Abstract

Os marcadores microssatélites são utilizados para a perda de heterozigosidade, desequilíbrio alélicas e analisa clonalidade em cancros. Geralmente, o ADN do tumor é comparado ao ADN normal correspondente. No entanto, o ADN normal não está sempre disponível, e podem apresentar índices de alelos aberrantes devido a variações no número de cópias no genoma. Além disso, os picos stutter pode complicar a análise. Para usar marcadores microssatélites para o diagnóstico de cancro da bexiga recorrente, que teve como objetivo selecionar marcadores sem picos de gaguejar e uma relação constante entre alelos, evitando assim a necessidade de uma amostra de DNA controle. Foram investigados 49 marcadores microssatélites com repetições tri- e tetranucleotídeo em regiões comumente perdidos no cancro da bexiga. Com base na análise de 50 ADN de sangue dos 12 melhores marcadores de desempenho foram seleccionadas com alguns picos stutter e uma relação constante entre os picos de alturas. Por marcador superior e inferior cortadas valores para os rácios de alelos foram determinadas. LOH dos marcadores foi observada em 59/104 ADN de tumor. Em seguida, determinou-se a sensibilidade do painel de marcador para a detecção de cancro da bexiga recorrente por ensaio 102 amostras de urina destes doentes. Sensibilidade foi de 63% quando os pacientes foram estratificados para LOH em seus tumores primários. Nós demonstramos que se frente-selecção de marcadores microssatélites elimina a necessidade de uma amostra de sangue correspondente. Para o diagnóstico de recorrências de cancro da bexiga na urina o que reduz significativamente os custos. Além disso, essa abordagem facilita a análise retrospectiva de amostras de tumores de arquivamento de desequilíbrio alélico

Citation:. Van Tilborg AAG, Kompier LC, lurkin I, Poort R, El Bouazzaoui S, van der Keur K, et al. (2012) Seleção de microssatélites marcadores para cancro de bexiga diagnóstico sem a necessidade de Correspondente Sangue. PLoS ONE 7 (8): e43345. doi: 10.1371 /journal.pone.0043345

editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japão

Recebido: 02 de abril de 2012; Aceito: 19 de julho de 2012; Publicação: 22 de agosto de 2012

Direitos de autor: © van Tilborg et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo programa da Comunidade Europeia Seventh Framework FP7 /2007-2012, acordo de subvenção n ° 201663; Holandês Cancer Society conceder nenhuma. EMCR 2007-3863. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

análise de microssatélites utiliza, sequências repetidas altamente polimórficos curtas dentro do genoma. O número de repetições que formam um microssatélite específica varia muitas vezes entre o alelo materna e paterna. Os microssatélites são usados ​​para determinar o equilíbrio alélico (IA) ou perda de heterozigosidade-(LOH) em determinados loci no genoma do tumor e pode ser utilizado como um marcador para a presença de células tumorais. Para esta finalidade microssatélite analisa comparar a intensidade dos produtos de amplificação do paterna e materna do alelo a partir de uma amostra de tumor contra as proporções de um controlo normal correspondente (por exemplo leucócitos). Quando o marcador microssatélite é informativo (o comprimento dos dois alelos difere) a quantidade de produto a partir de ambos os alelos será o mesmo. Em um sequenciador capilar este é apresentado como dois picos de cerca de igual altura. LOH ou IA de uma região cromossómica em cancro é geralmente concluído quando a razão entre os picos de alelos no ADN do tumor é menor do que ou sobre 0,5-0,7 1,5-2, quando comparado com o controlo [1], [2], [3], [4].

o câncer de bexiga (BC) é a quinta neoplasia maligna mais comum no mundo ocidental depois do câncer de mama, próstata, colo-retal e pulmão [5]. Mais de 70% do manifesto BC primária como de baixo grau, não-invasivos musculares (PTA, o PT1) tumores. Após a remoção dos tumores através da ressecção transuretral (TUR), a taxa de recorrência é elevada (70%) e muitos pacientes desenvolvem recorrências múltiplas metacrônicos [6]. A progressão de um não-invasiva do músculo (NMIBC) para um cancro invasivo do músculo (MIBC) ocorre em 10-20% dos casos, especialmente se o tumor original é de alta qualidade [7], [8].

Actualmente, o procedimento padrão para o diagnóstico BC é cistoscopia. A cistoscopia é uma abordagem de diagnóstico invasivo que é desagradável para o paciente, que tem de passar por esses controlos a cada 3-12 meses durante muitos anos após a ressecção do tumor primário. Nós estimamos que entre de 1-2 milhões cistoscopias estão sendo realizados por ano na UE e nos EUA para o acompanhamento desses pacientes. Infelizmente, o exame citológico de células presentes na urina vertida sozinho não fornece uma alternativa segura para a triagem cistoscopia devido à sua baixa sensibilidade, especialmente para a detecção de tumores de baixo grau [9]. Da mesma forma, os ensaios baseados urina molecular atuais, como a hibridização fluorescente in situ (FISH), NMP22 e BTA têm sensibilidades que são baixos para a detecção de sua maioria de baixo grau e estágio BC recorrente [10], [11]. Como resultado, um número de diferentes análises moleculares em ADN isolado a partir de células presentes em amostras de urina vertida têm sido desenvolvidas com o objectivo de melhorar a sensibilidade de detecção e para reduzir a frequência de exames cistoscopia invasivos. Um desses ensaios envolve a detecção de mutações no gene da

FGFR3

[12]. Mutações nesse gene são muito frequentes nos tumores pTa bexiga (até 75% [13], [14]). No entanto, este ensaio não é uma opção para a detecção de tumores sem a mutação neste gene, especialmente desde que para pacientes com um

FGFR3

tumor primário tipo selvagem, a frequência de

FGFR3

mutações em recorrências é muito menor do que para os pacientes com um

FGFR3

tumor primário mutante (19% e 81%, respectivamente) [15].

Muitos tumores exibem alterações genômicas como mutações genéticas e aberrações numéricas afetando curta genômico regiões de cromossomas inteiros. Estas alterações genómicas específicas do tumor podem ser detectadas por meio de técnicas moleculares, tais como peixes [16], [17] ou por análise de microssatélites (MA). Ensaios que detectam estas alterações estão provando ser particularmente útil na identificação de pacientes com câncer através de métodos não invasivos ou pouco invasivos [18], [19], [20], [21]. No cancro da bexiga, por exemplo, perdas de partes ou cromossomo 9 total são comumente observados à medida que surgem no início do desenvolvimento do tumor [22]. A progressão da doença é geralmente acompanhada por alterações numéricos adicionais envolvendo cromossoma 8P, 10, e 17 p [23], [24], [25]. Nós e outros autores mostraram anteriormente que a detecção de cancro da bexiga recorrente pode ser melhorada por meio de análise de microssatélites em células obtidas a partir de amostras de urina vertida [4], [26].

Durante este trabalho observou-se que os produtos de PCR de microssatélites com repetições dinucleótido muitas vezes tinham vários picos (gagueira) devido à dissociação dos filamentos de DNA e recombinação aberrante. Além disso, muitos marcadores microssatélites teve relações aberrantes entre as alturas de pico no DNA de controle, possivelmente devido a variações no número de cópias no genoma. Além disso, a necessidade de analisar o ADN de sangue de controlo feita a ensaio microssatélites (MA) caro [27]. Para resolver esses problemas de forma mais sistemática, nós selecionamos tri- e repete tetranucleotídeo em regiões genômicas comumente afetadas no cancro da bexiga e primers em torno destas repetições projetado para a amplificação [28]. Estes novos marcadores microssatélites foram então testados para rácios altura de pico constante e desempenho técnico (isto é, sem picos gaguejar, amplificação feira), em uma série de amostras de DNA de sangue. Os 12 melhores marcadores de desempenho foram depois analisadas em DNAs de urina de indivíduos saudáveis ​​para determinar os valores de corte de a razão entre as alturas dos picos a fim de obter uma especificidade de 95%. Finalmente, validou os marcadores em DNAs de urina de pacientes com diagnóstico de um tumor da bexiga recorrente.

Materiais e Métodos

Amostras

As amostras de sangue foram coletadas de 50 pacientes com câncer de bexiga . As amostras de urina foram coletadas de 106 indivíduos sem história de doença neoplásica. Estas amostras de tumores negativos foram obtidos durante um estudo de rastreio em homens idosos (mais de 50 anos de idade), sem sinais prévios de câncer de bexiga [29]. DNA de 104 tumores primários estava disponível para a análise LOH. Todos os tumores eram não-invasiva do músculo (89% de Ta, T1 11%). Todos os tumores eram amostras de grau 1 ou 2. urina de pacientes agendados para TUR foram coletadas antes da ressecção de um histologicamente comprovada tumor recorrente de 102 pacientes. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes e protocolos de pesquisa foram aprovados pelos conselhos de revisão institucionais ou comitês de ética nos dois países envolvidos (as Comissões Região Central Dinamarca em Investigação Biomédica Ética Dinamarca e o The Medical Comissão de Ética do Erasmus MC (METC) , a Holanda). Dados clínico-patológicas para estas amostras é dada na Tabela S1.

extração de DNA e análise de LOH

Após a coleta, a urina foi verificada a quantidade de leucócitos, eritrócitos e nitrito com uma vareta (Siemens Multistix ® 10 SG). As células foram sedimentadas por centrifugação a 3000 rpm durante 10 minutos a 4 ° C. Os sedimentos celulares foram lavados duas vezes com 10 ml de PBS, ressuspensas em 1 ml de PBS, transferido para um frasco de Eppendorf, e recolhido por centrifugação durante 5 minutos a 6000 rpm. O sobrenadante foi descartado e a pelete celular foi armazenada a -20 ° C até o isolamento do ADN. O DNA foi extraído a partir de sangue, tecido tumoral (fixadas com formalina embebido em parafina (FFPE)) e urina e purificada com kits adequados (Qiagen, Hilden, Alemanha) seguindo as instruções do fabricante. As concentrações de DNA foram medidas com um Quant-iT PicoGreen® dsDNA Assay Kit (Molecular Probes, Leiden, Países Baixos). PCR de diferentes marcadores microssatélites foi realizada com os pares de iniciadores distintos dos quais um oligonucleótido foi marcado na extremidade 5-fim com os corantes fluorescentes 6-FAM (Invitrogen). A amplificação de ADN específica foi realizada num volume de reacção de 15 ul incluindo dNTPs 0,2 mM, MgCl2 2,5 mM e 0,5 U de AmpliTaq. Bicicleta foi efectuada com um termociclador Biometra usando as seguintes condições de temperatura: 95 ° C durante 5 min, 28 ciclos a 95 ° C durante 45 s, 55 ° C durante 45 s, e 72 ° C durante 45 s, seguido de uma extensão final passo de 10 min a 72 ° C. Os produtos de PCR foram subsequentemente desnaturada durante 1 min a 95 ° C em formamida Hidi (Applied Biosystems) e separados num ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer equipada com uma matriz capilar 36 centímetros carregado com POP-7 polímero. 500-Liz foi usado como tamanho padrão interno (Applied Biosystems). Análise das amostras foi realizada com a versão do software GeneMarker 1.7 de SoftGenetics (State College, PA).

A análise estatística

O programa Statistical Package for the Social Sciences 18 (SPSS, Inc.) foi utilizado para análise de dados. Sensibilidade, especificidade e preditivos valores foram determinados para cada marcador e para todos os marcadores. a precisão do diagnóstico para o modelo com marcadores de metilação, tal como determinada por AUC (área sob a curva). Os resultados foram considerados estatisticamente significativos a p . 0,05

resultados

Seleção de microssatélites

O nosso projecto consistiu em diferentes fases (Figura 1). Nós anteriormente utilizado um grupo de 20 marcadores microssatélites para a detecção de câncer de bexiga recorrentes na urina anulado de pacientes sob vigilância de possíveis tumores recorrentes [4], [18], [30], [31], [32]. No entanto, com vários desses marcadores avaliando relação alelo foi difícil devido a gaguejar picos. Além disso, esses marcadores não cobrir com precisão as áreas mais interessantes de LOH em tumores de bexiga. Além disso, em muitos pacientes, a proporção alelo no DNA de controlo variou possivelmente devido a variações no número de cópias genómicas como exibido na Figura 2A. Com base nesta experiência, decidimos para seleccionar um novo painel de marcadores microssatélites com uma proporção relativamente constante entre alelos obliterante, assim, a necessidade de uma amostra de ADN de sangue de controlo. Para reduzir a possibilidade de formação de gagueira pico, foram selecionados 49 tri e tetranucleotídeo repetir contendo microssatélites a partir do navegador UCSC genoma (https://genome.ucsc.edu), eo painel de Généthon (http: //cedar.genetics. soton.ac.uk/pub) em regiões de cromossomos 8, 9, 10, 11 e 17 que exibem LOH em cancros da bexiga [28]. Os marcadores microssatélites tinha que ter um nível mínimo de heterozigosidade de 65% e um comprimento de fragmentos entre 100-300 pb para reduzir as dificuldades de amplificação de DNA cortado.

No eixo Y, a relação entre o dois alelos é dada. No eixo dos X, os diferentes marcadores microssatélites são listados. A. Os boxplots mostram que alguns marcadores usados ​​anteriormente tem uma grande variação na sua relação alelo com base na análise de amostras de DNA de sangue de 50 indivíduos. B. Comportamento dos 12 marcadores seleccionados, indicando que eles têm muito pouca variação no seu rácio alelo quando testado em sangue normal e a urina de indivíduos saudáveis. C. Em DNA tumor primário a relação alelo é muito mais variável devido à LOH /AI.

reprodutibilidade técnica e valores de corte para cada marcador

Os marcadores foram então testados em 50 amostras de sangue e 12 marcadores microssatélites com o maior percentual de heterozigosidade e uma relação de pico entre alelos que estava perto de 1 foram selecionados para um estudo mais aprofundado (Tabela 1, Figura 2B). Informações sobre os outros 37 marcadores é dada na Tabela S2. A Figura 3 mostra electroferogramas dos marcadores. Nós determinamos as melhores definições para reprodutibilidade variando concentração de DNA de entrada e número de ciclos. Com base nesta optamos por utilizar 5-10 ng de DNA de entrada em 28 ciclos de PCR para experiências posteriores. Para determinar os valores de corte de tal modo que cada marcador iria ser de 95% de especificidade em um teste de diagnóstico de urina, que lhes ensaiadas em duplicado em DNAs de urina de 106 controlos não cancerosas de 50 anos e mais velhos. Os 12 marcadores com os respectivos valores superior e inferior cortadas estão listados na Tabela 2. A Tabela 2 também mostra que os desvios padrão são inferiores a 10%.

No eixo dos Y, a intensidade de pico é dada. No eixo dos X, o tamanho do fragmento é dada em pares de bases. No lado esquerdo, os resultados a partir de tecido normal são mostrados. Note-se que estes marcadores têm poucos ou nenhum gaguejar picos e uma proporção relativamente constante (próximo de 1) entre as alturas dos dois alelos. No lado direito, os resultados de amostras de tumores representativos com LOH são mostrados.

O desempenho do ensaio de microssatélites em tumores

Posteriormente, os marcadores foram testados em DNA a partir dos tumores primários da bexiga de 104 pacientes. Noventa e dois tumores foram pta, 11 eram PT1, e de 1 tumor nenhuma informação palco estava disponível. Vinte e quatro tumores eram de grau 1, 79 grau 2, enquanto que a informação de grau estava faltando em 1 caso. LOH ou desequilíbrio alélica foi definida quando a razão entre os picos mais elevado do que era o extremo superior ou inferior do que a borda inferior, tal como indicado para cada marcador na Tabela 2. LOH para um ou mais marcadores foi encontrado em 59 tumores (57%), enquanto 45 tumores não têm LOH para qualquer um dos marcadores testados. Os marcadores mais frequentemente perdidos estavam todos no cromossomo 9, D9S299, D9S252 e D9S752 (LOH em 29-37% de todas as amostras) (Tabela 3). Qualquer LOH foi encontrada em 53/92 (58%) pta, 6/11 (55%) pT1 e em 12/24 (50%) G1 e 47/79 (60%) tumores G2. As proporções de alelos em ADN do tumor eram muito mais variável do que em DNA de sangue ou urina normal, devido ao LOH /AI (Figura 2C).

Determinação da sensibilidade dos marcadores para detectar recorrências em urine- DNA derivado

em seguida, determinou-se a sensibilidade dos marcadores para a detecção de tumores recorrentes nos mesmos pacientes dos quais analisamos o tumor primário. Um total de 102 amostras de urina foram disponível, obtido antes da ressecção de um tumor recorrente nestes pacientes. microssatélites ensaios foram realizados em duplicado. LOH foi assumido quando a relação alelo pico de ambos os testes estava fora dos valores de corte mostrados na Tabela 2. Os marcadores D9S752, D9S252, D9S304, D9S299 e G10693 indicadas LOH em aproximadamente 20% das amostras (Tabela 4). Das 102 amostras, 43 amostras não apresentaram perda de qualquer um dos marcadores testados. Se assumirmos que os testes positivos falsos não são possíveis desde que todos os pacientes tiveram uma recorrência, a sensibilidade dos 12 marcadores em conjunto é de 58%. Sensibilidade acordo com o grau do tumor primário é dado em S1 Arquivo. A especificidade do teste é por definição 100% porque todas as urinas foram associados com um tumor recorrente. Se seleccionado a partir de urinas aqueles pacientes cujo tumor primário tinha LOH para pelo menos um marcador, a sensibilidade para a detecção de a recorrência de ADN na urina aumentou para 63%. Quando combinado com os dados de citologia, esta sensibilidade aumentada para 80% (S2 Arquivo).

Discussão

Neste estudo, descrevemos uma abordagem para a escolha de marcadores microssatélites para a determinação do número de cópias e tumor LOH -associated que têm um excelente desempenho técnico. A abordagem foi anteriormente utilizada por Frigerio et al., Que implementado limites específicos de marcadores de ADN, avaliando a partir de tecido normal de sangue e de controlo [1]. No entanto, a nossa abordagem difere em que nós pré-selecionado nossos marcadores para rácios de alelos constantes, aumentando assim a precisão e pelo fato de que nós selecionamos repete tri- e tetranucleotídeo que têm poucos ou nenhuns picos gaguejar. Por adiantado avaliar os valores inferior e superior de corte off com base em uma análise de ADN de contraprova, a necessidade de comparar amostras de pacientes com sangue correspondente é, portanto, evitada. Este procedimento de selecção pode ser aplicado a qualquer tipo de tumor. Esta abordagem também facilita a análise retrospectiva de amostras de tumores de arquivamento de desequilíbrio alélico.

Foi examinada a quantidade de DNA de entrada e o número ideal de ciclos de PCR. A quantidade de ADN de entrada é importante porque demasiado baixas concentrações podem resultar em amplificação preferencial de um dos dois alelos que conduzem a LOHS positivos falsos [33]. Os marcadores microssatélites são ideais para a determinação de perda ou a amplificação de regiões genómicas de ADN FFPE-derivada, porque ambos os alelos de um marcador irá ser igualmente afectadas pela qualidade do ADN (comprimento), desde que a diferença em comprimento entre alelos não é muito grande. análise de microssatélites é barato com custos na ordem de cerca de 1 euro por ensaio. Para um painel de 10 marcadores, os custos, incluindo o isolamento de ADN, seria equivalente a menos de 15 euros. Uma desvantagem é que microssatélites não são adequados para a multiplexação. Em nossa experiência, isso sempre leva à amplificação ineficiente de alguns dos marcadores e isso resulta em maiores desvios-padrão em experiências duplicadas.

As perdas nos cromossomos 8, 9, 10, 11 e 17 são frequentes no cancro da bexiga e pode ser detectado por análise de microssatélites. Este estudo determina o potencial de detecção de câncer de bexiga por análise de microssatélites em um conjunto de amostras de urina coletadas antes da ressecção transuretral do tumor de acompanhamento (pré-TUR urina). O estabelecimento de valores-limite específicos de marcadores com base em medições de índices de alelos em amostras de urina de 106 indivíduos saudáveis ​​nos permitiu definir a especificidade do método para o estudo posterior. Uma vez que os valores limite determinada individualmente garantida especificidade óptima para cada um dos marcadores analisados, interpretado um LOH em um único locus já como indicativa da presença de células tumorais. Aplicando esta regra, que obtido para amostras de urina pré-Tur uma sensibilidade global de 58% para a detecção de tumores recorrentes e 63% quando os doentes foram estratificados por LOH no seu tumor primário. Esta sensibilidade é comparável com a sensibilidade que já tinha encontrado com o primeiro conjunto de marcadores microssatélites, embora o novo painel de marcadores foi projetado especificamente para cobrir essas regiões genômicas que exibem LOH em não-musculares tumores de bexiga invasivo (NMIBC). a precisão do diagnóstico para o modelo com todos os 12 marcadores foi de 73% como determinado pela AUC (área sob a curva). Esta precisão ainda era de 73%, quando apenas seis marcadores foram testados (D9S252, D9S752, D9S304, D8S1125, D8S1130, G10693). Com esta seleção, fomos capazes de identificar 95% (56 de 59) de todas as amostras que mostram LOH quando testado para todos os 12 marcadores. A principal vantagem da utilização de uma menor variedade de marcadores microssatélites é, ao lado de uma redução dos custos, a redução da quantidade de ADN de entrada necessário, tornando este ensaio também acessível para as amostras em que apenas uma quantidade muito limitada de tecido está disponível.

em outros estudos que utilizaram análise mutação do

gene FGFR3

a fim de diagnosticar tumores recorrentes [34] [35].

FGFR3

mutações são encontradas em 60-70% dos NMIBC e, portanto, fornecer uma ferramenta ideal para a vigilância de pacientes desde o ensaio de mutação é 100% específico. A sensibilidade, no entanto, depende da presença de suficientes células tumorais na urina e esta é também uma ressalva para o ensaio de microssatélites. A sensibilidade aumenta quando várias amostras de urina são analisados. Com uma sensibilidade de 50% analisando 2 amostras, aumentará a sensibilidade para 75% etc. Uma combinação de análise de microssatélites com os marcadores aqui apresentado e o

FGFR3

teste é o assunto de um estudo longitudinal em 800 amostras de urina a partir de 147 pacientes (Zuiverloon et al., em preparação).

Informações de Apoio

arquivo S1.

LOH no pré-TUR urina de acordo ao grau do tumor primário

doi:. 10.1371 /journal.pone.0043345.s001

(DOCX)

arquivo S2.

Comparação de LOH e Citologia em amostras de urina pré-TUR

doi:. 10.1371 /journal.pone.0043345.s002

(DOCX)

Tabela S1. .

Os dados do paciente

doi: 10.1371 /journal.pone.0043345.s003

(XLSX)

Tabela S2.

Detalhes de marcadores não incluídos no estudo

doi:. 10.1371 /journal.pone.0043345.s004

(XLSX)