Abstract

zinco nucleases de dedo (ZFN) são ferramentas poderosas para edição de genes em células . Aqui usamos ZFNs para interrogar a função biológica de

ADPGK

, que codifica uma glucoquinase dependente de ADP (ADPGK), em linhas celulares de tumores humanos. A hipótese foi testada é que ADPGK utiliza ADP para fosforilar a glicose sob condições onde ATP torna-se limitantes, tais como hipóxia. Foram caracterizados dois clones ZFN knockout em cada uma das duas linhas (H460) e HCT116. Todos os quatro clones tinham mutações frameshift em todos os alelos no local de destino do exão 1 de

ADPGK,

e foram ADPGK nulo por immunoblotting.

ADPGK

knockout teve pouco ou nenhum efeito sobre a proliferação celular, mas comprometido a capacidade das células H460 para sobreviver silenciamento siRNA de hexoquinase-2, mediante processos aeróbicos, com a sobrevivência clonogênica caindo de 21 ± 3% para a linha dos pais para 6,4 ± 0,8% (p = 0,002) e 4,3 ± 0,8% (p = 0,001) para as duas chapas. Um aumento da sensibilidade semelhante à morte de células clonogénicas foi observado em anóxia. Nenhuma dessas mudanças foi encontrado ao

ADPGK

foi nocauteado em células HCT116, para o qual a linha parental foi menos sensível do que o H460 a anoxia e hexoquinase-2 silenciamento. Enquanto eliminatória da

ADPGK

em células HCT116 causado algumas mudanças na expressão gênica global, knockout de

ADPGK

em células H460 causada notável aumento da regulação do mRNAs que codificam proteínas de adesão celular. Surpreendentemente, podemos discernir nenhum efeito consistente sobre a glicólise como medido pelo consumo de glicose ou formação de lactato sob anoxia, ou a taxa de acidificação extracelular (analisador Seahorse XF), mediante processos aeróbicos em uma variedade de meios de comunicação. No entanto, as taxas de consumo de oxigênio eram geralmente mais baixos nos

ADPGK

nocautes, em alguns casos de forma acentuada. Coletivamente, os resultados demonstram que

ADPGK

pode contribuir para a sobrevivência de células tumorais em condições de elevada dependência glycolytic, mas o fenótipo resultante da eliminatória da

ADPGK

é a linha celular dependente e parece não estar relacionado com priming da glicólise nestas linhas

Citation:. Richter S, Morrison S, Connor T, Su J, impressão CG, Ronimus RS, et al. (2013) Zinc Dedo Nuclease Mediated Knockout de Glucokinase ADP-dependente em linhas celulares de cancro: Efeitos sobre a célula de sobrevivência e mitocondrial metabolismo oxidativo. PLoS ONE 8 (6): e65267. doi: 10.1371 /journal.pone.0065267

Autor: Mark Isalan, Centro de Regulação Genômica, Espanha |

Recebido: 05 de março de 2013; Aceito: 23 de abril de 2013; Publicação: 14 de junho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Richter et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pela Royal Society of New Fundo Marsden Zelândia (www.royalsociety.org.nz/programmes/funds/marsden/). SLM é apoiado por um Nacional de Saúde e Pesquisa Médica do Conselho (NHMRC) Carreira de Desenvolvimento da Irmandade e de receber subvenções do NHMRC (1.027.226 e 1.027.227). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

A identificação de um grande número de genes candidatos por meio de análise genômica criou uma necessidade premente de novas abordagens para atribuir função biológica. nucleases de dedos de zinco altamente específicos de sequência (ZFN) têm utilidade para a edição gene alvo em células vivas [1] – [6] e é um dos emergentes ferramentas de genômica funcional para explorar relações genótipo /fenótipo. Especificamente, ZFNs diméricas capazes de reconhecer sequências de 18-42 pares de bases podem ser utilizados para introduzir quebras de ADN de cadeia dupla em localizações únicas no genoma. Estas quebras de DNA iniciar final não homóloga juntar reparação para gerar, mutações heterogéneas site-specific (predominantemente pequenas Indels que perturbam a função do gene) ou, na presença de uma sequência de DNA do doador, para introduzir mutações definidas através de reparação dirigida por homologia propenso a erros . Estudos recentes confirmam a alta especificidade sequência de ZFNs design personalizado em células [7] – [10].

Aqui nós utilizamos ZFN tecnologia para interrogar a função biológica de um gene humano,

ADPGK

, que codifica uma glucoquinase dependente de ADP (ADPGK). Surpreendentemente, dada a extensa investigação da fosforilação da glicose como a reação central do metabolismo intermediário por muitas décadas [11], ADPGK mamífero foi descoberta apenas recentemente através da sua sequência de forma semelhante ao glucokinases ADP-dependentes Archaea [12]. A análise filogenética sugere que o gene ancestral foi lateralmente transferidos de Archaea cedo na evolução metazoan [12]. O murino recombinante purificada [12] e humano [13], as enzimas foram confirmados para fosforilar a glicose, com a característica invulgar (como para os enyzmes Archaea, [14]) que o dador de fosforilo é ADP em contraste com a bem estudada dependente de ATP isoformas hexoquinase vertebrados (HK1-4). ADPGK murino é muito específico para a glucose, com menor capacidade de fosforilar manose e frutose (20% e 10%, respectivamente, da taxa com a glicose); ele tem uma baixa aparente K

M para a glicose (96 mM) e ADP (260 uM), e é inibida por concentrações elevadas de glucose e pelo seu produto AMP, mas, ao contrário HK1-4, não pela glucose-6- fosfato. O papel biológico de ADPGKs eucarióticas não está bem compreendida; telas de RNAi em

C. elegans

HeLa e células não identificaram um fenótipo [15] – [17], embora um relatório recente demonstrou um papel de ADPGK no receptor de células T a sinalização através de desvio de fluxo glicolítico para o transporte para o glicerol-3-fosfato desidrogenase , resultando na estimulação da produção mitocondrial de espécies reativas de oxigênio (ROS) [18]. No entanto, as propriedades bioquímicas de ADPGK, em particular a sua capacidade de utilizar ADP, levou-nos a hipótese de que ele pode desempenhar um papel no priming glicólise sob condições de tensão em que o ATP se torna limitante [12], tal como em condições de hipoxia quando as células tornam-se altamente dependente glicolítica geração de ATP [19].

Dada a importância da fosforilação da glicose no metabolismo do tumor, vamos nos concentrar aqui sobre o papel do ADPGK em linhas celulares de tumores humanos. As células tumorais são altamente dependentes da glicólise, como observada pela primeira vez por Otto Warburg durante a década de 1920 [20], [21], e da reprogramação metabólica associada foi recentemente sugerido como uma possível indicação de câncer [22]. Em particular, fluxo glicolítico elevada em células de tumor é considerado para proporcionar intermediários para vias anabólicas e para aumentar as defesas antioxidantes através da geração de NADPH através da via das pentoses fosfato [23], [24]. Expressão de hexoquinases é muitas vezes sobre-regulada em células cancerosas como parte deste interruptor metabólica [25]. ADPGK é altamente expresso em tumores humanos e linhas celulares de tumores, em ambos os níveis de mRNA e proteína, embora haja pouca indicação de aumento da regulação relativa aos tecidos normais e (ao contrário de muitas enzimas glicolíticas) não é up-regulada por anoxia, hipoxia ou HIF-1 em culturas de células tumorais e mostra pouca dependência da concentração de glucose extracelular [13]. No entanto, dado que uma resposta de emergência ao esgotamento ATP seria montado mais rapidamente por uma enzima expressa constitutivamente, a falta de regulação da

expressão ADPGK

por hipoxia não exclui um papel na priming glicólise sob essas condições.

a nossa primeira tentativa de testar esta hipótese examinou o efeito de suprimir

ADPGK

expressão, com e sem supressão de HK2, em HCT116 e linhas de células tumorais humanas H460 usando RNA de interferência [13]. Este estudo mostrou maior expressão de mRNA e proteína de ambos ADPGK e HK2 no H460 do que em células HCT116, mas não demonstraram qualquer efeito significativo sobre a glicólise anaeróbia (consumo de glicose e formação de lactato), ou na sobrevivência de células clonogénicas sob anoxia curto prazo, em qualquer uma das linhas , embora uma pequena diminuição na eficiência de plaqueamento aeróbica de células H460 foi demonstrado quando

ADPGK

foi derrubado [13]. No entanto, a inibição da

ADPGK

expressão era incompleta neste estudo (normalmente redução ~60-90% em proteínas indicado por western blot), levantando a questão de saber se a atividade ADPGK residual pode ter mascarado o fenótipo.

no presente estudo, contornar o silenciamento incompleta de

ADPGK

usando ZFNs específicas para efetuar inactivação mutacional multi-alelos do gene, gerando H460 e células HCT116 linhas ADPGK nulo. O par de ZFNs utilizados aqui como alvo uma sequência de reconhecimento de par 37 de base genomically exclusivo dentro do primeiro exão do

ADPGK

gene. Dois

ADPGK

-null clones independentes com mutações frameshift confirmados foram gerados em cada fundo genético. Estes clones foram caracterizados quanto à proliferação, sobrevivência clonogénica fluxo glicolítico e sob condições aeróbicas e anaeróbicas. acidificação extracelular (como uma medida da glicólise) e o consumo de oxigénio mitocondrial também foram medidos utilizando um analisador de cavalo marinho XF. Finalmente, a capacidade destas linhas de células a crescer como xenoenxertos de tumores, e a proporção de estado estacionário de células hipóxicas em tumores resultantes, foram comparadas com linhas parentais.

Resultados

Geração de

ADPGK

-null linhas de células usando ZFNs

ADPGK

foi nocauteado em duas origens genéticas (HCT116 e H460) usando CompoZr ™ ZFNs customizado para introduzir quebras de cadeia dupla no um local alvo genomicamente única no primeiro exão do

ADPGK

gene (Figura 1A). A capacidade dos ZFNs para introduzir mutações neste local foi testada em células HCT116 utilizando o ensaio de detecção de mutações Surveyor ™ (Figura 1B), a seguir à base de lípidos de co-transfecção com um plasmídeo de GFP e separação por FACS 24 h mais tarde para enriquecer em células transfectadas . Uma região de 473 pb em torno do local de corte ZFN foi amplificado por PCR e os produtos foram desnaturados e re-hibridado para gerar incompatibilidade de bolhas nos locais de corte ZFN. CEL-nuclease II [26] clivagem do desfasamento bolhas resultou nos produtos previstos (256 e 217 pb), para a clivagem no local alvo. Banda densitometria da imagem na Figura 1B mostrou que a razão dos produtos de clivagem acrescentadas a banda parental foi de 66% (0,399 /0,601) para o ADN tratado com ZFN fornecido pelo fabricante (pista 2) e 68% (0,403 /0,597) para as células transfectadas-ZFN HCT116 (pista 4) neste experimento, indicando uma elevada frequência de mutações específicas do local. Em experiências posteriores, electroporação foi usada em vez de transfecção à base de lípidos para aumentar ainda mais a eficiência de transfecção.

(A) Caracteristicas da

ADPGK

gene, com localização de pares de iniciadores e a segmentação ZFN dimérica local. (B) PCR /CEL-II nuclease (Surveyor) ensaio para a detecção de mutações no local alvo do ZFN. As células HCT116 foram transfectadas com um par de ADPGK ZFNs e um plasmídeo de GFP. Um dia mais tarde, o ADN genómico foi preparado a partir de FACS reunidas classificados células GFP positivas para o ensaio (pista 4). Pista 1: escada de DNA. Pista 2: controlo positivo de DNA a partir de células K562 tratadas com ZFN ADPGK. Pista 3: células HCT116 não tratados. células (C) ADPGK ZFN tratados HCT116 clonadas e rastreadas para

ADPGK

por western blot. (D) O DNA genômico número de cópias por qPCR para pares de primers CNV1-3. Os resultados são representados graficamente em relação ao ADN WT que tem dois

ADPGK

alelos. (E) Sequencing através sítio de reconhecimento ZFN (local do corte previsto em minúsculas) resultou em supressões (-) e inserções (sublinhado) para o

ADPGK

-null HCT116 clones C3 e IC10. O número de cópias de cada alelo inferida é mostrado.

clones isolados a partir de

ADPGK populações tratadas ZFN

foram rastreados por imunotransferência para a ausência da banda de 54 kDa ADPGK característica. Dois discos removíveis candidatos (HCT116 C3 e IC10) com nenhuma proteína ADPGK detectável (Figura 1C) foram identificados a partir de dois ciclos diferentes de transfecção (C3 a partir de rastreio de 12 clones após enriquecimento por FACS, e IC10 a partir de 131 clones após a electroporação, sem fluxo de triagem usando condições que deu a eficiência de transfecção de ~ 70% usando um plasmídeo GFP), indicando uma frequência global de baixo nocaute bi-alélicas levando à completa perda de proteínas imunodetectáveis. Uma proporção mais elevada de clones pareceram mostrar a expressão da proteína ADPGK reduzida (dados não mostrados), possivelmente devido a inactivação mutacional de um único alelo. Para testar se a baixa frequência de linhas nulos (2/143 clones) reflete a sobrevivência comprometida ou proliferação in nocautes bi-alélicas, seguimos a frequência de mutações em uma piscina HCT116 ZFN-transfectadas utilizando o Surveyor (PCR /CEL-II nuclease) ensaio. Os 256 e 217 pb bandas diminuiu mais de duas semanas em cultura (Figura S1A), apesar de uma diminuição semelhante ao longo do tempo foi visto com um par ZFN separado visando a 8

th exão do

POR

(Figura S1B) , que codifica a NADPH; citocromo P450 oxidorredutase. clones HCT116 POR-nulos foram isolados com maior freqüência (3/14) usando o

POR

par ZFN. Assim, a perda progressiva da

ADPGK

e

POR

mutações é mais provável para refletir comprometida proliferação /sobrevivência das células com as mais altas plasmídeo copiar número após transfecção.

Número

Copiar dentro

ADPGK

gene foi avaliada para os dois clones ADPGK nulos (C3 e IC10) por qPCR utilizando pares de primers flanqueando a sequência alvo ZFN (CNV2 e 3) e outro reconhecendo exão 7 (CNV1) 31 kb de distância (Figura 1D). Esta mostrou a presença de duas cópias de

ADPGK

nos orifícios, como para a linha parental (consistente com o Projecto Genoma Sanger cancro; www.sanger.ac.uk/cgi-bin/genetics/CGP/cghviewer /CghViewer.cgi), com exceção de uma região única cópia perto do alvo ZFN citar em C3 clone HCT116. A sequenciação em todo o local alvo ZFN de ADN genómico a partir destes clones demonstrou nulos mutações frameshift em ambos (Figura 1E). Estes frameshifts gerar codões de paragem prematuro, resultando em proteínas truncadas previstos de 75 e 84 aminoácidos, a que falta o domínio de cinase de ADP localizado entre os aminoácidos 52 e 497 da isoforma de comprimento completo (www.uniprot.org), e são, portanto, espera-se que seja cataliticamente inativo. A descoberta de uma única mutação (e não WT) seqüência para clone 1C10, juntamente com um número de cópias de dois em CNV2 e 3, sugere recombinação homóloga usando a mutação inicial induzida ZFN como modelo resultou em redução de homozigose. HCT116 C3 também fornecida apenas uma única sequência no local alvo do ZFN, mas o número de cópias de um a três CNV2 e sugeriu uma grande deleção. Isto foi confirmado por amplificar e sequenciar uma região estendida, a identificação de um 2963 deleção que abrange os locais CNV2 e CNV3 (Figura S2).

A transfecção de células H460 com o mesmo

ADPGK

ZFN plasmídeos não resultou

ADPGK

-null clones de triagem de 127 clones após nucleofection sozinho e triagem de 24 clones após nucleofection e enriquecimento FACS. Esta baixa eficiência pode refletir a presença de três

ADPGK

alelos em H460 (Sanger Cancer Genome Project), que confirmou com o ensaio do número de cópias baseado em qPCR (figura S3). Dois clones apresentaram níveis reduzidos de proteína ADPGK (ID5 e VD6; Figura 2A), sugerindo que eles podem levar alelos mutantes, foram, por conseguinte, submetidas a uma segunda ronda de ZFN transfecção (electroporação e FACS), proporcionando 5/121 clones com nenhuma proteína detectável de ADPGK quais dois foram escolhidos para posterior análise (IID10 de ID5 e IIE5 de VD6) (Figura 2A). determinação do número de cópias (Figura 2B) em conjunto com a sequenciação do local alvo ZFN (Figura 2C) mostraram uma mutação de substituição homozigótica composto frameshifting deleção /base para o clone H460 IIE5 dando uma proteína truncada previsto de 89 aminoácidos. Clone IID10 tinha uma deleção de 62 pb em, pelo menos, um alelo, potencialmente gerar uma proteína de 62 aminoácidos, enquanto que o outro alelo (s) de transportar um número de duplicações de um segmento de ADN a jusante do local de corte da ZFN, que não eram totalmente identificados.

(a) Western blot de células H460 após a transfecção com ADPGK ZFNs (clones ID5 e VD6), e

ADPGK

-null clones derivados destes, em uma segunda rodada de ZFN transfecção (IID10 e IIE5). (B) O DNA genômico número de cópias por qPCR para pares de primers CNV1-3. Os resultados são representados graficamente em relação ao ADN WT que tem três

ADPGK

alelos. (C) Sequencing através local do corte da ZFN mostra deleções (-). E inserções (sublinhados) para o

ADPGK

alelos em clones H460 IID10 e IIE5

Proliferação e clonogenicidade de

ADPGK

Knockout linhas celulares

as linhas celulares ADPGK nulo de ambas as origens genéticas mostraram tempos de duplicação semelhantes às linhas WT quando cultivadas em condições de cultura de células aeróbias normalizadas (Figura 3A e B), com um possível ligeira redução na proliferação celular para a linha HCT116 IC10. morfologia de colónia por microscopia de contraste de fase foi também semelhante para as linhas celulares parentais (Figura 3C e D), embora as células H460 IID10 eram um pouco mais propenso a arredondamento para cima e desmontagem a partir do prato.

(A /B). A densidade celular após semear placas de 24 poços em 10

5 /ml. Os valores são a média e SEM de culturas em triplicado. (CD). microscopia de contraste de fase (10 × ampliação da objetiva) do WT e clones knockout em frascos T.

Para investigar mais proliferação, linhas de células HCT116 e H460 foram cultivadas sob normoxia para 54 e 72 h, respectivamente, e o número de células, o volume da célula, a distribuição do ciclo celular foi medido e clonogenicidade (Tabela 1). Não foram observadas diferenças significativas para HCT116 C3 comparação com WT; no entanto, um aumento de duas vezes em células em fase G1 foi visto para HCT116 IC10, consistente com a redução da proliferação notado acima. Chapeamento de eficiência foi semelhante para todas as três linhas de células HCT116, mas a proliferação mais lenta de HCT116 IC10 reflectiu-se numa redução significativa do raio colônia. Ambos H460

ADPGK

-null clones apresentaram uma pequena mas significativa redução no número de células, e um pequeno aumento de células em fase G2 /M. Além disso, H460 IID10 teve um aumento do volume celular média e mostrou uma tendência de diminuição da eficiência do plaqueamento bem como a diminuição do raio colônia, possivelmente devido ao desprendimento de células das colónias. No geral, os resultados sugerem um efeito menor sobre a proliferação, mas isso não foi um achado consistente em linhas celulares e clones.

Gene global Expressão em

ADPGK

-null Lines

para investigar se a eliminatória da

ADPGK

afeta a expressão do gene, dois

ADPGK

-null clones (C3 HCT116 e H460 IIE5) com proliferação semelhante e morfologia da colônia às suas linhagens parentais foram escolhidos para microarray análise usando Affymetrix Human Gene 1.0 microarrays ST. culturas individuais do HCT116 C3

ADPGK

-null linha e células parentais HCT116 foram comparadas em um primeiro experimento, e duplicar as culturas de ambos os pares HCT116 e H460 em um segundo experimento.

O transcriptoma da

ADPGK

-null linha HCT116 C3 parecia ser muito semelhante ao da linha WT HCT116 (Figura 4A) e não há transcritos expressos diferencialmente foram identificados quando a taxa de detecção falsa foi controlado a 5% até o Benjamini método -Hochberg. Enquanto esta análise sugere que o número de transcritos expressos diferencialmente aparentemente não era maior do que o esperado devido ao acaso, continua a ser possível que pequenas quantidades de transcritos de ARNm pode ser autenticamente seguinte regulamentado

ADPGK

inactivação do gene em células HCT116. Não houve evidência de alterações na expressão de outros que uma diminuição de 2 vezes aparente do transportador de glicose

SLC2A3

genes glicolíticos. Curiosamente, porém, dentro dos melhores classificado 22 conjuntos de sonda (Tabela S1), transcrições de oito genes do cromossomo Y foram regulados negativamente na linha nocaute. Na comparação do cariótipo de HCT116 C3 com a linha WT, observamos que este último contém uma subpopulação de células de retenção um cromossomo Y, enquanto a linha HCT116 C3 (ea linha HCT116 1C10) compreende apenas uma única cariótipo falta do cromossomo Y (Tabela S2 ). Assim, a diminuição da regulação dos transcritos Y-cromossómicas pode ser um artefacto resultante de selecção clonal de uma variante Y-menos.

O ARN foi analisado usando Affymetrix Human Gene 1.0 Dispersão microarrays ST (A) mostra os valores médios para expressão HCT116 C3 contra WT (3 culturas de cada). (B) Scatterplot mostrando os valores médios de expressão para H460 IIE5 contra WT (2 culturas cada). mapa (C) Calor dos 50 conjuntos de sondas topo do ranking diferencialmente expressos em culturas duplicadas de H460 WT e H460 IIE3. (D) qPCR de RNA a partir de culturas de células 3 replicados para cada H460 WT e

ADPGK

knockout clones IIE5 e IID10, normalizada contra 18S rRNA.

Knockout de

ADPGK

em H460 (clone IIE5) causou uma visivelmente maior alteração na expressão do gene (Figura 4B). Mais notavelmente a sonda marcada para caderina 11 (

CDH11

) foi significativamente diminuída, por 150 vezes, na H460 IIE5 (p = 0,03). Sem outros transcritos expressos diferencialmente foram identificados quando a taxa de detecção falsa foi controlado a 5% pelo método de Hochberg-Benjamini, um limiar estatístico conservadora que é apropriado quando tão poucas repetições estão disponíveis. No entanto, traçando as diferenças dos melhores classificado 50 conjuntos de sondas em um heatmap expressão mostra uma visível, mas não estatisticamente diferença significativa entre a linha WT H460 eo clone knockout culturas duplicadas IIE5 H460 (Figura 4C). Embora tenha havido nenhuma evidência de mudanças na abundância de ARNm glicolíticas, dois mRNAs que codificam para reguladores do metabolismo celular parecia ser expresso diferencialmente logo abaixo do nível de significância estatística (

PPARGC1A

, três vezes downregulated; e

AKT3

, 2,7 vezes regulada). Caderinas 2, 6 e 10 também foram expressas diferencialmente de 2,5 vezes, mas abaixo do nível de significância. Os 150 conjuntos de sondas topo do ranking de H460 (Tabela S3) foram escolhidos para posterior análise com a ferramenta de ontologia gênica DAVID ([27]; https://david.abcc.ncifcrf.gov/tools.jsp). Cerca de 50% dos genes de entrada foram associados com a membrana plasmática e previsto para ser glicosilado, 20% foram localizados para o espaço extracelular e -16% foram associadas com a adesão celular (Tabela S4). Análise utilizando a ferramenta de análise de caminho GeneSetDB [28] também revelou que os mais bem classificados 150 conjuntos de sondas de H460 células foram significativamente enriquecida (p≤0,05) para Gene Ontology (GO, https://www.geneontology.org/) categorias de ‘adherens organização junção’ e ‘montagem de junção celular’ e para os Reactome (https://www.reactome.org/) categorias caminho molecular de ‘junções aderentes interações “e” organização junção celular’.

a fim de confirmar a supressão de RNAm para caderina 11 e outras moléculas de adesão celular que parecia ser diferencialmente expressos seguinte

ADPGK

knockout (

NCAM2

,

L1CAM

e

CDH2)

, sua expressão foi quantificada por qPCR em H460 WT e tanto o

ADPGK

-null clones IIE5 e IID10 (Figura 4D).

ADPGK

mRNA também foi quantificada por qPCR, e demonstrou baixa abundância de transcritos nos clones mutantes consistentes com a deterioração mediado por mutações nonsense. Expressão de

CDH11

foi fortemente reprimida no

ADPGK

nocautes ( 10.000 vezes em H460 IIE5 e aproximadamente 200 vezes em H460 IID10).

NCAM2

e

L1CAM

ARN foram reduzidos na gama de 30 a 40 vezes e de 3 a 4 vezes, respectivamente, em ambos os

ADPGK

-null clones.

CDH2

só foi diminuída em H460 IIE5 (~1000 vezes). Em contrapartida, essa supressão de

CDH11, NCAM2 e LICAM

não foi detectada quando

ADPGK

foi derrubado para ~ 80% dos níveis WT por siRNA (Figura S4) sugerindo que a perda completa do gene função pode ser necessária para este fenótipo.

Efeito da

ADPGK

Knockout na célula de sobrevivência e glicólise em células HK2-empobrecido e Sub

Os estudos acima anoxia e hipóxia

indicou pouca se qualquer efeito de

ADPGK

nocaute sobre a proliferação celular ou chapeamento de eficiência (clonogenicidade) em condições normais de crescimento. Portanto, testou-se se ADPGK pode contribuir para a sobrevivência da célula, quando a fosforilação da glicose é limitada pelo tratamento com

HK2

ARNsi, ou quando a demanda glicolítica é aumentada em condições estritamente anaeróbias (6-H) anoxia. Um dia após a transfecção de H460 WT, e IIE5 IID10 com

HK2

siRNA ou controlo equiparado em GC siRNA,

HK2

knockdown tal como medido por qPCR era na gama de 70-80% (Figura 5A ). Dois dias após a transfecção com ARNsi de controlo, os números de células de clones knockout não foram significativamente diferentes dos WT, embora uma pequena tendência para a proliferação reduzida foi anotado para H460 IID10 como acima (Figura 5B).

HK2

siRNA reduziu significativamente o número de células em culturas de WT em relação ao controlo de siRNA, e ambos os clones knockout apresentaram uma pequena mas significativa redução ainda maior no número de células comparado com

HK2

siARN WT tratados (Figura 5B) . Plaqueamento eficiência das células tratadas com ARNsi de controlo, marcou 10 dias depois que as células re-plaqueamento, foi também reduzida para a linha IID10 (~ 50% de H460 que para WT), mas não para IIE5 (Figura 5C).

HK2

foi derrubado por siRNA em dois experimentos independentes, combinados aqui, cada um dos quais incluídos três repetições biológicas para WT e dois para cada clone nocaute. (A) de ARNm HK2 por qPCR um dia após a transfecção siRNA. (B). O número de células dois dias após a transfecção siRNA, em que as células foram plaqueadas de novo tempo para ensaio clonogénico. eficiência (C) chapeamento de dois dias após a transfecção com controle de siRNA. (D) Efeito de

HK2

siARN em fracção sobrevivente clonogénicas, dois dias após a transfecção, em relação às células transfectadas com ARNsi de controlo. (E) Efeito de 6 h anóxia em fracção sobrevivente clonogénicas, relativamente aos controlos óxicas, determinados por células em placas com uma câmara anóxica dois dias após a transfecção siRNA e transferência para uma incubadora aeróbio 6 h mais tarde. (F) Efeito da

HK2

siRNA na fracção sobrevivente clonogênica após a exposição a 6 h anoxia, relativa a uma exposição anóxica equivalente após o controle siRNA.

A capacidade de restrição glycolytic (

HK2

siRNA) ou aumento da procura glicolítica (anoxia) para suprimir ainda mais clonogenicidade foi avaliada pelo cálculo da eficiência fracção sobrevivente (plaqueamento como uma fracção do que para o controlo normóxica células tratadas com siRNA).

HK2

siARN matou 79% de H460 WT (fracção sobrevivente 0,21 na Figura 5D) e as colónias resultantes foram menores (redução de 40% no raio médio de colónias; dados não mostrados). Notavelmente, ambos

HK2

siRNA transfectadas

ADPGK

-null linhas celulares mostraram uma perda adicional muito significativo ~ 4 vezes de clonogenicidade (Figura 5D), sem qualquer alteração no tamanho da colônia, em comparação com WT também tratados com

HK2

siRNA. Quando as células foram re-plaqueadas numa câmara anaeróbia e expostos a 6 h anoxia antes de ser transferido para um CO aeróbia

2 incubadora, a sobrevivência clonogénica das células WT diminuiu em 71% (Figura 5E) e o raio de colónias em 30% (não mostrando). Ambos H460

ADPGK

-null linhas celulares foram significativamente mais sensíveis a matar sob anoxia (Figura 5E), sem qualquer alteração no raio de colônia.

HK2

knockdown em combinação com anoxia teve um efeito semelhante sobre a viabilidade ao observado em condições aeróbias, novamente com um efeito significativamente maior no

ADPGK

-null do que as linhas WT (Figura 5F).

Aumento da sensibilidade de ambos knockout ADPGK H460 clones para anoxia foi confirmado em um segundo conjunto de experiências, tanto com e sem a glycolytic inibidor de 2-desoxi-D-glucose (Figura S5). Estas experiências mostram claramente que

ADPGK

tem um efeito protetor contra a morte celular sob anoxia e quando

HK2

é derrubado em condições aeróbicas ou anóxicas na linha de células H460.

Um estudo semelhante ao que para H460 linhas de células foi conduzida para HCT116 WT e seus

ADPGK

-null derivados C3 e IC10 (Figura S6). Neste caso, o efeito estatisticamente significativa apenas de

ADPGK

nocaute era uma modesta diminuição na eficiência de plaqueamento (de as células de controlo tratadas com ARNsi) que pareceu ser mais pronunciada do que na experiência de controlo sem transfecção de ARN relatado em tabela 1. Knockdown de

HK2

, e exposição a anoxia por 6 h, causou menos morte de células de HCT116 WT do que as células H460 WT por um fator de ~ 2, e knockout de

ADPGK

fez não aumentar ainda mais matando pelo

HK2

siRNA ou anoxia no fundo HCT116.

Nós investigado se a exposição prolongada de hipóxia (0,2% de oxigénio em fase gasosa) tem um efeito semelhante sobre H460

clones ADPGK

-null como mostrado por anoxia. Todas as três linhas de células proliferaram a taxas semelhantes em condições de hipoxia de 3 ou 6 d, com nenhuma diferença significativa no aumento de vezes na clonogens por cultura (Figura S7A). Da mesma forma,

ADPGK

knockout não teve nenhum efeito consistente sobre o crescimento de clonogens HCT116 abaixo de 0,2% de oxigénio durante 3, 6 ou 9 dias (Figura S7B).

A aparente diferença nos efeitos do

ADPGK

nocaute na sobrevivência de células H460 sob anoxia contra 0,2% de oxigénio nos levou a testar ativação da resposta desdobrado proteína (UPR), que é mais pronunciado sob grave do que a hipóxia moderada [29], [30].

XBP1

splicing pelo IRE-1 endonuclease, um marcador da UPR [31], mostraram aumentos semelhantes em H460

ADPGK

-null clones e células WT após 6 h anoxia (Figura S8) .

efeitos da

ADPGK

knockout da glicólise e mitocondrial Metabolismo

Estamos próximos testaram se os efeitos do

ADPGK

nocaute sobre a sobrevivência H460 sob anoxia refletem uma papel de ADPGK na glicólise. consumo de glicose e formação de lactato durante 6 h anoxia foram suprimidas quando

HK2

foi derrubado na H460 (Figura 6A, B) e HCT116 (Figura 6C, D) linhas celulares, estabelecendo que a fosforilação da glicose é limitante da velocidade- para glicólise sob estas condições. Surpreendentemente, não havia nenhuma evidência para uma taxa mais baixa glicolítico em

ADPGK

nocautes, e glicólise nas nocautes foi mais sensível a

HK2

supressão. Da mesma forma, knockdown de

HK2

suprimiu os níveis de ATP em estado estacionário (ao abrigo condições aeróbicas ou anaeróbicas) em linhas de células H460, mas este efeito não foi maior para qualquer um dos

ADPGK

-null clones (Figura 7A). Anoxia e

HK2

siRNA teve apenas efeitos mínimos sobre os níveis de ATP em células HCT116 WT, em consonância com o menor efeito destes tratamentos sobre a sobrevivência clonogênica do que em células H460, sem diferenças óbvias no

ADPGK

clones knockout (Figura 7b).

consumo de glicose (A, D) e formação de lactato (B, e) foram medidos 2 dias após transfecção com siRNA controle ou

HK2

siRNA.

coli. (B).