Abstract

Os avanços nas áreas de células cancerosas de iniciar e de alto rendimento

in vivo

telas shRNA têm destacado a necessidade de observar o crescimento de células tumorais em modelos de câncer ao nível clonal . Enquanto

in vivo

câncer heterogeneidade crescimento celular em xenoenxertos foi descrito, ele ainda tem de ser medido. Aqui, nós testamos uma abordagem para quantificar a heterogeneidade crescimento clonal de células cancerosas em modelos de xenoenxerto subcutâneo do rato. Usando um método de sequenciação de alto rendimento, seguimos o destino

in vitro Comprar e

in viv

o de dez mil HCT-116 células individualmente marcadas com um código de barras único entregue por transdução lentiviral. Embora o crescimento

in vitro

era menos homogênea do que o previsto, ainda encontramos que 95% das células finais derivados de 80% das células originais. Em xenoenxertos, no entanto, 95% das células recuperadas com código de barras originado a partir de apenas 6% das células inicialmente injectados, um termo que efeito de “dominância clonal”. Observamos esse domínio clonal em dois modelos de xenotransplante adicionais (MDA-MB-468 e A2780

cis) e em duas estirpes hospedeiras diferentes (NSG e Nudez). Por forma precisa e reprodutível quantificar o crescimento de células de cancro clonal

In vivo

, descobrimos que um pequeno subconjunto dos clones representa para a grande maioria das células descendentes, mesmo com HCT-116, uma linha de células relatado que falta um tumor -initiating compartimento. O estocástico

in vivo

processo de seleção que descrevemos tem implicações importantes para os campos de

in vivo

shRNA de triagem e de tumor células que iniciam

Citation:. Nolan-Stevaux O, Tedesco D, Ragan S, Makhanov H, Chenchik A, Ruefli-Brasse A, et al. (2013) A medição da heterogeneidade Cancer Cell Crescimento através de Lentivirus Barcoding Identifica Dominance Clonal como uma característica do

In Vivo

Tumor enxerto. PLoS ONE 8 (6): e67316. doi: 10.1371 /journal.pone.0067316

editor: Dean G. Tang, da Universidade do Texas M.D. Anderson Cancer Center, Estados Unidos da América

Recebido: 05 de fevereiro de 2013; Aceito: 16 de maio de 2013; Publicação: 26 de junho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Nolan-Stevaux et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. Cellecta, Inc. foi um fornecedor de bibliotecas de shRNA lentivirus para este estudo e é o empregador de Donato Tedesco, Mikhail Makhanov e Alex Chenchik. Olivier Nolan-Stevaux, Seamus Ragan, Astrid Ruefli-Brasse, Kim Quon e Paul D. Kassner são empregados pela Amgen. Este estudo foi financiado pela Amgen Inc. Não há mais patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento, como detalhado em linha no guia para os autores.

Introdução

Nos últimos anos, mouse modelos de xenotransplante de câncer foram usados ​​para sondar questões fundamentais da biologia do tumor tão diversas como a existência de células cancerígenas iniciar ou a viabilidade de identificar genes novo alvo cancro utilizando

In vivo

shRNA abordagens de rastreio de abandono. Em ambos os campos, no entanto, relativamente pobre compreensão da dinâmica do crescimento de modelos de xenoenxerto causado confusão.

Primeiro, os resultados obtidos em experiências de diluição em série, em que um número muito baixo de células cancerosas são injectados por via subcutânea em murganhos foram utilizados para apoiar [1], [2] ou refutar [3], a existência de células de cancro iniciar raros dentro piscinas heterogéneas de células cancerosas em tumores sólidos [4]. No entanto, as células cancerosas em tumores não existem por si mesmos, mas são cercados por outras células cancerosas. Assim, se algumas células cancerosas são injectadas num rato e não conseguem crescer, pode reflectir a falta de cancro potenciais de iniciação; ou mais prosaicamente, o fato de que eles não estavam em um ambiente ideal, cercado por outras células cancerosas (iniciando tumor ou não). Acompanhando o comportamento das células cancerosas iniciar putativos cercados por células putativos iniciar não-cancerosas clarificaria muito necessária.

Em segundo lugar, as metodologias que utilizam bibliotecas reunidos de vetores de lentivírus que codificam centenas de gatilhos shRNA foram pioneira para identificar romance potencial genes promotores de câncer

in vivo

[5], [6]. No entanto, enquanto

in vitro

reunidas shRNA telas drop-out (para um exemplo recente, ver [7]), e

in vivo

reunidas telas de enriquecimento shRNA visam identificar tumor-supressores ou crescimento mecanismos inibitórios foram bem sucedidos [8], [9],

in vivo

shRNA telas de abandono não têm sido amplamente replicado. Aqui também, uma melhor compreensão da heterogeneidade crescimento em modelos de xenoenxerto iria ajudar a interpretar e prever os resultados de tais abordagens de rastreio. Notavelmente, enquanto heterogeneidade fenotipica espacial tem sido documentada em modelos de xenoenxerto de cancro [10], [11], a heterogeneidade crescimento de células cancerosas em modelos de xenoenxerto clonal nunca foi medida.

Aqui, utilizou-se um método de código de barras lentiviral marcação com precisão e simultaneamente medir as características de crescimento de milhares de células cancerosas individuais dentro de um conjunto de células cancerosas não marcados crescido

in vitro

ou subcutânea injetados

in vivo em ratinhos

severamente imunodeficientes. Nossos resultados demonstram a notável crescimento heterogêneo de células cancerosas em vários modelos de xenotransplante, em que um pequeno número de clones de células cancerosas individuais demorar mais de uma população de células inicialmente uniformemente distribuídos e heterogêneos, um efeito que chamamos de “dominância clonal”. Como resultado de nossas observações, propomos um novo método de rastreamento de células clonal para contornar o efeito de confusão de dominância clonal no contexto do pool

In vivo

shRNA telas de abandono. Nós também recomendamos a utilização deste método para medir a contribuição do câncer putativo células que iniciam sub-populações, não isoladamente, mas dentro de uma população de células de câncer heterogêneo.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética e rato Strain

os ratos foram tratados de acordo com o

Guia para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório, 8

th

Edição do Instituto Nacional de Saúde. Os animais foram alojados em uma instalação internacional credenciada pela Associação de Avaliação e Acreditação do Laboratório Animal Care (AAALAC), em habitação micro-isolador ventilado. Os animais tiveram

ad libitum

acesso a alimentação e água através do sistema de rega automático. Os animais foram mantidos num 12 h: 12 h luz: ciclo escuro, em salas de temperatura de 22 ° C e 45% de humidade. Nosso plano de protocolo de pesquisa e alojamento dos animais foram aprovados pela Amgen South San Francisco Animal Care Institucional e Comitê de Uso (Amgen South San Francisco IACUC, Protocolo # 2011-01108). NOD fêmea de oito semanas de idade /SCID IL2RG ratos (NSG) (Jackson Laboratories estirpe # 5557) e os ratos pelados atímicos fêmea 10 semanas de idade (Charles River estirpe # 490) foram utilizados neste estudo.

Lentivirus Biblioteca Determinação título por FACS

o título da biblioteca de lentivírus reunido foi determinado directamente em células HCT-116 por FACS medição da percentagem de células positivas mCherry a partir de uma diluição de série da piscina lentiviral. Resumidamente, as titulações da piscina lentiviral foram adicionados a 1,5 × 10

5 HCT-116 células em meio de crescimento (5A de McCoy, 10% FBS) contendo DEAE dextrano (MP Biomedicals, Catalog # 195133) a 10 ug /mL. As células foram expostas ao virus durante 16 horas e meios infecção foi aspirado e substituído com meio de crescimento completo sem DEAE dextrano. As células permaneceram em cultura durante mais 48-72 horas e foram tratadas com tripsina, lavadas com PBS da Dulbeco, e fixadas em solução de paraformaldeído a 2%. As células fixadas foram analisadas para a percentagem de células positivas mCherry por FACS (Becton Dickinson LSRII). A multiplicidade de infecção (MOI) e titulação, expresso como unidades de transdução por ml (TU /mL), foram determinados a partir da percentagem de células transduzidas e o volume de estoque de lentivírus utilizado. O MOI foi determinada pela primeira vez usando a equação% transduzidas células = 100 * (1- e

– (MOI)) eo valor título foi determinada utilizando o título equação = [MOI × células # à infecção] /vol (ml de vírus) = TU /mL [12] – [15]. Por esta piscina viral, 10 uL de vírus resultou em 12,9% de células positivas mCherry e o título de calculado de 2 × 10

6 TU /ml foi usado para determinar o volume apropriado de vírus para experiências subsequentes para MOI seleccionada do.

Cálculos da transdução Eficiência e Número de Lentivirus inserções por celular

são esperados partículas de vírus para distribuir aleatoriamente em células individuais e a percentagem de células infectadas a uma MOI dada (em que MOI = transduzir Unidades /célula) pode ser estimada por uma distribuição de Poisson, onde a percentagem de células infectadas é igual a 100 * (1- e

– (MOI)) (Tabela 1). A probabilidade de qualquer número de partículas de vírus numa dada célula é, assim, dada pela equação de Poisson p (v) = (M

ve

-v) /v !, em que M = MOI e v é a número de viriões infecciosos na célula. Estas fórmulas podem ser usadas para calcular a título de uma piscina viral numa dada linha de células e uma estimativa da percentagem de células infectadas com qualquer número de viriões (Tabela 2).

Lentivirus Infecção Processo para KE-U6 TET-Library no HCT-116

células HCT-116 (linha celular do cancro do cólon – ATCC # CCL-247) com um tempo de duplicação de 21 Hrs. foram cultivadas em meio de crescimento completo [meio de McCoy 5A (Life Technologies # 16600-082), 10% de FBS sistema Tet Aprovado (Clontech # 631101), de 0,1 mg /ml Normocin (Invivogen # formiga-Nr-1)]. KE-U6-tet, uma biblioteca lentiviral contendo 27.500 sequências shRNA código de barras Tet-indutíveis individuais com um título de 2 × 10

6 Transdução Unidades (TU) /ml foi usado em conjunto com 10 ug /ml de DEAE dextrano (MP Biomedicals # 195133) para obter um (MOI) de 0,1, para a qual a probabilidade de infectar uma célula com mais do que uma partícula de Lentivirus é calculada para ser inferior a 5% (Tabela 2) [15]. Resumidamente, 3 × 10

6 HCT-116 células foram re-suspensas em 8,5 ml de meio de crescimento completo, suplementado com DEAE dextrano (10 ug /ml) e transduzidas com 150 ul de biblioteca KE-U6-tet, e incubou-se durante 16 horas, resultando numa população de células de 3 x 10

6 células contendo ~ 3 × 10

5 células infectadas com lentivírus um único e que leva um código de barras individual.

Lentivirus Infecção Processo para a biblioteca de luciferase no HCT-116, MDA-MB-468 e A2870

cis

Uma biblioteca lentiviral contendo 27

luciferase

sequências shRNAs Renilla neutros associados a 2% dos códigos de barras presentes na biblioteca era utilizado a uma MOI de 0,18, 0,17 e 0,15, respectivamente, no HCT-116, MDA-MB-468 (linha celular de cancro da mama – ATCC # HTB-132) e A2780

cis

(cisplatina ovário resistente Linha Cancer Cell – Sigma-Aldrich # 93112517) células. A percentagem projectada de células infectadas com mais do que uma partícula de Lentivirus é calculada para ser inferior a 10% para estes MOI (Tabela 2). Resumidamente, 3 × 10

6 as células foram re-suspensas em 8,5 ml de meio de crescimento suplementado com polibreno (5 ug /ml), transduzidas com a biblioteca de lentivírus, e incubou-se durante 16 horas, resultando numa população de células de 3 × 10

6 células contendo ~ 5 × 10

5 células transduzidas, ~ 90% dos quais estão previstos para estar infectado com um único lentivírus e carregando um único código de barras (Tabela 2).

In vitro

Experiment

16 horas após a transdução com a biblioteca KE-U6-TET, amostras de 10

5 HCT-116 células contendo ~ 10

4 células marcadas individualmente foram semeadas em triplicado, em balões de cultura celular T175 e crescidas continuamente durante 8 dias em meio de crescimento completo, com reabastecimento meios de comunicação a cada 2-3 dias. Para cada

in vitro

replicar, todas as células de cada frasco T175 foram utilizados após a colheita no dia 8 para o isolamento de ADN genómico.

NSG Xenoenxerto Experiment

16 h pós transdução com a biblioteca KE-U6-TET, amostras de 10

5 HCT-116 células contendo ~ 10

4 células marcadas individualmente foram misturadas com 3 × 10

6 células não transduzidas HCT-116 e novamente suspensas em 200 ul de PBS: solução 1:01 Matrigel (BD Bioscience # 356235) antes da injecção subcutânea em ratos do sexo feminino de idade NSG 8 semanas (stock # 005557, laboratórios Jackson). Cada xenoenxerto foi deixada a crescer durante 12 dias até que o tumor subcutâneo resultante atingiu um tamanho de -500 mm

3. Neste ponto, os tumores foram colhidos para o isolamento de ADN genómico.

Experiências Nude de Xenoenxerto

16 h pós-transdução com a biblioteca de luciferase, 3 × 10

6 (células HCT-116, MDA-MB-468 ou A2780

cis) foram novamente suspensos em 200 mL de 01:01 PBS: Matrigel solução (BD Bioscience # 356235) antes da injecção subcutânea em 10 semanas ratos fêmea nu de idade (stock # 490, Charles River Laboratories). HCT-116 e A2780

cis xenoenxerto foram deixadas a crescer durante 14 dias e MDA-MB-468 durante 24 dias até que o tumor subcutâneo resultante atingiu um tamanho de -500 mm

3. Neste ponto, os tumores foram colhidos para o isolamento de ADN genómico.

Tet Repressão de shRNA Expressão na Ausência de doxiciclina e indução com doxiciclina

A eficácia do elemento repressor TET no vector foi avaliada sobre uma experiência de 15 dias. Três infecções independentes de 9 × 10

7 células HCT116 em meio de crescimento (5A de McCoy, 10% FBS) contendo DEAE dextrano (MP Biomedicals, catálogo # 195133) a 10 ug /ml foram realizadas com a biblioteca de shRNA 27,5 K num MOI = 0,3 em Corning celular Stack 10 navios (catálogo # 3271). Para maximizar a representação da biblioteca, cada um shRNA foi introduzido em células ~1000 independentes. Após 24 horas, meio de infecção foi aspirado e substituído com meio de crescimento completo com 2 ug /mL de puromicina (Invivogen, catálogo # formiga-PR-5) para iniciar a selecção de células infectadas. 72 horas após a transdução, um agregado de células de ~ 9 × 10

7 células foram coletadas para referência para cada triplicado infecção (Dia 0 da amostra). 9 × 10

7 células foram re-semeadas e mantidas em cultura com meio completo com 2 ug /mL de puromicina. As células foram passadas a intervalos de 3 dias para 15 dias, sementeiras 9 × 10

7 células e manter a pressão selectiva com puromicina para a duração da experiência. Os sedimentos de células para amostras em triplicado a partir de dia 0 e 15 foram submetidas a sequenciação de ADN dos códigos de barras por sequenciação de alto rendimento. As células em que foi induzida foram tratados após a re-semeadura 9 × 10

7 células no dia 0 com doxiciclina (Sigma-Aldrich, catálogo # D-9891) a 0,5 ug /ml para 15 dias.

Recuperação e quantificação dos códigos de barras

as sondas foram preparados para sequenciamento de alto rendimento em Illumina HiSeq2000 seguindo o protocolo do Cellecta (https://www.cellecta.com/resources/protocols). O conjunto de códigos de barras utilizados para a construção da biblioteca consistia em 27.500 de 18 nucleotídeos códigos de barras longas individuais, perfeitamente equilibrado em AT /GC e purina /pirimidina, projetado usando um algoritmo Cellecta proprietário. distância de Hamming mínima entre códigos de barras no conjunto é 4, portanto, até 3 mutações em uma sequência de 18 nucleotídeos podem ser detectados e os códigos de barras danificados rejeitado, proporcionando nível de protecção adequado para a precisão atual de tecnologia de seqüenciamento Illumina. números de identificação de código de barras foram codificados na sequência de código de barras usando o sistema numérico quaternário (A-0, T-1, G-2, C-3), os procedimentos por forma de alinhamento para deconvolução de código de barras não eram necessários. Usando o algoritmo de conversão de Cellecta, números de identificação de código de barras foram extraídos de cada código de barras correto e a abundância de cada código de barras na amostra sequenciada medido. Com este procedimento, a complexidade do cálculo não é dependente da complexidade da biblioteca. A complexidade é O (n) foram N é o número de leituras nas sondas sequenciados. arquivos FASTQ e qseq da máquina de Illumina HiSeq2000 foram utilizados na análise.

Clone Tamanho Estimativa

Para cada amostra, o número de contagens de código de barras equivalentes a uma célula transduzido single foi calculado com base no total de número de contagens de código de barras na amostra e o número total de células transduzidas na amostra (o último estimado de acordo com a recuperação de ADN genómico e de transdução de MOI, e confirmada por um rendimento de sonda de PCR). Para estimar o tamanho de cada um dos clones na população de células transduzidas (número de células que transportam o mesmo código de barras), a contagem de código de barras foram então normalizados para a contagem de código de barras de uma única célula calculada.

Resultados

Medição o Clone Taxa de Recuperação

in vivo

a fim de rastrear clones originados por células individuais dentro de uma população de células de câncer, nós infectado HCT-116 células de câncer colorretal com uma biblioteca lentiviral contendo 27.500 independente shRNA induzível sequências, cada um associado com um código de barras 18 nucleótidos individuais. Nós infectado 3 × 10

6 HCT-116 células a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,1. Sob estas condições de infecção, a análise da distribuição de Poisson prever um número mínimo de eventos infecção dupla ( 5% de células transduzidas) [15] (Tabela 2). A transdução produziu ~ 3 × 10

5 células individualmente códigos de barras (Tabela 1). Três séries de 10

4 HCT 116 células com código de barras (10

5 células totais dado um MOI de 0,1) foram cultivadas em cultura

in vitro Compra de 8 dias ou cerca de 9 duplicações da população. O ADN genómico a partir dos três bancos de células cultivadas

In vitro

código de barras foi submetido a sequenciação de alto rendimento e o (número de células) o tamanho de cada clone detectado na população transduzidas foi calculada com base no número de vezes que cada barra -Code foi recuperada (Fig. 1).

uma biblioteca lentiviral contendo 27.500 códigos de barras único foi utilizado para transduzir as células HCT-116 a uma MOI de 0,1. Piscinas de 10

5 células, correspondentes a 10

4 células marcadas individualmente ou foram misturados com 3 × 10

6 células e implantadas subcutaneamente em ratos NSG ou cultivadas em cultura

in vitro

. As células foram colhidas após 9 dias e tumor removido após 12 dias, e as preparações de ADN total de células ou tumores foram submetidos ao procedimento de recuperação de código de barras.

Em paralelo, três conjuntos de 10

4 barcoded as células HCT-116 (10

5 células totais dada uma MOI de 0,1) a partir do mesmo evento inicial transdução virai foram recolhidas 16 horas após a transdução e individualmente misturado com 3 × 10

6 células não infectadas HCT-116 e diluiu-se em 50% de Matrigel, antes da injecção subcutânea no flanco de três ratinhos fêmea NSG severamente imuno-deficientes. Cada xenoenxerto foi deixada a crescer durante 12 dias até que o tumor subcutâneo resultante atingiu um tamanho de -500 mm

3. O DNA genômico a partir dos três tumores de xenoenxerto foi submetida aos mesmos procedimentos de estimativa de recuperação de código de barras e tamanho clone como o

in vitro

amostras (Fig. 1).

O

in vivo

taxa de recuperação clone foi calculada como a razão entre o número médio de clones identificados com código de barras nos três tumores de xenoenxerto e a média do número de códigos de barras-clones identificados nos três populações de células cultivadas

in vitro

, independentemente do clone tamanho (Fig. 1). Conforme apresentado na Tabela 3, a taxa de recuperação de clone observado foi de quase 60% eo número de clones identificados no

in vitro

definição em cada repetição foi muito próximo ao valor previsto de 10

4 clones. É de notar, quando uma suspensão de células contendo Matrigel é injetado por via subcutânea, uma pequena quantidade (~ 10%) do líquido injetado escoa para fora do local de injecção, sendo responsável por uma fração dos códigos de barras perdidas no

in vivo

definição.

In vivo

“Dominance clonal” dentro HCT-116 xenoenxertos

Para avaliar e comparar a forma como as células com código de barras divididas

in vitro

e

in vivo

, analisamos a distribuição de seus códigos de barras de acordo com a frequência com que foram recuperados por HTS. O conjunto de dados cheio de clones e as contagens de código de barras está disponível (Tabela S1)

Em um primeiro gráfico, analisamos a distribuição clonal de células cultivadas

in vitro

:. Plotamos o número de independente clones (Fig. 2A – barras azuis) ou o número total agregado de células (Fig 2A -. barras de laranja) para cada categoria de tamanho clone ao longo do eixo X. Por exemplo,

in vitro

, havia 2.649 clones independentes de um tamanho que varia entre 512-1023 células, indicando que estes clones na categoria ‘512-1023’ células terem sido sujeitos a uma média de 8 duplicações da população ( Fig 2A -. valor barra azul para o ‘512-1023’ categoria eixo X). Estes 2.649 clones contribuiu com um total de 1,017,216 células descendentes código de barras em cima

in vitro

cultura durante 8 dias (Fig 2A -. Valor barra laranja para o ‘512-1023’ categoria eixo X). Como prova de que

in vitro

crescimento clonal é principalmente homogênea, 95% das células descendentes código de barras encontrado após 8 dias de

cultivo in vitro

foram derivadas de 80% do inicialmente marcado clones e foram contido dentro de categorias clone ‘128-4095’, indicando pelo menos 7 divisões da população.

para cada gráfico, o número de clones independentes (barras azuis) ou o número total agregado de células (barras de laranja) é traçado para cada clone categoria de tamanho ao longo do eixo X. (A) Distribuição de HCT-116 códigos de barras

in vitro

: 80% dos códigos de barras (clones) foram identificados nas categorias “128-255” para “2048-4095”, indicando que 80% das células divididas entre 7 e 12 vezes; 95% das células foram identificadas em categorias “128-255” para “2048-4095”, indicando que 95% das células pertencem os clones derivados a partir de 80% das células originalmente transduzidas, que dividido entre 7 e 12 vezes. Escala para o número de células foi ajustado a 500 vezes para permitir comparações lado a lado de números de clones e do número de células. (B) Distribuição de HCT-116 códigos de barras

em

vivo

: 75% dos códigos de barras são encontradas nas categorias “ausente” para “2-3”, indicando que eles ou não sobreviver em tudo, não se dividem, ou dividida não mais do que uma vez e representou apenas 1% das células marcadas recuperados. No entanto, apenas 6% dos códigos de barras foram localizados nas categorias “64-127” para “16.384-32.767”, indicando que eles divididos entre 6 e 14 vezes; 95% das células acumuladas em categorias “64-127” a “16384-32767”, indicando que 95% das células marcadas são derivadas a partir de 6% dos clones inicialmente códigos de barras que o mais divididas. Escala para o número de células foi ajustado 25 vezes para permitir comparações lado a lado de números de clone e números de celulares.

Em um segundo gráfico, analisamos a distribuição clonal de células cultivadas

In vivo

: nós novamente plotado o número de clones independentes (Fig 2B – barras azuis.) ou o número total agregado de células (Fig 2B – barras de laranja.) para cada categoria de tamanho clone ao longo do eixo X. O

in vivo

distribuições olhar dramaticamente diferente do

in vitro

distribuições.

In vivo

, 75% dos clones agrupados nas categorias de “falta-3 ‘, indicando que 75% das células inicialmente injectado

In vivo

foram submetidos a menos do que duas divisões celulares (Fig. 2B – barras azuis – ‘falta’ ou ‘1’ ou ‘2-3’ categorias). Confirmando que estes clones não cresceu

In vivo

, estes clones representavam apenas 1% do número total agregado de células dentro da população de célula marcada identificada por HTS no tumor resultante. Por outro lado, 6% das células injectadas foram capazes de se dividir mais do que cinco vezes para gerar clones com pelo menos 64 células (Figura 2B -. Barras azuis marcado 6%). Surpreendentemente, esses clones representaram 95% do número total agregado de células dentro da população de células marcado (Fig 2B -. Barras de cor amarela, 95%), demonstrando a heterogeneidade crescimento muito significativo

in vivo

, onde as duas mais abundantemente recuperados clones sozinho (a partir de uma estimativa de 10.000) foram submetidos a 14 duplicações da população e gerou um surpreendente 7,5% das tags de células totais recuperados pela HTS em xenoenxertos. (Fig 2B -. clones e células do ‘16.384-32.767 “categoria)

denominamos este fenómeno “dominância clonal”, em que uma pequena fração das células implantadas

in vivo

dividir muito mais do que a grande maioria dos outros clones e contribuir esmagadoramente para a população de células descendentes. Note-se que estudos anteriores concluíram que a linhagem celular HCT-116 não contém uma célula-tronco ou sub-população de iniciação do tumor (ver discussão).

Excluindo um efeito da Codificado shRNA

in vitro

e

in vivo

o shRNA codificados nos lentivírus são clonados a jusante do promotor U6-TET e são regulados por um Tet-repressor codificado no lentivírus, para garantir a repressão da expressão hairpin shRNA na ausência de doxiciclina. Assim, para a finalidade desta experiência, o conteúdo dos vectores lentivirais foi meramente usado como um sistema de código de barras das células infectadas e não foi previsto para interferir com o crescimento celular. Para assegurar que o shRNA foram codificados não afectar o crescimento celular, que cresceram as células num meio contendo Tet-sistema aprovado FBS, concebido para minimizar de-repressão dos promotores na ausência de doxiciclina. No entanto, para confirmar experimentalmente que a indução shRNA imprevista não afectou a distribuição de códigos de barras, na ausência de doxiciclina, que também comparou a distribuição de códigos de barras contidos na biblioteca KE-U6-tet seguinte HCT-116 transdução no dia 0 e no Dia 15 infecção pós. Para esta experiência, nós transduzidas HCT-116 células com a biblioteca lentiviral KE-U6-TET a uma MOI de 0,3 e células coletadas logo após a infecção (dia 0) ou depois de 15 dias de

in vitro o crescimento

na ausência de Doxiciclina (dia 15) (Fig. 3A). Observou-se uma correlação muito apertado (r = 0,99) entre o número de leituras obtidas para cada código de barras shRNA no Dia 0 e Dia 15 (Fig. 3B). Em seguida, avaliado se as duas distribuições shRNA no dia 0 (Fig. S1A), e Dia 15 (Fig. S1B) foram significativamente diferentes umas das outras utilizando um teste de Kruskal-Wallis Rank Sum teste não-paramétrico e obtido um valor P de 0,972, indicando que não houve diferença estatística entre a ordem de classificação dos diferentes shRNA na população shRNA no dia 0 e no dia 15 (Fig. S1D). Do mesmo modo, não houve alteração na distribuição global de shRNA entre os dois pontos de tempo, conforme estabelecido por um valor-p t-teste de 0,99 (Fig. S1D). Estes resultados indicam que, na ausência de doxiciclina, os grampos shRNA U6-TET-driven não estavam afetando o crescimento ea distribuição de códigos de barras na população de células HCT-116 transduzidas

in vitro

, e, portanto, não deverá ser afectada sua distribuição nos xenoenxertos, desde que os grampos permaneceu não induzido

in vivo

.

(a) uma biblioteca lentiviral contendo 27.500 códigos de barras único foi utilizado para transduzir as células HCT-116 a uma MOI de 0,3 . Depois de 72 horas, de puromicina selecção, as células foram passadas continuamente durante 15 dias, na ausência de doxiciclina. alíquotas Dia 0 e Dia 15 foram obtidos de células e ADN total de ambos os pontos de tempo foram submetidas ao procedimento de recuperação de sequenciação de alto rendimento de código de barras. (B) curva de correlação para o dia 15 de medição contra o Dia 0. shRNA código de barras lê para todas as amostras de todos os pontos de tempo foram primeiro normalizados para 2 × 10

7 lê. Os valores para amostras em triplicado foram em média. No Dia 15, forte repressão da expressão na ausência de shRNA de doxiciclina é evidente nas correlações com a referência Dia 0. Lote de log10 significa normalizada lê para o dia 0 contra dia 15 (de correlação de Pearson: r = 0,99).

Para modelar o que aconteceria se os grampos foram de-reprimido em uma população de células de câncer, também compararam a distribuição de códigos de barras shRNA em células HCT-116 transduzidas no dia 0 e ao 15 ° dia a seguir

in vitro o crescimento

na presença de Doxiciclina (Dia 15 – Dox – a Fig. S1C). Sob estas condições, enquanto a distribuição da população em geral shRNA não foi significativamente afectada (valor-p de um teste t entre as duas populações foi de 0,99), a ordem de classificação dos diferentes códigos de barras shRNA foi profundamente afetada (p-valor de um não PARAMETRIC teste rank-fim Kruskal-Wallis foi de 1,75 × 10

-8 – Fig. S1D). Em seguida, analisamos a distribuição de códigos de barras mais abundantemente identificadas nas três

In vivo

repetições de xenoenxerto (identificado como parte de topo 6% de clones que contribuem para 95% das etiquetas recuperados – ver Fig. 2) para dissipar dois possíveis, mas triviais explicações para o domínio clonal observou-se: (i) a de um viés de representação de código de barras inicial e (ii) o possível efeito de grampos com vazamentos que teria beneficiado alguns clones sobre os outros

in vivo

. Em primeiro lugar, não observamos uma tendência de distribuição de código de barras que teria favorecido os clones que foram recuperados

in vivo

. Os 4.109 códigos de barras shRNA mais abundantes obtidos nos três

in vivo

repetições foram distribuídos ao longo de toda a distribuição da população shRNA e não pode contabilizar o efeito clonal dominância observamos (Fig. 4A). Em segundo lugar, se a expressão com vazamento de grampos shRNA

in vivo

foi um fator na dominância clonal, seria de esperar que os clones que foram selecionados

in vivo

iria codificar hairpins shRNA que favorecem HCT-116 crescimento, ou pelo menos, não são tóxicos para HCT-116. Este não era o caso: um grande número de códigos de barras mais abundantes que foram recuperados

in vivo

(colorido em vermelho na Figura 4B) realmente codificam hairpins shRNA que são tóxicos para HCT-116

in vitro

, uma vez que, na verdade, aglomeram no lado da mão esquerda da curva de distribuição de shRNA, indicando um efeito inibidor do crescimento, após

in vitro

indução por doxiciclina durante 15 dias (Fig. 4B), sugerindo fortemente que estes shRNA grampos não foram desreprimido durante o crescimento do tumor enxertado. Se esses grampos shRNA tóxicos sido furado ou de-reprimida, teriam impedido o crescimento dos clones que os codificados e seu código de barras provavelmente não tenham sido entre os códigos de barras shRNA mais abundantes recuperados

in vivo

.

(a) distribuição dos 4.109 códigos de barras único recuperados o mais abundante dos três tumores de xenotransplante (marcado com linhas verticais vermelhas) ao longo de toda a distribuição da população shRNA na biblioteca shRNA. (B) Detecção de uma grande fracção dos códigos de barras mais abundantes dos três tumores de xenoenxerto (marcado a vermelho) na população shRNA mais tóxico para HCT-116 na indução de doxiciclina

In vitro

por 15 dias (medida por uma proporção Log2 negativa de média ler as contagens para shRNA indivíduo no dia 15 seguinte doxiciclina significa ler as contagens no dia 0).

Dominance clonal é observado em outros modelos de xenotransplante e no outro rato Anfitrião

Para validar ainda mais as nossas observações com linhas celulares adicionais e com uma estirpe hospedeira diferente, nós transduzidas 3 × 10

6 HCT-116, MDA-MB-468 e A2780

células cis em duplicado, em um MOI de