Abstract

Fundo

Head and Neck carcinoma de células escamosas (CECP) é um ser humano câncer letal com heterogeneidade clínica, patológica, fenotípica e biológica. Caner células iniciador (CICs), que são responsáveis ​​pelo crescimento do tumor e juntamente com o ganho de transição epitelial-mesenquimal (EMT), foram identificados. Anteriormente, enriquecida uma subpopulação de células de câncer de cabeça e pescoço iniciador (HN-CICs), com aumento da regulação do CD133 e valorização do EMT. Outros demonstram que a Src quinase e interage com, fosforila o domínio citoplasmático de CD133. No entanto, a função fisiológica do CD133 /Src sinalização em HNSCCs não foi descoberto.

Metodologia /principal achado

Aqui, nós determinamos o papel crítico do eixo CD133 /Src modulação stemness, EMT e tumorigenicidade de CECP e HN-CICs. Inicialmente, a sub-regulação de CD133 reduz significativamente a capacidade de auto-renovação e expressão de genes stemness, e promoveu a diferenciação e capacidade apoptótica de HN-CIC. Além disso, knockdown de CD133 no HN-CICs também diminuiu tanto

in vitro

propriedades malignas, incluindo capacidade de invasão das células migração /celular /crescimento independente de ancoragem, e

in vivo

crescimento do tumor por ensaio ratos xenotransplante nu. No oposto, a sobre-expressão de CD133 melhorado as propriedades stemness e capacidade tumorigénica de HNSCCs. Por último, a regulação positiva de CD133 aumento da fosforilação da Src juntamente com a transformação EMT em HNSCCs, pelo contrário, o silêncio de CD133 ou tratamento de Src inibidor inversamente revogada acima efeitos fenotípicos, que foram induzidas por CD133-regulação no HNSCCs ou HN-CICs .

Conclusão /Significado

Os nossos resultados sugerem que a sinalização CD133 /Src é um interruptor de regulamentação para ganhar de EMT e de propriedades stemness em CECP. Finalmente, o eixo CD133 /Src pode ser um alvo terapêutico potencial para HNSCC eliminando HN-CIC

citação:. Chen Y-S, Wu H-J, Huang C-Y, Lin S-C, Chuang t-H, Yu C-C, et ai. (2011) CD133 /Src Axis medeia Tumor Iniciação propriedade e epitelial-mesenquimal Transição de Câncer de Cabeça e Pescoço. PLoS ONE 6 (11): e28053. doi: 10.1371 /journal.pone.0028053

editor: Andrew Yeudall, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos da América

Recebido: 8 de junho de 2011; Aceito: 31 de outubro de 2011; Publicado: November 28, 2011 |

Direitos de autor: © 2011 Chen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo é apoiado por bolsas de investigação do Conselho Nacional de Ciência (NSC95N444, NSC97N456, NSC99N024 e NSC100-2314-B-040-001), Taipei Veterans general Hospital (V97ER2018 e V98ER2018) e Universidade Nacional Yang-Ming (Ministério da Educação, objectivo para o Plano Universidade Top: 97ACD113, 97ACT302 e 98ACT302). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Cabeça e carcinoma de células escamosas do pescoço (CECP) é um dos cancros mais comuns no mundo e uma das causas de morte relacionada ao câncer devido à resistência a terapia [1]. Apesar de melhorias no diagnóstico e tratamento do CECP, as taxas de sobrevida global de longo prazo melhoraram marginalmente ao longo da última década [2].

Os dados Acumulando demonstrar que a formação do tumor é impulsionado por uma subpopulação de células que exibem capacidade-os auto-renovação de células supostos-tronco cancerosas (CSCs) ou células cancerosas iniciar (CICs) [3], [4]. AIC demonstraram ter a capacidade de promover a progressão do tumor e metástases, e também contribuem para a resistência e rádio-quimio-resistência [5]. Recentemente, nós e outros verificaram a existência de CICs em CECP (HN-CICs) [6], [7], [8], [9]. No entanto, há falta de provas como sinalização de superfície celular modular as propriedades stemness intracelulares ou tumorigenicidade de HN-CIC.

CD133 (prominin-1), uma glicoproteína transmembranar-5, foi originalmente reconhecida como um células estaminais hematopoiéticas marcador [10]. Consequentemente, CD133 tem sido considerada como um importante marcador da superfície celular para representar a subpopulação de CICs em tumores cerebrais, carcinoma do cólon, carcinoma da próstata, carcinoma hepatocelular, carcinoma da tiróide e câncer de cabeça e pescoço [8], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18]. Anteriormente, demonstramos que o regulamento se de CD133 no HN-CICs, ainda, o aumento da regulação do C133 em tecido canceroso HNSCC está negativamente correlacionada com o prognóstico de sobrevivência de pacientes com CECP [8]. Relatos recentes sugerem também que a expressão de CD133 em tecidos tumorais poderia servir como um indicador de prognóstico para o re-crescimento do tumor, progressão maligna, e sobrevivência dos pacientes [19], [20], [21]. No entanto, o CD133 mediada por mecanismos moleculares na regulação da AIC em HNSCC ainda não é clara.

EMT, uma transformação celular que converte as células epiteliais aderentes em células mesenquimais migratórias, é crítico para o desenvolvimento embrionário e progressão tumorigénico de células de cancro e cancro metástase [22]. Os pesquisadores mostraram que EMT poderia promover células-tronco (SCS) propriedades e ainda gerar células com as características de tumor iniciando propriedade [23], [24]. programa de EMT também manteve significativamente tumor iniciar células propriedade em HNSCC [6], [7], [25].

Src, uma tirosina quinase clássica não-receptor com o potencial de causar transformação celular, incluindo proliferação descontrolada e perda de inibição de contacto, torna-se activado por interacção com os receptores de membrana estimulados [26]. O sinal extracelular seriam ainda mais amplificado e transduzida através da interacção entre Src activado e alvos a jusante, tais como Ras /MAPK, PI3K /AKT e vias STAT3 [26]. A activação de Src perturba junção célula-célula, promove a capacidade invasiva através da fosforilação da β-catenina assim causando a degradação da E-caderina, e, subsequentemente, dispara a EMT [27]. Além disso, Boivin et al demonstram que CD133 é um parceiro de ligação novela de Src e é phosporylated por Src quinase [28].

Os mecanismos moleculares detalhados envolvidos nas ligações regulamentares entre EMT e deter genes relacionados a celulares, tais como CD133 e Src ainda são pouco conhecidos. Aqui, nós demonstramos um papel crítico de CD133 na melhoria da stemness, ganho de EMT, e promover a tumorigenicidade de HN-CICs. Além disso, a regulação negativa de CD133 ou inibição de CD133 induzida activação Src diminui propriedades stemness e tumorigenicidade de HNSCCs ambos

in vitro

e

in vivo.

Em última análise, demonstramos a importância do CD133 /Src sinalização no processo EMT para CECP.

Materiais e Métodos

As linhas celulares cultivo e enriquecimento da HN-CICs de HNSCCs

Duas linhas de células de carcinoma epidermóide, SAS [29] e OECM1 [30], foram cultivadas em DMEM ou em RPMI suplementado com 10% de FBS (Grand Island, NY, EUA), respectivamente. Uma linha de células de CECP primária foi obtida a partir do paciente HNSCC. Todas as amostras clínicas neste estudo foram aprovados e de acordo com o Institutional Review Board de Chung Shan Medical University Hospital (CSMUH No: CSI0249). Para o enriquecimento de HN-CIC, as duas linhas celulares foram cultivadas em meio esfera de tumor que consiste em meio livre de soro de DMEM /F12 (GIBCO), suplemento N2 (GIBCO), 10 ng /mL de crescimento recombinante de fibroblastos básico humano factor básico (FGF ) e 10 ng /mL de factor de Crescimento epidérmico (EGF) (R D Systems, Minneapolis, MN). As células foram colocadas em placas a uma densidade de 7,5 x 10

4 a 1 x 10

pratos 5 células vivas /10 mm, e o meio foi mudado a cada dois dias até que a formação de esfera do tumor foi observada em cerca de 4 semanas [ ,,,0],8].

superexpressão estável de CD133 em células de CECP

gene CD133 humano foi amplificado a partir de pulmão fetal humano e modelo de cDNA baço obtido a partir Biosettia Inc. (Cat. No. cDNA-HSA-09 ; San Diego, CA, EUA) e, em seguida, clonado pCDH1-MCS1-EF1-copGFP (Sistema Biosciences, Cat. no: CD511A-1; mountain View, CA, EUA). As sequências dos oligonucleótidos utilizados para amplificação por PCR são CD133 5′-ACCGTCTAGAATGGCCCTCGTACTCGGCTCCCTGTTGCTG-3 ‘e 5′-ATCAAAGCTTATTGAAGCTGTTCTGCAGGTGAAGAG- TGCC-3’. produção lentivírus foi realizada por co-transfecção de mistura de ADN de plasmídeo com lentivector mais auxiliares plasmídeos (VSVG e gag-pol) em células 293T (American Type Culture Collection, Manassas, VA), utilizando Lipofectamine 2000 (LF2000, Invitrogen, Calsbad, CA, EUA ). A título de lentivírus M.O.I é determinada por citometria de fluxo (média de 5 × 10

4 e 2 × 10

5 TU /mL). Para gerar linhas celulares estáveis, as células CECP sub-confluentes foram infectadas com lentivírus na presença de 8 ug /ml de polibreno (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA). A proteína de fluorescência verde (GFP), a qual foi co-expressa em células infectadas com lentivírus, foi servido como um marcador de selecção para indicar os HNSCCs infectados com sucesso. linhas de células de carcinoma epidermóide que sobre-expressam CD133 estáveis ​​foram ainda purificados por separação de células com as células positivas para GFP (Figuras 1A e 1B). O vector vazio pCDH1-MCS1-EF1-copGFP só é utilizado para o controle experimental.

(A) suspensão única célula de HN-CICs foi transduzida com sh-Luc ou sh-CD133 lentivírus durante 3 dias. Total de proteínas preparadas a partir de células infectadas foram preparadas e analisadas. O efeito silenciamento de CD133 shRNA no HN-CICs foi validado em translação por western blot (OECM1 (

painel esquerdo

) e SAS (

painel direito

)). Imunotransferência contra anticorpos anti-anti-GAPDH Oct-4, anti-Nanog, ou foi realizada como indicado. A quantidade de proteína de GAPDH de diferentes extractos celulares em bruto foi designado como controlo de carga, e para posterior quantificação. (B) de superfície celular CD133 de sh-CD133-1, sh-sh CD133-2 e-Luc HN-CICs foi analisada por citometria de fluxo (C) HN-CICs foram inicialmente infectados com sh-CD133-1, sh-CD133- 2 ou SH-Luc lentivírus durante 3 dias, e em seguida, depois cultivados sob a forma de selecção definido isento de soro. Examinou-se a morfologia celular de HN-CICs tratados com sh-Luc ou CD133-shRNA lentivírus. Setas indicam as células esfera. O perfil de CK18 (D) ou anexina V vs. coloração positiva PI (E) de células HN-CICs infectadas com SH-CD133-1, SH-CD133-2 ou SH-Luc lentivírus expressão foi avaliada, respectivamente, por citometria de fluxo . A percentagem de anexina V

+ /PI

+ células positivas duplas foi gravado (E; painel da direita). A IgG de controlo foi utilizado para definir o sinal de linha de base em (B) e (D). Os experimentos foram repetidos três vezes e os resultados representativos foram mostrados. Os resultados são médias ± DP (*, p 0,05; ***, p 0,001)

Construção de RNAi Lentivirus mediada para silenciar CD133

O vector PLV-RNAi. , que co-expressam a proteína GFP em células hospedeiras infectadas, foi adquirido a partir de Biosettia Inc. (Biosettia, San Diego, CA, EUA). O método de clonagem da sequência de cadeia dupla shRNA é descrito no protocolo do fabricante. vectores lentivirais que expressam shRNA que tem como alvo CD133 humano (sequência de oligonucleótidos: SH-CD133-1: 5′-AAAAGGACAAGGCGTTCACAGATTTGGATCCAAATCTGTGAACGCCTTGTCC-3 ‘; Sh-CD133-2: 5′-AAAAGGATACACCCTACTTACTATTGGATCCAATA GTAAGTAGGGTGTATCC-3′) foram sintetizados e clonado para gerar um pLVRNAi vector de expressão de lentivírus. Sh-Luc: 5’-CCGGACTTACGCTGAGTACTTCGAA CTCGAGTTCGAAGTACTCAGCGTAAGTTTTTTG-3 ‘foi utilizada para controle experimental. produção lentivírus foi realizada como acima. Estável PLV-RNAi expressa linhas de células de carcinoma epidermóide foram ainda purificados por separação de células com células positivas para GFP (Figura s1c).

Side população análise

Para análise da população lado, as células CECP suspensão única em 1 × 10

6 /ml foi preparada em meio pré-aquecido DMEM com soro a 2% de bovino fetal (FBS). Hoechst 33342 corante foi então adicionada a uma concentração final de 5 ug /mL na presença ou ausência de fumitremorgin C (FTC) (10 uM; Sigma, St Louis, MO, EUA) e foi incubada a 37 ° C durante 90 min com agitação intermitente. As células foram lavadas com HBSS arrefecido em gelo, com 2% de FBS e centrifugado a 4 ° C, e re-suspenso no mesmo tampão. iodeto de propídio, a uma concentração final de 2 ug /ml foi adicionado por gating células viáveis. O corante Hoechst 33342 foi excitado a 357 nm e sua fluorescência foi duplo comprimento de onda analisado (azul, 402-446 nm; vermelho, 650-670 nm). As análises foram feitas em um FACS Vantage (BD, San Diego, CA, EUA) [6].

apoptose Ensaio

As células apoptóticas foram detectadas com um kit de anexina V-APC (Calbiochem, Darmstadt , Alemanha) de acordo com as orientações do fabricante. Após a coloração, as células foram incubadas com 20 ug /ml de iodeto de propidum (PI) foram analisadas por FACS Calibur aparelho (Becton Dickinson, San Diego, CA, EUA) [6].

No ensaio de migração celular e invasão in vitro

Para os ensaios de migração Transwell, 2 × 10

5 as células foram plaqueadas na câmara superior de um Transwell (Corning, Acton, MA) com uma membrana porosa (tamanho de poro 8,0 | iM). As células foram plaqueadas em meio com baixo soro (FBS a 0,5%), e meio suplementado com soro mais elevada (10% de FBS) foi utilizado como um quimioatractivo na cara inferior. As células foram incubadas durante 24 h a 37 ° C e as células que não migraram através dos poros foram removidos por um cotonete. As células na superfície inferior da membrana foram coradas com Hoechst 33258 (Sigma-Aldrich) para mostrar os núcleos; fluorescência foi detectado com uma ampliação de 100x utilizando um microscópio de fluorescência (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanha). O número de células fluorescentes em um total de cinco campos selecionados aleatoriamente foi contado. Na análise de invasão de células in vitro foi descrito anteriormente [8].

macio colónia agar ensaio de formação

Cada poço (35 mm) de uma placa de cultura de seis poços foi revestida com 2 ml de agar de fundo ( Sigma-Aldrich) mistura (DMEM, 10% (v /v) de FCS, 0,6% (w /v) de agar). Depois de a camada inferior foi solidificada, 2 ml topo mistura de ágar-meio (DMEM, 10% (v /v) de FCS, 0,3% (w /v) de agar) contendo 2 × 10

foi adicionado 4 células, e os pratos foram incubadas a 37 ° C durante 4 semanas. As placas foram coradas com violeta de cristal de 0,005%, em seguida, as colónias foram contadas. O número de colónias totais com um de diâmetro ≥100 foi contado mais de cinco campos por bem para um total de 15 campos de experiências em triplicado.

xenoenxertos subcutâneos em ratinhos nus

Todas as práticas de animais em neste estudo foram aprovados e de acordo com o Comité Institucional de animal Care and Use (IACUC) da Universidade Nacional Yang-Ming, Taipei, Taiwan (aprovação IACUC No. 961230). Estável sh-Luc e sh-CD133 HN-CICs ou controlar GFP e HNSCCs-overexpresiing CD133 misturadas com Matrigel (BD Bioscience, San Diego, CA, EUA) (1: 1) foram injectadas subcutaneamente em ratinhos BALB /c nu (6- 8 semanas). O volume do tumor (TV) foi calculado usando a seguinte fórmula:. TV (mm

3) = (comprimento x largura

2) /2

A análise estatística

Statistical Package de software Ciências sociais (versão 13.0) (SPSS, Inc., Chicago, IL) foi utilizado para a análise estatística. Estudante de

t

teste foi utilizado para determinar a significância estatística das diferenças entre grupos experimentais;

p

valores inferiores a 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. O nível de significância estatística foi fixado em 0,05 para todos os testes.

Resultados

Down-regulação da CD133 reduz propriedades stemness juntamente com o aumento da diferenciação e capacidades apoptóticos no HN-CICs

Nós identificamos uma subpopulação de células de câncer de cabeça e pescoço iniciador (HN-CICs) com propriedades stemness reforçada a partir de células de CECP (HNSCCs) por ensaio de formação de esfera [8]. Além disso, nós e os outros apresentar-regulação de CD133 no HN-CICs [8], [31], [32]. Para investigar se os CD133 desempenha um papel na manutenção de propriedades de CICs HN-CIC, a abordagem de perda de função de CD133 foi conduzida em primeiro lugar. Down-regulação do CD133 em HN-CICs foi conseguido através de transdução viral com lentiviral vector expressando RNA pequeno hairpin (shRNA) visando CD133 (sh-CD133-1 e sh-CD133-2) e vetor de lentivírus expressando shRNA contra luciferase (sh- Luc) foi utilizado como controlo. As análises de imunotransferência confirmaram que lentivírus expressando tanto SH-CD133-1 e SH-CD133-2 marcadamente reduzido o nível de proteína CD133 expressão em transduzidas HN-CIC (Figura 1A). população de células com a superfície CD133-positive (CD133

+) também foi diminuída em sh-CD133 infectado HN-CICs por FACS análises (Figura 1B). Além disso, HN-CICs infectado com sh-CD133 lentivírus não manteve esferas flutuantes, mas mostrou células epiteliais-como mais ligados (Figura 1C). Observou-se também redução da expressão de genes stemness (Out-4 e Nanog) (Figura 1A), mas a maior expressão da marcador de diferenciação epitelial, CK18 (Figura 1D) na CD133 knockdown HN-CICs. Para determinar adicionalmente se a redução na área do tumor eficiência formação com CD133 sub-regulação era devida a uma diminuição da sobrevivência HN-CIC, examinámos as células apoptóticas utilizando Anexina V mais iodeto de propídio (PI) coloração. HN-CICs infectadas com sh-CD133 lentivírus expressando aumentou significativamente a percentagem de anexina V

+ /PI

+ células (Figura 1E). Juntos, estes dados confirmam ainda que a regulação negativa de CD133 resultou em uma redução de propriedades CICS e viabilidade celular em HN-CICs.

Segmentação CD133 anula in vitro e in vivo propriedades malignas do HN-CICs

Para elucidar o efeito direto da CD133 knockdown no

in vitro

propriedades malignas incluindo capacidades de migração celular, invasão de matrigel e crescimento independente de ancoragem de HN-CICs, suspensão única célula de controle- ou CD133

–

knockdown HN-CIC foram plaqueadas em câmara de Transwell (Figura 2A), a câmara de Transwell revestida com matrigel (Figura 2B) ou em agar mole (Figura 2C), e analisados. As habilidades de formação migratória /invasão /colônia de CD133 knockdown HN-CICs foram significativamente reduzidos (Figuras 2A, 2B e 2C). A seguir, procurou determinar se a infra-regulação da expressão de CD133 poderia atenuar a capacidade tumorigénica de HN-CICs

in vivo

. De nota, a inibição da expressão de CD133 significativamente retardado o crescimento tumoral mediado por HN-CIC (Figuras 2D e 2E; p 0,05; p 0,01). Além disso, a coloração imuno-histológica de tumores derivados de SH-CD133 HN-CIC exibida diminuição de Oct4 e aumento de CK18 em comparação com os de controlo tumores HN-CICs (Figura S2a e S2B). No geral, os nossos dados indicam que a depleção de CD133 inibe a atividade de iniciar tumor de HN-CICs

in vivo

.

Para elucidar a capacidade de migração de células (A), capacidade de invasão celular (B) e Anchorage crescimento independente (C) de HN-CICs (OECM1 (

parte superior do painel

), SAS (

painel inferior

)) com CD133 infra-regulação, suspensão única célula de HN-CICs infectado com CD133 espec�ico shRNA controlo ou SH-Luc lentivírus para três dias foram plaqueadas em Transwell, Transwell revestida com Matrigel e agar mole, respectivamente, e analisados ​​como descrito em Materiais e Métodos. Os resultados são médias ± desvio padrão de amostras em triplicado a partir de três experiências. (D) tumores representativos de controlo HN-CIC e de CD133-knockdown SAS-derivado HN-CIC foram gerados, e os tumores foram depois dissecados a partir do espaço subcutâneo de ratos receptores (n = 3) (contraste de fase:

esquerdo dois painéis

; GFP de imagem

: direito dois painéis

) (setas vermelhas: sh-Luc HN-CICs; setas amarelas: sh-CD133-1 HN-CICs). (E) O volume do tumor foi medido, respectivamente, após a inoculação das células CD133-knockdown ou SH-Luc que expressam SAS-derivado HN-CIC. As barras de erro correspondem ao SD. (*, P 0,05; ***, p 0,001)

A superexpressão de CD133 aumenta propriedades stemness e potenciais tumorigênicos de HNSCCs

Para investigar mais o efeito de CD133 para cima regulamento sobre as propriedades biológicas da HNSCCs, geramos HNSCCs-superexpressão CD133 estáveis ​​através de transdução mediada por lentivírus. A taxa de infecção bem sucedida de controle-GFP e HNSCCs-superexpressão CD133, depois da separação de células, variou de 93 a 94% (OECM1) e 97 a 91% (SAS), respectivamente (Figuras S1A e S1B). Os dois HNSCCs CD133-sobre-expressam (OECM1 e SAS) exibido expressão elevada de CD133 por análises de transferência de Western (Figura 3A). Além disso, descobrimos que em comparação com células de controlo que expressam GFP os HNSCCs CD133-sobre-expressam mostrou aumento significativo de CD133

+ células por FACS análises (Figura 3B). Além disso, os HNSCCs que sobre-expressam CD133 observado aumento na capacidade de formação de tumor de esfera (Figura 3C) e significativo aumento da população lateral (SP), as células (Figura 3D). Observou-se também que o aumento do nível de proteína de Oct-4 e Nanog de HNSCCs-superexpressão CD133 sob cultivo com meio isento de soro definido (Figura 3E). Em seguida, nós demonstramos que a sobre-expressão de CD133 também resultou num aumento da capacidade de invasão de células e formação de colónias de HNSCCs (Figuras 4A e 4B). De nota, HNSCCs CD133-sobre-expressam também mostrou tumorigenicidade significativamente elevada em comparação com a testemunha HNSCCs por análises xenotransplante

in vivo

(Figuras 4C; p 0,05; p 0,01). Além disso, análises de IHC demonstraram que os tumores derivados de células que sobre-expressam CD133-SAS exibida mais Oct4 mas menos coloração CK18 (Figura S2C). Colectivamente, estes resultados sugerem que a sobre-expressão de CD133 promove propriedades stemness e tumorigenicidade de HNSCCs.

(A) Expressão da proteína CD133 em HNSCCs infectadas com CD133-sobre-expressam ou controlam lentiviruse GFP foi analisada por Western blot. A quantidade de proteína de GAPDH foi designado como controlo de carga. (B) a expressão CD133 superfície celular em HNSCCs CD133-superexpressão ou de controlo foi analisada por citometria de fluxo. (C) Imagens representativas de capacidade formação esfera tumor de HNSCCs-superexpressão CD133 controle-GFP ou. (D) As suspensões de células individuais de CD133 que sobre-expressam e controlam HNSCCs-estáveis ​​expressando GFP foram incubadas com Hoescht 33342 na presença ou na ausência de 10 uM fumitremorgin C (FTC), em seguida, analisadas por citometria de fluxo para identificar as células SP. (E) As proteínas totais de células em bruto extraídos de controlo-GFP ou HNSCCs cultivadas com meio isento de soro definido durante 2 semanas foram preparadas e coradas imunologicamente contra o anti-Oct-4-sobre-expressam CD133, anti-Nanog, anti-CK18 ou anti-GAPDH anticorpos, tal como indicado. A quantidade de proteína GAPDH de diferentes extratos de células bruto foi referido como controle de carga para posterior quantificação.

Src quinase é o modulador jusante da CD133 na regulação EMT para CECP e HN-CICs

células epiteliais HNSCC pode adquirir características mesenquimais que facilitam a migração e invasão através do processo EMT [7], [33]. Em números 4A, mostramos que a CD133 promove a capacidade invasiva de HNSCCs, nós então queria explorar se CD133 seria modular a via de EMT. observação morfológica indicou que a sobre-expressão de CD133 de tipo epitelial em células mesenquimais OECM1 revelados semelhantes de alteração da forma (Figura 5A). A imunofluorescência e imunotransferência coloração exibidos que um padrão de expressão da proteína-epitelial como (E-caderina) foi diminuído, mas um padrão de expressão de proteína semelhante a mesenquimais (vimentina e fibronectina) foi aumentada em HNSCCs CD133-sobre-expressam (Figura 5B). Por outro lado, o silenciamento de CD133 reduzida marcador mesenquimais (vimentina) mas induzidas marcadores epiteliais (E-caderina) em HN-CIC (Figura 5C).

(A) A capacidade de invasão de controlo-GFP ou CD133 HNSCCs -overexpressing foram examinadas como descrito em materiais e métodos (*, P 0,05; ***, p 0,001). (B) o crescimento ancoragem independente dos HNSCCs que sobre-expressam CD133-GFP de controlo ou foi analisada (**, P 0,01; ***, p 0,001). (C) o crescimento Representante tumor de HNSCCs-superexpressão CD133 controle-GFP ou (1X10

5 células) no espaço subcutâneo de ratos destinatário (setas vermelhas: control-GFP HNSCCs; Setas amarelas: HNSCCs CD133-superexpressão) (

esquerdo do painel

). O volume do tumor foi medido após a inoculação de controlo-GFP (n = 3) ou HNSCCs que sobre-expressam CD133 (n = 3), respectivamente, (

direito painel

). As barras de erro correspondem a SD (*, p 0,05; ** p 0,01).

(A) diferença morfológica entre HNSCCs-superexpressão CD133 controle-GFP e. análise (B) Immunoblotting (

Painel

direita) e coloração confocal de imunofluorescência (

esquerdo do painel

) de marcadores relacionados com a EMT em HNSCCs-superexpressão CD133 controle-GFP ou foram analisados. (C) Os níveis de proteína de vimentina e E-caderina no indicado HN-CIC foram analisados ​​por Western blot. (D) nível de proteína de Src ou p-Src em HNSCCs que sobre-expressam CD133-GFP de controlo ou foram analisados ​​por imunotransf erência. (E) A suspensão de células isoladas de HN-CIC foi infectado com SH-Luc-expressar ou shRNAi lentirus CD133, respectivamente, e a expressão de p-Src ou Src em cima HN-CIC foi analisado por western blot. (F) HNSCCs que sobre-expressam CD133 foram primeiro tratados com PP2 10 uM (inibidor de Src) ou 10 pM U0126 (inibidor Erk) durante 24 horas. A expressão de Src, p-Src, ERK1 /2, P-ERK1 /2, vimentina, E-caherin, ou CK-18 de células acima tratados foi avaliada por análise de Western blot com GAPDH sendo um controlo de carga interna. (G) HNSCCs que sobre-expressam CD133 foram primeiro cultivadas com meio definido isento de soro, durante 2 semanas, juntamente com a adição de PP2, e a expressão de proteínas de GAPDH Oct-4, Nanog, ou no controlo (DMSO) ou células PP2 tratado foi analisado por immunoblotting.

Src via de sinalização é um importante mediador da EMT em CECP (Figura S3A) [34]. Fujimoto et al mostraram que a tirosina-513 dentro de CD19 é não só Lyn (a família de cinases Src) local de ligação, mas também do lado fosforilação, ainda mais, a interação entre CD19 e Lyn iria amplificar a atividade da família quinase Src e cascata a jusante [35]. Boivin et ai demonstraram que a CD133 é um parceiro de ligação nova de Src e é phosporylated por Src-quinase [28]. No entanto, como é que a interação entre CD133 e Src quinase ativar os efeitos a jusante, incluindo a amplificação da atividade Src permanecem obscuros? Aqui, demonstramos que a P-Src (Src activado com a fosforilação) foi aumentada em HNSCCs CD133-sobre-expressam (Figura 5D). Pelo contrário, CD133 silenciamento reduzida Src activa no HN-CICs (Figura 5E). Consistentemente, tratamento de inibidor de Src (PP2), mas não ERK1 /2 inibidor (U0126) reverteu significativamente o padrão de expressão de proteínas mesenquimais semelhante em um um epitelial semelhante, e aumentou a expressão de citoqueratina 18 (CK18), um marcador de diferenciação, em CD133 que sobre-expressam células OECM1 (Figura 5F). A sobre-expressão de CD133 promove a fosforilação de ERK1 /2 em células de glioblastoma humano [36], mas em nossos HNSCCs que sobre-expressam CD133, tratamento de ERK1 2 /inibidor (U0126) causou apenas uma ligeira influência no EMT-sobre-expressam CD133 induzida (Figura 5F e dados não mostrado). Por último, o tratamento reduziu marcadores PP2 stemness (Oct4 e Nanog) e também diminui a capacidade de formação esfera de CD133-superexpressão HNSCCs cultivadas com meio isento de soro definido (Figura 5G e dados não mostrados).

CD133 downregulation e Src inibição revogar a capacidade actividade e formação esfera p-Src na primária HN-CICs

Para verificar melhor a função fisiológica do eixo CD133 /Src sinalização mediada na primária HN-CICs, os HN-CICs derivados do paciente HNSCC primária As células foram gerados. Além disso, a expressão de CD133 em HN-CICs foi regulada negativamente por lentiviral-sh-RNAi. Consistentemente, a actividade de p-Src também foi regulada negativamente (Figura 6A). Além disso, a capacidade de formação de esfera SH-CD133 primária HN-CIC foi diminuída em comparação com a do controlo (SH-Luc) primária HN-CIC (Figura 6B). Finalmente, PP2 (inibidor da actividade da Src) tratamento primário HN-CICs também aboliu a capacidade de formação de esfera (Figura 6C).

(A) nível de proteína de CD133 e p-Src de lentivius CD133 mediada knockdown HN primária -CICs foi analisado por western blot. (B) Primária HN-CICs foram inicialmente infectados com sh-Luc ou CD133-shRNA lentivírus. Três dias após a infecção por lentivírus, a capacidade de formação de esfera células infectadas por vírus, em seguida, cultivadas em meio de selecção foram registados. (C) recentemente enriquecida primária HN-CICs foram tratados com PP2 (10 mM) durante 72 horas e a capacidade de formação esfera de PP2 trataram células HN-CICs foram examinados. Setas indicam as células esfera.

Em resumo, os nossos resultados sugerem que a sinalização CD133 /Src desempenha um interruptor principal na regulação propriedades CICS, transformação EMT e tumorigenicidade de HNSCCs (Figura 7).

Up-regulação da CD133, consequentemente, ativa o Src sinalização (p-Src) e, em seguida, promove o ganho de EMT, a valorização das propriedades stemness e tumorigenicidade em CECP.

Discussão

tumor é composta por uma população heterogénea de células, e tem-se observado que uma subpopulação de células, assim chamado cancro de células estaminais (CSCs) ou células cancerosas iniciador (CICs), dentro dos tecidos tumorais possuem propriedades stemness [37]. CSCs ou AIC são considerados como sendo responsáveis ​​pela iniciação, propagação e metástase de tumores [38], [39], [40]. Importante, a existência de AIC pode explicar porque as recorrências de cancro de radiorresistência quimiorresistência ou após o tratamento clínico em doentes com cancro [5].

CD133, um marcador da superfície celular de células estaminais hematopoiéticas e progenitoras endoteliais, tem sido proposto para ser envolvido na angiogénese, assim como cancro da tumorigenicidade [41]. CD133 foi recentemente identificado como um marcador de CICs comum para muitos tipos de tumor, incluindo HNSCC [8], [31]. Bao et ai. achar que a subpopulação de CD133

+ isolado a partir de células de tumores cerebrais apresentam propriedades CICs, são refractários à quimioterapia ou radioterapia, e promover a angiogénese para facilitar o crescimento do tumor cerebral [42]. Enquanto isso, CD133

+ CICs em tumores sólidos caracterizados resistência conferem à quimioterapia [43]. Pelo contrário, depleção CD133 reprime a capacidade de formação de colónias de cancro do cólon [44]. Portanto, uma melhor compreensão das características biológicas de CD133

+ CICs pode explicar o fracasso da gestão de câncer, e vai nos fornecer novas abordagens terapêuticas [45].

Aqui, nós avaliamos o papel de CD133 em a manutenção das características stemness e potencial tumorigénico de HNSCCs e HN-CIC pela knockdown mediada por lentivírus ou a sobre-expressão de CD133 (Figuras 1 e 3). Esgotamento de CD133 promoveu diferenciação e diminuiu i

n vivo

propriedades tumorigénicas de HN-CICs (Figuras 1 e 2). Considerando que, a sobre-expressão de CD133 aumenta tumor capacidade de formação de esfera, células populacionais lado, a expressão de genes stemness (Oct4 e Nanog) e promove a capacidade tumorigénico do CECP (Figuras 3 e 4).