode ser uma mutação germinal esporádica ou uma variante rara.

Semelhante aos dados linha de células de sequenciamento, identificamos um polimorfismo missense ( rs6923492) na posição de ácido 993 amino serina levando a prolina mudança de aminoácidos e foi observada em 7 de 10 AAs (N2-T2, N26-T26, N27-T27, N32-T32, T62, T25, T11) e 5 de 11 CAS (N3-T3, N5-T5, N21-T21, T20, T34) tecidos (Tabela 3). Um SNP não-codificante (rs362819) foi encontrada em 637 pb a jusante de codão de terminação. O status de genótipo por estes SNPs em tecidos tumorais foi mesmo para o tecido normal adjacente, indicando polimorfismos da linha germinativa (Tabela 3). Dois polimorfismos sinônimo também foram encontrados no exão-9 em ambas as populações AAs e CAS. Estes foram localizado na 931 posição do aminoácido (rs2942) eo código de resíduo de lisina, enquanto outro polimorfismo sinónimo localizado na 1056 posição do aminoácido (rs6923864) de código para resíduo de glicina.

Usando o alelo-específico (AS) iniciadores de PCR e sequenciação directa em tecidos tumorais do normal combinados, nós genotipados a mutação não-sinónimo recém-identificado na C1744T (582 Pro Ser) posição (em E006AA) ea mutação na junção exão-intrão do exão-8 (em C4-2B) . Estas mutações não foram detectados em nenhum dos tecidos prostáticos malignos (Figura 3).

Presença de C-alelo mostraram a amplificação de um fragmento de 439 pb e a presença de T-alelo mostraram a amplificação de um fragmento de 267 pb. Um fragmento não específico de 706 pb foi amplificado em todas as amostras.

Funções previsto da Identificado

GRM1

mutações

A previsão do papel funcional do romance não sinónima (582 Pro Ser) mutação identificada no

GRM1

foi realizada utilizando ferramentas diferentes. PolyPhen-2 previu um Bayes probabilidade posterior valor de pontuação deletéria 0,60 para esta mutação. Esta pontuação predição é baseada em alinhamento múltiplo de sequências com a sequência homóloga deste gene na base de dados e indicam que a mutação afecta a estabilidade da proteína ou a sua função

.

analisada independentemente, Triagem intolerante De tolerantes (SIFT) algoritmo também previsto um valor de pontuação intolerância 0,02 para substituição de aminoácidos identificados neste locus. Com base na conservação da sequência de proteína ao longo da evolução, peneire previu que 582 Pro Ser substituição de aminoácidos pode também afectar a função da proteína. Além disso, utilizamos o método PhD-SNP que utiliza técnica de banco de dados e aprendizagem de máquina disponível relacionada com a doença SNP de prever nsSNP relacionada à doença humana. Esta análise revelou doença relevantes do 582 Pro mutação Ser com um valor de índice de confiabilidade de 3.

Uma vez que mutações pontuais no exon-intron ou junção intron-exon pode levar a exão escorregar ou splicing alternativo, estávamos interessado em analisar o efeito potencial da nova mutação descoberta na junção exão-intrão do exão 8 da linha de células C4-2B. Para isso, foi utilizada a emenda do Finder Humano (HSF) e Exon emenda Enhancer (ESE), ferramentas de localizador de prever as consequências sobre o motivo local de união com dois alelos diferentes de mutação identificados [22], [23]. Descobrimos que a presença do alelo T prediz fortemente a possibilidade de o motivo de dador de splicing (caaGtgagt) com um valor elevado de consenso 88,26. No entanto, a substituição de T para G-alelo resultou na perda deste motivo de splice dador (Figura 4A e 4B). Da mesma forma, o ESEfinder previu uma alta pontuação (9,49) motivo (potenciador exônico-splicing) para a sequência com G-alelo no exão junção 8-intron do gene

GRM1

. No entanto, esta pontuação reduzida a -7,52 para a sequência mutante com motivo alelo T.

Vinte uma sequência de pares de bases que flanqueia do local de mutação com o tipo selvagem (A) e do alelo mutante (B) foi testada para a predição de splicing motivo local (dador ou aceitador).

Discussão

sinalização GRM1 tem sido implicado em vários cancros malignos, incluindo o adenocarcinoma do cólon, melanoma, carcinoma do pulmão, carcinoma da tiróide, carcinoma da mama, astrocitoma, neuroblastoma e rabdomiossarcoma [4], [5], [24]. receptor de glutamato ganhou um interesse particular dado o seu potencial de transformação e a disponibilidade do seu ligando, glutamato, no contexto do microambiente tumoral e facilmente a acessibilidade do receptor na superfície de células tumorais. A expressão diferencial, estado de activação ou reprogramação de sinal do receptor de glutamato nas células tumorais podem contribuir para o desenvolvimento e progressão do câncer. Estas alterações podem resultar de alterações específicas, incluindo somático e alterações genéticas germinativas, copiar número variação, epigenética, e as alterações pós-translacionais, resultando em expressão alterada ou ativação e aumentando assim a progressão de tumores e metástases [25]

.

sequenciamento profundo estudos têm mostrado que o receptor acoplado a proteína G (GPCR) são mutados em aproximadamente 20% de toda a família dos receptores de glutamato do cancro e representam um segundo membro da família GPCR mais frequentemente mutado [26]. Mutações somáticas em

GRM1

tem sido relatada em largas variedades de tumores, tais como melanoma, carcinoma da mama, carcinoma do cólon, adenocarcinoma do pulmão, tumores cerebrais, heamatopoitic, e tecido linfóide [15].

gene GRM1

composto por diferentes domínios com funções específicas, incluindo de ligação ao ligando de domínio, domínio rico em cisteína para a dimerização, transmembranar e um domínio C-terminal de interação com moléculas de sinalização a jusante. As mutações nestes resíduos conservados pode desempenhar um papel possível na ligação de receptor de ligando com GRM1, sinalizando a iniciação, a transmissão de sinal, ou terminação ou ganho de fenótipos funcionais. Estas mutações podem envolver não só no desenvolvimento e progressão do tumor, mas também afecta a metástase incluindo a motilidade e a promoção de angiogénese celular.

Estudos anteriores demonstraram que as mutações em diferentes proteína-G receptor acoplado, CCK2R GRM1 e estão associados com alterada a função do receptor, vias de sinalização a jusante, morfologia celular alterada, migração, e promover a angiogénese, levando a tumerogenesis reforçada [15], [27]. Esseltine

et al

estudaram o papel funcional do

GRM1

mutações situado no local do glutamato-ligação (A168V), de ligação do glutamato de domínio (R375G), rica em cisteína região (G396V), G- região (R696W) ligação às proteínas, e homer região de ligação (P1148L) na cauda carboxi-terminal do receptor de GRM1 [15]. A expressão transitória do mutada

GRM1

foi associado tanto a expressão de superfície celular reduzida ou basal /activação estimulada por quisqualato de fosfato de inositol (IP) e /ou a activação de ERK1 2 /[15]. A mutação na região de ligação de Homer (P1148L) foi mostrado para alterar a morfologia celular e pode afetar a migração celular.

Apesar de múltiplas mutações têm sido relatados em

gene GRM1

em diferentes cancros humanos [4], apenas um número limitado de estudos de alto rendimento, incluindo análise de sequenciação exome ou transcriptoma todo foram realizados e identificados alguns

GRM1

mutações em amostras de CaP [28], [29]. Duas novas mutações (R868H e G144S) em

GRM1

(Tabela S2) foram identificados por sequenciação dos exomes da ACP-resistente catrate 50 letal, amostras de CaP de órgãos-confind primários 11 de alto grau (tratamento naïve) e 11 linhas celulares de CaP [29]. Exome sequenciamento de 112 tumores de próstata pares /normal identificadas duas mutações missense (A573E e R681H) no gene

GRM1

[28]. A mutação nonsense também foi relatado no exon-2 de

GRM1

gene. (TCGA: https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)

exome ou sequência transcriptoma a análise tem suas limitações inerentes, incluindo a incapacidade de detectar mutações nas junções exão-intrão ou região não codificante e a necessidade de prosseguir a validação experimental das mutações identificadas [28]. Além disso, estes estudos não incluem as amostras AA-tumorais ou as suas linhas de células. Devido a estas limitações, podemos rastreados, pela primeira vez, toda a região de exônico

gene GRM1

incluindo flanqueamento 5 ‘e 3’ UTRs e as junções exão-intrão em dez linhas de células CaP vulgarmente utilizados, incluindo o dois estabelecidas linhas AA-PCA celulares (E006AA e MDA-PCa2B), e 21 da próstata tecidos combinados tumorais do normal de 11 CAs e 10 AAs pacientes.

neste estudo, identificamos duas novas mutações no E006AA e C4 linhas celulares -2b. Estas mutações não foram identificados em estudos anteriores com base na sua concepção do estudo ou as linhas de células incluídas para sequenciação [29]. mutação não sinónima (C para T) na posição de aminoácido 582 resultou em prolina para serina mudança. Esta mutação está localizada perto do domínio transmembranar no lado extracelular. previsão de Bioinformática do papel funcional desta mutação, usando várias ferramentas analíticas, mostrou a conversão da hidrofílica (Serina) para neutro (Proline) aminoácido é ou intolerantes ou leva a efeito deletério para a estabilidade e função da proteína. Uma conversão de serina de aminoácido prolina, também pode afectar a força de transmissão de sinal após a ligação do ligando e a activação do receptor GRM1. Outra mutação identificada na fronteira exão-intrão de

GRM1

exão-8 na linha de células C4-2B.

análise bioinformática utilizando duas ferramentas on-line diferentes previu que G para T conversão de nucleotídeos nesta posição resultou em perturbações do sítio de splicing dador. Rompimento de motivo splicing local na junção exon-intron no exon-8 posição pode fornecer a base para a criação de diferentes variantes de splicing no gene

GRM1

. Várias isoformas da

gene GRM1

com comprimento de proteína diferente estão associados com ativação diferencial de sinais a jusante, quer através de mudanças na intensidade do sinal ou interacção com outras proteínas citosólicas [30]. Mais estudos são necessários para validar o papel funcional de novas mutações no gene

GRM1

identificados neste estudo e aqueles por outros investigadores [28], [29]. Quatro mutações adicionais foram identificados em células MDA-PCa2b e uma mutação na linha celular LAPC4 situado em 3′-UTR de

GRM1

gene e estas mutações têm sido relatados na base de dados NCBI (dbSNP Construir 39) em diferentes populações. Estas mutações ocorreram como alterações germinativas em amostras de tumores investigados e observou-se que a frequência destas mutações é rico em amostras de tumores AA em comparação com CAs. Alta frequência destas mutações observadas em amostras AA pode associar com diferencial

GRM1

expressão e função, o que pode resultar na progressão ou mais da gravidade da doença. população AA mostrou uma alta taxa de incidência e mortalidade e apresenta uma doença clinicamente mais agressivos do que CAs. O papel funcional destas mutações não tem sido relatado na literatura [31]

Um polimorfismo missense (rs6923492 T C). Identificado no exão-9 de

gene GRM1

em linhas de células APC e tumores serina resultou em mudança de prolina na posição de aminoácido 993 amino na extremidade citoplasmática do receptor. estudo anterior, utilizando 1000 pacientes com câncer de mama mostraram associação deste SNP em ER + /PR + carcinoma ductal in transportadora TT-genótipo com idade mais avançada no momento do diagnóstico (4,9 anos), em comparação com qualquer TC- e portadores CC-genótipo [32]. No entanto, não foi encontrada associação com melanoma susceptibilidade [33]. Um estudo mais amplo amostras de tumor é necessário para confirmar a associação deste SNP com a susceptibilidade à carcinogênese de próstata, agressividade e progressão.

Conclusões

Neste estudo, identificamos novas mutações em

GRM1

gene para além de mutações anteriormente relatados e os SNPs em linhas de células APC e também em um subconjunto de tecidos prostáticos malignos. Estas novas mutações foram preditos a desempenhar um papel importante na função do gene, incluindo a estabilidade da proteína e o splicing de diferentes isoformas. validação funcional destas mutações irá reforçar ainda mais o papel de alterações genéticas de

gene GRM1

na carcinogênese da próstata e progressão.

Informações de Apoio

Tabela S1.

Detalhes dos iniciadores utilizados para a sequenciação do gene

GRM1

. sequências genómicas de iniciadores utilizados para PCR e sequenciamento de acordo com a Assembleia Genoma Humano (

GRM1

adesão gene # NM_000838.3)

doi: 10.1371. /journal.pone.0103204.s001

(DOC )

Tabela S2.

Detalhes de mutações somáticas no

gene GRM1

identificado em exome ou sequenciamento do transcriptoma inteiros estudos de linhas celulares de cancro da próstata e tumores

doi:. 10.1371 /journal.pone.0103204.s002

( DOC)