Abstract

MicroRNA (miRNA ou miR) inibição de vias relacionadas oncogênicos tem se mostrado uma abordagem terapêutica promissora para o câncer. metabolismo lipídico e colesterol aberrante está envolvida no desenvolvimento do câncer de próstata e progressão para a fase final da doença. Nós recentemente demonstrado que um factor de transcrio essencial para a lipogénese, esterol reguladora da proteína-1 de ligação ao elemento (SREBP-1), induzida por ácido gordo e a acumulação de lípidos e receptor de androgénio (AR) a actividade de transcrição, e também promoveu o crescimento de células de cancro da próstata e resistência castração . SREBP-1 foi sobre-expresso em cancro da próstata humano e amostras de pacientes resistente à castração. Estes resultados experimentais e clínicos indicam que SREBP-1 é um factor de transcrição potencial oncogénico em cancro da próstata. Neste estudo, foram identificados dois miRNAs, miR-185 e 342, que controlam a lipogênese e cholesterogenesis em células de câncer de próstata inibindo SREBP-1 e 2 expressão e de down-regulação seus genes-alvo, incluindo ácido graxo sintase (FASN) e 3- hidroxi-3-metilglutaril-CoA redutase (HMGCR). Ambos 342 modelos tumorigenicidade inibida, crescimento celular, migração e invasão em cultura de células de câncer de próstata e de xenotransplante de miR-185 e coincidente com o bloqueio da lipogênese e cholesterogenesis. Intrínseca miR-185 e 342 de expressão foi significativamente diminuída em células de cancro da próstata em comparação com as células epiteliais não-cancerosas. Restauração de miR-185 e 342 levou à morte por apoptose dependente da caspase em células de câncer de próstata. Os miRNAs recentemente identificados, miR-185 e 342, representam um novo mecanismo para a terapia do cancro da próstata visando

Citation:. Li X, Chen Y-T, Josson S, Mukhopadhyay NK, Kim J, Freeman MR, et al. (2013) MicroRNA-185 e 342 Inibição de tumorigenicidade e induzir a apoptose através do bloqueio do SREBP metabólica via em células do cancro da próstata. PLoS ONE 8 (8): e70987. doi: 10.1371 /journal.pone.0070987

editor: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 18 de fevereiro de 2013; Aceito: 25 de junho de 2013; Publicação: 09 de agosto de 2013

Direitos de autor: © 2013 Li et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma concessão do Departamento de Defesa (W81XWH-08-1- 0321) e The Cedars-Sinai Garber prémios para a Ciência Câncer (HAB). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

MicroRNA (miRNA ou miR) é uma curta (média de 22 nt), de cadeia simples e que ocorrem endogenamente RNA não-codificante que regula a expressão de genes pós-transcricional por emparelhamento de bases complementares aos 3 ‘regiões não traduzidas (UTR) de alvo ARNm [1], [2]. MiARN controla a expressão de uma estimativa de um terço dos genes codificadores de proteínas envolvidas em processos humanos fundamentais celulares, incluindo metabolismo, diferenciação, o crescimento e a apoptose [2] – [5]. MiARN também tem sido demonstrado que desempenham papéis importantes na doença, em particular cancro [6] – [8]. Certas espécies de miRNA, como miR-20a, 23b, 34a, 126, 145, 146a, 221 e 222, são expressas de forma aberrante no câncer de próstata [9], [10]. Um número de miARNs têm demonstrado contribuir para a iniciação do tumor, o crescimento e a progressão letal [11] – [15]. Estas descobertas fornecem uma base racional para considerar a eficácia das terapias de substituição com base no miARN, com o objectivo de inibir os oncogenes e os seus percursos correspondentes, ou restaurar os genes supressores de tumor.

esterol reguladora proteína de ligação ao elemento (SREBP) é um fator básico hélice-alça-hélice leucina zipper transcrição com importantes funções metabólicas em lipogênese e cholesterogenesis [16], [17]. Três principais isoformas SREBP foram identificados, SREBP-1a, SREBP-1c e SREBP-2 [18]. SREBP-1 controla os genes envolvidos no ácido gordo, lípido e da biossíntese do colesterol [16], [17], enquanto que SREBP-2 regula mais especificamente o metabolismo do colesterol e da homeostase [19]. A desregulação da SREBPs e seus genes alvo a jusante associadas com a lipogénese e cholesterogenesis tem sido implicado no cancro. Exemplos incluem o ácido gordo sintase (FASN), um oncogene metabólica [20], [21], e CoA redutase 3-hidroxi-3-metilglutaril (HMGCR), o passo na biossíntese de colesterol limitante da velocidade; ambas as proteínas têm sido referida como estando envolvida no desenvolvimento e progressão do cancro da próstata [20], [22] – [24]. Observou-se sobre-expressão de SREBP-1 em amostras de cancro de próstata humanas em comparação com os tecidos normais da próstata benigna /[22], e este pode ser mecanicamente relacionado com a progressão de doença androgénio-refractário /resistente à castração [22], [25]. Segmentação da via SREBP-lipogênese-cholesterogenesis aberrante pode levar a novas abordagens para o tratamento do câncer de próstata.

O papel dos miRNAs em SREBP-lipogênese-cholesterogenesis no câncer de próstata permanece obscuro. No presente estudo, foram identificados e caracterizados dois miRNAs cruciais, miR-185 e 342, como reguladores SREBP-lipogênese-cholesterogenesis em células cancerosas da próstata. Tanto o miR-185 e 342 inibiram a expressão de SREBP-1 e SREBP-2 e os seus genes a jusante, e FASN HMGCR, e ainda mais reduzida, os níveis de ácido gordo e de colesterol em células de cancro da próstata. Além disso, ambos os miARNs reduzida expressão do receptor de androgénio (AR), um factor de crescimento e sobrevivência conhecido. Além disso, o miR-185 e 342 suprimiu a tumorigenicidade e o crescimento celular e a apoptose induzida através da activação de uma caspase /via apoptótica mediada por PARP em células de cancro da próstata e ratinhos portadores de tumores da próstata humanos xenoenxerto. Níveis mais baixos de miR-185 e 342 foram encontrados em células de cancro da próstata em comparação com células normais /não-cancerosas epiteliais da próstata. Tomados em conjunto, nós demonstramos pela primeira vez que o miR-185 e 342 desempenhar um papel supressor de tumor através do bloqueio de um mecanismo de lipogênese-cholesterogenesis central.

Materiais e Métodos

linhas celulares de cancro da próstata, Cultura de células e reagentes

linhas celulares de cancro da próstata humano LNCaP (dependente de andrógeno-) e C4-2B, um LNCaP andrógeno-independente sublinha derivado de linhagem [26], foram cultivadas em T-médio (Life Technologies, Grand island, NY) suplementado com 5% de soro fetal de bovino (FBS), 100 UI /mL de penicilina e 100 ug /mL de estreptomicina. Uma linha não-canceroso humano epitelial da próstata célula, RWPE-1 (ATCC, Manassas, VA), foi mantida em meio contendo queratinócitos extracto de pituitária bovina e o factor de crescimento epidérmico humano recombinante (Life Technologies). Todas as células foram mantidas em 5% de CO

2 a 37 ° C. precursores de miRNA humanos, os inibidores de miRNA, ensaio TaqMan miRNA, kit de isolamento Mirvana ™ miRNA e Lipofectamine 2000 foram adquiridos da Life Technologies. As construções de ADN repórter UTR 3 ‘de luciferase de SREBP-1 (HmiT017704-MT05), e de SREBP-2 (HmiT017705-MT05) foram adquiridos a GeneCopoeia (Rockville, MD). CellTiter 96® Aqueous One Solution celular Ensaio de Proliferação (ensaio MTS mitocondrial) e caspase-Glo® 3/7 sistemas de ensaio foram obtidos da Promega (Madison, WI).

miARN Transfecção

transfecção transiente de miARN precursores ou inibidores foi realizada utilizando Lipofectamine 2000 de acordo com o protocolo do fabricante. Human miR-185 (PM12486) e 342 precursores (PM13066), anti-miR-185 (AM12486) e 342 (AM13066) e controle negativo (miR-NC; AM17110) foram utilizados para ensaios

quantitativa. em tempo real transcrição reversa-Reacção em Cadeia da polimerase (qRT-PCR)

o ARN total foi preparado a partir de células utilizando o RNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA) e sujeitos a transcrição reversa por SuperScript® III transcriptase reversa ( life Technologies) segundo as instruções do fabricante. As sequências dos iniciadores utilizados para a análise de PCR estão listadas na Tabela S1. Um arranque a quente a 95 ° C durante 5 min foi seguido de 40 ciclos a desnaturação a 95 ° C durante 15 s, hibridação dos iniciadores a 60 ° C durante 30 s e alongamento a 72 ° C durante 30 s utilizando ABI 7500 rápida real -time PCR System (Life Technologies). Os dados foram normalizados para o rRNA 18S ou GAPDH e representados como a média de três vezes duplicados independentes. Para determinar intrínseca miR-185 e 342 expressão, miARN foi preparado a partir de células utilizando o kit de isolamento de miARN miRvana ™ (Life Technologies). miARN maduro foi quantificada pelo ensaio TaqMan miARN (Life Technologies) de acordo com as instruções do fabricante. Os dados foram normalizados por RNU6B.

Análise Western Blot

Os lisados ​​celulares foram preparados a partir de miR-185, 342, NC (controlo miR-negativo) -transfected ou células cancerosas da próstata não transf ectadas usando um tampão de lise [Tris 50 mM (pH 8), NaCl 150 mM, 0,02% NaN

3, 0,1% de SDS, 1% de NP-40 e 0,5% de desoxicolato de sódio] contendo fluoreto de fenilmetilsulfonilo 1 mM e um cocktail inibidor de protease (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). A concentração de proteína foi determinada pelo ensaio de Bradford usando Reagente Coomassie Além disso Proteína (Thermo Scientific, Rockford, IL). Western blot foi efectuada utilizando o sistema Novex (Life Technologies) tal como descrito anteriormente [27], [28]. Os anticorpos primários anti-SREBP-1, SREBP-2, FASN, HMGCR, AR e β2-microglobulina (p2m) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), e os anticorpos secundários, que foram conjugados com peroxidase de rábano (GE Healthcare, Piscataway, NJ) foram usadas. Detecção de bandas de proteína foi feito usando quimioluminescência aumentada Western Blotting Detection Reagentes (GE Healthcare).

proliferação celular, clonogenicidade, migração e invasão Ensaios

LNCaP ou células C4-2B (6.000 células /poço ) foram plaqueadas em placas de 96 cavidades e foram transfectadas, com o miR-185, 342 ou NF. A proliferação celular foi medida 3 d após a transfecção por um ensaio MTS (Promega) de acordo com as instruções do fabricante. Para o ensaio de clonogenicidade, LNCaP ou células transfectadas com C4-2B de miR-185, 342 ou NC foram semeadas em placas de 6 poços (500 células /poço). As células foram cultivadas a 37 ° C com 5% de CO

2 para 14 d. As colónias foram fixadas com formalina e coradas com violeta de cristal [27]. Os números de colónias desenvolvidas foram contadas e analisadas para diferenças significativas.

In vitro

migração celular ou a invasão foi determinada em câmaras de Boyden pré-revestidos com colagénio I (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO; para o ensaio de migração) ou o crescimento matriz Matrigel empobrecido fatores (BD Bioscience, San Jose, CA; para ensaio de invasão). As células (1,5 x 10

5 células /poço) transfectadas com o miR-185, 342 ou NC foram semeadas para o interior das câmaras superiores pré-revestidos. Após incubação a 37 ° C com 5% de CO

2 durante 48 h, o número de células que migraram ou invasores foram medidos por um método de coloração com violeta de cristal [27].

A quantificação de ácidos gordos e colesterol

as quantidades de ácidos graxos de cadeia longa e cholesterols foram determinadas utilizando o Kit gratuito de ácido gordo Quantificação e colesterol /colesterílico Detection Kit (Abcam, Cambridge, MA) em células transfectadas com miR-185, 342 ou NC. As quantidades de ácidos gordos e colesteróis foram normalizados pelo número total de células. O ácido gordo ou o colesterol relativa (%) foi designado como 100% de células NC.

Apoptose Os ensaios

Para coloração Anexina V, uma análise de separação de células do cancro da próstata activadas por fluorescência foi feito 72 h pós-transfecção de miARNs usando a Anexina V-FITC Apoptosis Detection Kit I (BD Bioscience) e um citómetro de fluxo FACScan com o software CellQuest (Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ). Para o ensaio de actividade de caspase, as células transfectadas com miARNs durante 24 horas foram medidos para a caspase 3/7 actividades enzimáticas por caspase-Glo® Sistemas de ensaio 3/7 (Promega). Os dados foram normalizados por proteínas totais. Por análise de mancha de caspase-ocidental, lisados ​​de células inteiras foram preparados a partir de células transfectadas com miARNs durante 72 h e submetida a Western blot. foram utilizados anti-caspase 9, 3 e PARP primários anticorpos (Cell Signaling Technology, Beverly, MA).

Declaração de Ética

Todos os experimentos com animais foram realizados em estrita conformidade com as recomendações o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório do National Institutes of Health. O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal do Cedars-Sinai Medical Center (IACUC Protocolo # 004252) e foi seguido para os estudos de rato.

In vivo

Experimentação Animal

Para examinar a eficácia anti-tumoral de miR-185 e 342

in vivo

, seis semanas de idade do sexo masculino subcutaneamente ratinhos nus atímicos (Harlan Laboratories, Placentia, CA) foram inoculados com 2 x 10 células

6 C4-2B por rato. A carga tumoral foi monitorizada por volume de tumor (usando a fórmula V = 4 /3π × (d /2)

2 × D /2, onde d é o eixo tumorais pequenas e D é o eixo principal do tumor). Após seis semanas a inoculação, com 100 pmol de miARN complexado com 3 mL de Lipofetamine 2000 em 50 ul de PBS foi entregue intratumoral cada 3 d para um tratamento de 21-d. A dose e horário da injeção de miRNA foram modificados por um relatório anterior [29]. Após o término do estudo em animais, tecidos de tumor foram colhidas a partir de ratinhos sacrificados e fixados em formalina a 10%, desidratados em etanol, embebidos em parafina e seccionados para slides. As lâminas de tecido em branco foram submetidos a coloração imuno-histoquímica (IHC) [30] usando anti-SREBP-1, SREBP-2, FASN, HMGCR, AR, PSA, Ki67 e anticorpos primários de PARP clivada. Para a quantificação de Ki67 (proliferação celular) e expressão de PARP clivada (apoptose), 100 células de tumor em 5 áreas seleccionadas aleatoriamente foram contadas e coradas positivamente células foram registados. Além disso, os tecidos de tumor fresco parciais foram recolhidas para determinar a expressão de miR-185 ou 342 por qRT-PCR. miARN foi preparado a partir de tecidos tumorais, utilizando o kit de isolamento de miRvana ™ miARN.

Análise estatística

A análise estatística foi realizada tal como descrito previamente [31]. Estudante de

t

-teste e distribuição de duas caudas foram aplicados para a análise de significância estatística.

Resultados

miR-185 e 342 inibir a expressão de SREBPs e seus genes a jusante em prostate Cancer Cells

para investigar se miRNAs regulam a via de SREBP-lipogênese-cholesterogenesis metabólica nas células cancerosas da próstata, usamos primeira TargetScanHuman 6,2 software online (https://www.targetscan.org/) para prever se um ou mais miRNAs alvo tanto SREBP-1 e SREBP-2, dois fatores-chave de transcrição que regulam ácidos graxos, lipídeos e biossíntese de colesterol e homeostase. Dois miRNAs, miR-185 e 342, foram recuperados que 3 ‘UTRs potencialmente co-alvo de SREBP-1 e SREBP-2 mRNAs (Fig. S1A). Para verificar mais se miR-185 e 342 ligam-se diretamente com 3 ‘UTRs de SREBP-1 e SREBP-2, foi realizada 3’ ensaio de repórter luciferase UTR e descobriu que o parente ‘UTR actividades 3 luciferase de ambos SREBP-1 e SREBP- 2 foram significativamente menores no miR-185 e 342 células cancerosas da próstata transfectadas (Fig. S1B). Os resultados confirmam que SREBP-1 e SREBP-2 mRNAs são alvos directos de miR-185 e 342. Para validar se estes dois miARNs controlar a via de SREBP-lipogénese-cholesterogenesis em células de cancro da próstata, foi realizada qRT-PCR, Western blot, e quantificação de ácidos gordos e colesterol análises. Tanto o miR-185 e 342 inibiram a expressão de ARNm (Fig. 1A), bem como precursor (125 kDa) e maduro (68 kDa) proteínas (Fig. 1B) de SREBP-1 e SREBP-2 em LNCaP e C4-2B células cancerosas da próstata. Expressão de FASN [32] e HMGCR [33], [34], que são regulados SREBP genes a jusante, foi diminuída em miR-185 e 342 (Fig. 1A e 1B). MiR-185 e 342 também reduzida de ARNm de AR e a expressão da proteína em células de cancro da próstata (Fig. 1A e 1B). Porque FASN e HMGCR são enzimas importantes para a

de novo

síntese de ácidos graxos e colesterol individualmente, que, posteriormente, examinou os níveis de ácidos graxos e colesterol nas células. Como mostrado na Tabela 1, as quantidades de ácido gordo de colesterol intracelular e foram significativamente diminuída em miR-185 e 342-transfectadas e células LNCaP C4-2B em comparação com os grupos de controlo. Para testar ainda mais a especificidade do miR-185 e 342 para SREBP-lipogênese-cholesterogenesis, oligonucleotídeos antisense contra miR-185 e 342 foram utilizados como miR-185 e 342 inibidores. Ao bloquear endógena miR-185 e 342 em células de câncer de próstata, tanto miR-185 e 342 inibidores aumentou SREBP-1, SREBP-2 e sua expressão de genes a jusante (Fig. 1C). Estes resultados sugerem que o miR-185 e 342 SREBP inibiu a sinalização através de redução de ARNm e proteína SREBP e diminuição dos níveis de ácido gordo e de colesterol em células de cancro da próstata.

A, quer o miR-185 e 342 inibiram a expressão de ARNm de SREBP-1, SREBP-2, FASN, HMGCR e AR em células LNCaP de cancro da próstata e células C4-2B determinados por qRT-PCR. -: Não transfectadas; NC: controle de miR-negativo. A expressão de ARNm relativa (dobrar) foi designada como 1.0 em células não-transfectadas. Os dados foram normalizados para o rRNA 18S e representam a média ± DP de três experiências independentes em duplicado. **,

P Art 0,005 diferenças significativas do NC. B, miR-185 e 342 precursor inibido (125 kDa) e maduro (68 kDa) formas de SREBP-1 e SREBP-2, FASN, HMGCR e expressão AR em células LNCaP e C4-2B analisadas por Western Blot. β2-microglobulina (p2m) foi utilizada como um controlo de carga. C, miR-185 e 342 inibidores (oligonucleotídeos antisense contra miR-185 e 342) aumentou SREBP-1, SREBP-2, FASN, HMGCR e expressão AR em células LNCaP e C4-2B determinados por qRT-PCR. A expressão de ARNm relativa (dobrar) foi designada como 1.0 em células não-transfectadas. Os dados foram normalizados para o rRNA 18S e representam a média ± DP de três experiências independentes em duplicado. **,

P Art 0,005 diferenças significativas do NC. D, Expressão da intrínseca miR-185 e 342 em RWPE-1, LNCaP e as células C4-2B. Resultados qRT-PCR mostraram que a expressão relativa de miR-185 e 342 foi significativamente reduzida em células de cancro da próstata em comparação com o normal RWPE-1 /não-cancerosas. Observou-se menor expressão de ambos os miRNAs no C4-2B agressivo em comparação com células LNCaP. A expressão miRNA relativa (vezes) foi designado como 1,0 em células RWPE-1. **,

P Art 0,005 diferenças significativas em relação RWPE-1. Os dados foram normalizados para RNU6B controle e representam a média ± DP de três experiências independentes realizadas em quadruplicado.

Em seguida, determinou-se a expressão da intrínseca miR-185 e 342 em várias linhas de células com relevância clínica, incluindo uma linha celular humana normal epitelial de próstata /não-cancerosas, RWPE-1, e LNCaP (dependente de andrógeno-) e C4-2B células cancerosas da próstata (andrógeno-independente). MiARN foi preparado a partir destas células. A expressão relativa de ambos miR-185 e 342 foi significativamente diminuída em células cancerosas em comparação com não-canceroso RWPE-1 (Fig. 1D), tal como testado por qRT-PCR. Para além disso, reduzir o miR-185 e 342 a expressão foi observada na linha C4-2B mais agressivo em comparação com células LNCaP. Além disso, foi examinada a expressão de SREBPs, FASN e HMGCR correlacionar com intrínseca miR-185 e 342 nestas linhas celulares. A expressão relativa de SREBP-1, SREBP-2, FASN e HMGCR foi maior em LNCaP e C4-2B do que em células RWPE-1 (Fig. S2). Estes dados indicam que miR-185 e 342 são reguladores negativos para a sinalização SREBP em células de câncer de próstata.

miR-185 e 342 Repressão de Proliferação Celular, clonogenicidade, migração e invasão de células cancerosas da próstata

para avaliar o potencial para consequências biológicas induzidas pelo miR-185 e 342, nós re-expressa miR-185 e 342 em células LNCaP e C4-2B e realizou uma série de ensaios funcionais relevantes para tumorigenicidade e progressão do câncer. Quando as células LNCaP e C4-2B foram transfectadas com miR-185 e 342, a proliferação de ambos os tipos de células foi inibida em comparação com o miR-NC e as células não transf ectadas (Fig. 2A). Tanto miR-185 e 342 também diminuiu clonogenicidade comparados com os grupos de controlo (Fig. 2B). Uma das características das células progressivas e metastáticos é a sua capacidade de invadir tecidos circundantes e migrar de forma eficiente [35]. MiR-185 e 342 significativamente inibido

in vitro

migração (Fig. 2C) e invasão (Fig. 2D) em células LNCaP e C4-2B. Por outro lado, através do bloqueio de miR-185 e 342 em células de câncer de próstata, miR-185 e 342 inibidores de aumento da proliferação celular, formação de colônia, migração e invasão (Fig. S3). Estes dados sugerem que tanto miR-185 e 342 vias Suprimir relevantes para tumorigenicidade e progressão do câncer

A, miR-185 e 342 a proliferação celular inibida em células LNCaP e C4-2B comparação com os não-transf. (-) e controle miR-negativo (NC) células transfectadas 3 d seguinte miRNA transfecção. A proliferação celular relativa (%) foi designado como 100% em não-transfectadas (-) células. **,

P Art 0,005 diferenças significativas do NC. Os dados representam a média ± DP de duas experiências independentes em quadruplicado. B, miR-185 e 342 suprimida a formação de colónias em LNCaP e as células C4-2B em comparação com os grupos de controlo após 14 d miRNA transfecção. *,

P Art 0,05 e **,

P Art 0,005 diferenças significativas do NC. Os dados representam a média ± DP de duas experiências em triplicado independentes. C, a migração celular e D, invasão foram significativamente diminuiu miR-185 e 342 em células LNCaP e C4-2B comparados com os grupos de controle. **,

P Art 0,005 diferenças significativas do NC. Os dados representam a média ± SD de dois experimentos independentes em quadruplicado.

miR-185 e 342 Induzir dependente de caspase apoptose Morte em células cancerosas da próstata

Para determinar se miR-185 e 342 induzir a apoptose em células de cancro da próstata, realizaram-se anexina V-FITC iodeto /propídio (PI) a coloração de medição, o ensaio de actividade da caspase e de Western blot de caspase PARP e expressão. Os resultados de anexina V-FITC coloração /PI e fluxo de análise de citometria revelou que miR-185 e 342 aumentou as frações celulares apoptóticos (ambas as frações celulares precoce e tardia apoptóticos,

P Art 0,005) em LNCaP e C4 células 2b, em comparação com os grupos de controlo (Fig. 3a). Caspase 3/7 actividades foram também significativamente induzida por miR-185 e 342 em células LNCaP e C4-2B (Fig. 3B). Além disso, os resultados de Western blot mostrou que a pró-caspase 9 e 3 foram reduzidos em miR-185 e 342 (Fig. 3C). Além disso, caspase-3 clivada e PARP, um factor de caspases a jusante, foram detectados em miR-185 e 342 células transf ectadas (Fig. 3C). Estes resultados sugerem que o miR-185 e 342 induzir a morte de células de cancro da próstata através da activação de um mecanismo apoptótico dependente da caspase.

A, um Anexina V-FITC /PI coloração ensaio de apoptose e citometria de fluxo foram realizadas em LNCaP e C4-2B células transfectadas com miARNs. Tanto miR-185 e 342 aumentou as frações celulares apoptóticos (ambas as frações celulares precoce e tardia apoptóticos;

P Art 0,005) em comparação com os grupos de controle. B, Caspase 3/7 atividades foram significativamente aumentados por miR-185 e 342 em células LNCaP e C4-2B. Caspase 3/7 atividades (vezes) foram designados como 1,0 em não-transf – células (). **,

P Art 0,005 diferenças significativas do NC. Os dados representam a média ± DP de duas experiências em triplicado independentes. C, miR-185 e 342 diminuiu pró-caspase 9, 3 e PARP, e activado expressão da caspase 3 clivada e PARP em células LNCaP, tal como testado através de Western blot. p2m foi utilizado como um controlo de carga. C:. Clivada

intratumoral Entrega de miR-185 e 342 Leads à regressão da próstata Tumores em um xenoenxerto modelo do rato

Como o

in vitro

dados demonstraram papéis anti-tumorigénica e apoptóticos de miR-185 e 342 em células de cancro da próstata, que subsequentemente examinado o potencial terapêutico de miR-185 e 342 utilizando um modelo de xenoenxerto subcutâneo da próstata tumor de rato. Após um tratamento de 21-d por cada entrega intratumoral 3 d, tanto o miR-185 e 342 reduziu significativamente a carga do tumor C4-2B subcutânea em comparação com o grupo de controlo (Fig. 4A). Para correlacionar a resposta terapêutica com a entrega de miARN, miARN foi isolado a partir de tumores C4-2B frescas e os níveis de miR-185 e 342 foram avaliados por qRT-PCR. Tumores injectados com miR-185 ou 342 continha aproximadamente 116 ± 30 vezes (miR-185,

P Art 0,05) ou 278 ± 59 vezes (miR-342,

P 0,05) mais elevada do que os tumores de controlo (Figura 4B).. Estes resultados sugerem que a inibição do crescimento C4-2B subcutânea foi devido a miR-185 ou 342 tratamento. Consistente com a anterior

in vitro

resultados Western blot (Fig. 1B), os dados IHC mostraram que as miR-185 ou 342 grupos tratados tinham diminuído SREBP-1, SREBP-2, FASN, HMGCR, AR e PSA, que é um gene alvo a jusante AR, expressão comparação com os tumores de controlo (Fig. 4C). Além disso, para determinar os efeitos de miR-185 e 342 sobre a proliferação celular e a apoptose

In vivo

, foi realizado o biomarcador Ki67 e clivado coloração PARP nos tumores C4-2. Como mostrado na Fig. 5A e 5B, diminuiu marcadamente a proliferação celular (Ki67) e aumento da morte apoptótica (PARP clivada) de tumores C4-2B foram observados em ambos os 342 espécimes tumorais tratadas miR-185 e em comparação com o grupo de controlo. O

in vivo

resultados indicam que a aplicação direta de miR-185 e 342 tumores de próstata pode proporcionar um benefício terapêutico num sistema de câncer de próstata modelo.

A, o crescimento do tumor subcutâneo C4-2B foi ensaiada por volume de tumor após a entrega intratumoral de miR-185, 342 ou NF cada 3 d para um tratamento de 21-d em ratinhos. Tanto o miR-185 e 342 inibiram significativamente o crescimento de tumores em comparação com C4-2B tumores tratados com NC. *,

P Art 0,05; **,

P Art 0,005 diferenças significativas em tumores tratados com NC (N = 5 para cada grupo). B, A expressão relativa de miR-185 ou 342 em tumores C4-2B. Resultados qRT-PCR demonstraram que os relativos miR-185 ou 342 níveis foram grandemente aumentada nos tumores subcutâneos C4-2B injectados com miR-185 ou 342 em comparação com os tumores de controlo. A expressão miRNA relativa (vezes) foi designado como 1,0 na NC. *,

P Art 0,05 diferenças significativas do NC. Os dados foram normalizados para RNU6B e representam a média ± DP. C, IHC resultados mostraram que a sub-regulação de SREBP-1, SREBP-2, FASN, HMGCR, AR e PSA foi observado no miR-185 e 342-tratados tumores subcutâneos C4-2B em comparação com os tumores tratados com NC. Barras de escala = 25 um

Quantificação de A, Ki67 (proliferação celular) e B, PARP clivada (C-PARP; apoptose). células positivas em amostras de tumor C4-2B subcutâneos coletados do miR- NC, 185 e 342 grupos tratados. Cem células em 5 áreas seleccionadas aleatoriamente foram contadas e as células coradas positivamente foram registados. **,

P Art 0,005 diferenças significativas do grupo NC controle. Os dados representam a média ± DP. As setas indicam as células positivas C-PARP. Barras de escala = 100 mm.

Discussão

lipídico aberrante e anabolismo colesterol está fortemente ligada com câncer de próstata [36], [37]. -Regulação da lipogênese e cholesterogenesis em células de câncer está associado a maior necessidade de componentes da membrana celular e ativação de transdução de sinalização intracelular relacionadas com a jangada lipídica durante a proliferação celular descontrolada e divisão, bem como o desenvolvimento e progressão de cancro [24], [38] – [41]. O bloqueio da lipogénese anormal e cholesterogenesis proporciona uma abordagem terapêutica promissora para a prevenção ou tratamento de neoplasia maligna da próstata. MiARN foi reportado para regular vários processos biológicos importantes incluindo o metabolismo [3], [5] e é de uso potencial na terapia do cancro [42] – [44]. No entanto, como miRNA medeia o metabolismo da gordura aberrante e homeostase em células de câncer de próstata permanece obscuro. Neste estudo, identificamos dois miRNAs que desempenham um papel importante na regulação da lipogênese e cholesterogenesis em células de câncer de próstata. MiR-185 e 342 inibiram a biossíntese de ácidos gordos e o colesterol por meio da diminuição da regulação de transcrição de factores principais e lipogênicas cholesterogenic, SREBP-1 e SREBP-2, e os seus genes regulados a jusante incluindo FASN e HMGCR. SREBP-1 e FASN foram mostrados para ser um factor potencialmente oncogénica da transcrição [22] e um oncogene metabólica [20], [21], respectivamente. MiR-185 e 342 reduziu a proliferação celular, clonogenicidade, migração e invasão e apoptose dependente da caspase induzida em células de câncer de próstata. Estes dados sugerem que o miR-185 e 342 têm um papel supressor de tumores por inibição de SREBP-1 e SREBP-2 expressão, e assim a reprogramação lipogénese e cholesterogenesis.

Um número de miARNs foram identificados para ser ligado a o desenvolvimento do cancro da próstata e progressão para doença letal. MiR-20a foi relatado para regular a proliferação celular e na progressão através da inibição da proteína de junções de hiato conexina 43 expressão no cancro da próstata [45]. expressão diminuída de miR-143 e 145 foi encontrado em pacientes com câncer de próstata com metástase óssea [46]. Além disso, tanto miR-143 e 145 mediada epitelial-mesenquimal de transição (EMT) e suprimiu a capacidade metastática de células de câncer de próstata PC3

in vitro

e

in vivo

[46]. MiR-203 regulada para baixo um grupo de genes relacionados a metástases e metástase óssea impedida no câncer de próstata [47]. Ao bloquear a expressão de CD44, miR-34a inibiu a migração e invasão em células-tronco do câncer de próstata [48]. Mir-deixá-7c diminuição da expressão AR e da atividade em células de câncer de próstata, visando um fator de transcrição oncogênico, c-Myc [49]. Análise de amostras de tumor clínicos recolhidos de doentes com cancro da próstata metastático castração resistente óssea (CRPC) revelou que o miR-23b aberrante expressão /27b pode estar envolvida em progressão para a resistência à castração [50]. Além disso, o miR-221 e 222 foram demonstradas para controlar o desenvolvimento de CRPC [12]. No presente estudo, descobrimos dois novos anabolismo regulada miRNAs lipídios e colesterol, miR-185 e 342, que bloquearam a SREBP-lipogênese-cholesterogenesis, diminuição da expressão do AR, tumorigenicidade inibida e morte apoptótica induzida em células de câncer de próstata. Uma combinação de miR-185 e 342 não mostram o efeito sinérgico ou aditivo de forma significativa na expressão do gene, crescimento, migração e invasão comparado a única miARN em células de cancro da próstata (dados não mostrados). Além disso, a expressão de intrínseco miR-185 ou 342 foi significativamente baixa em células de cancro da próstata em comparação com células normais /não-cancerosas epiteliais. Outras investigações dos perfis de expressão de miR-185 e 342 em amostras de tumores de próstata humanos se justifica. Colectivamente, estes estudos experimentais e clínicos sugerem que miRNAs desempenham papéis críticos e significativos no desenvolvimento e progressão do câncer de próstata.

AR é um fator de transcrição importante androgênica hormônio-ativado e um regulador de crescimento e sobrevivência de órgãos andrógeno-dependentes durante normal desenvolvimento e progressão neoplásica. **,

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