Abstract

As células T reguladoras (Tregs) desempenham um papel essencial na manutenção da auto-tolerância e homeostase imune. Apesar de muitos estudos sobre a correlação entre a acumulação Tregs e idade, ou por doenças malignas, o mecanismo relacionado não tem sido bem explorado. Para descobrir o mecanismo de acumulação de Tregs no cancro da bexiga urinária idade, que examinou o gene senescência celular celular romance

SENEX

e expressão relevante mRNA do gene apoptose em ordenados CD4 + CD25

oi Tregs de doadores UBC idosos, avaliada perfis de citocinas séricas relacionadas com imunopatologia tumor, e explorou ainda mais a relação entre a

SENEX

secreção de expressão, expressão do gene apoptose e de citocinas. Depois de ter silenciado para baixo a expressão do gene SENEX com interferência de RNA, também avaliamos a apoptose celular de Tregs classificadas de pacientes com idade entre UBC em resposta a H

2O

2 mediada por estresse. Nossos dados indicam que upregulated

SENEX

expressão de mRNA em Tregs de pacientes com idade entre UBC foi correlacionada com a expressão de genes pró-apoptóticos e concentração de citocinas. Silenciamento

SENEX

expressão do gene aumento da apoptose celular e a expressão do gene pró-apoptótico de Tregs, em resposta a H

2O

2 mediada por stress. Upregulated

SENEX

expressão de mRNA em conjunto com a diminuição da expressão de gene pró-apoptótico e perturbações na síntese de citoquinas podem contribuir para a proliferação Tregs e promover a tumorigénese e metástase. No geral, a regulação positiva do gene senescência celular

SENEX

, associou-se a regulamentar a acumulação de células T no cancro da bexiga urinária idade. Nosso estudo fornece uma nova visão sobre a compreensão da acumulação Tregs periférica em doenças malignas com idades entre

Citation:. Chen T, Wang H, Zhang Z, Li Q, Yan K, Tao Q, et al. (2014) A Novel Cellular Senescence Gene,

SENEX

, está envolvido em Peripheral Regulatory T Cells Acumulação na Aged cancro de bexiga urinária. PLoS ONE 9 (2): e87774. doi: 10.1371 /journal.pone.0087774

editor: Pranela Rameshwar, Rutgers – New Jersey Medical School, Estados Unidos da América

Recebido: 03 de setembro de 2013; Aceito: 30 de dezembro de 2013; Publicação: 05 de fevereiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Chen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (item No. 81.141.104, No. 81.272.259) e Natural Science Foundation da província de Anhui (ponto No.11010402168). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

células

T reguladoras (Tregs) desempenham um papel essencial na manutenção da auto-tolerância e homeostase imune suprimindo uma ampla variedade de respostas imunes fisiológicas e patológicas contra eu e não-eu, assim como antígenos tumorais quase auto [1 ], [2]. Recrutados para tecidos tumorais, Tregs expandir e tornar-se activado em tecidos de tumor e nos nodos linfáticos de drenagem, suprimir as respostas imunes antitumorais [3]. Verificou-se que sangue periférico CD4 + CD25 + acumular dramaticamente nos seres humanos saudáveis ​​com idades compreendidas entre os roedores e [4] – [5]. O aumento da proporção Tregs contribui para a imuno-supressão relacionada com a idade, aumenta a susceptibilidade a doenças infecciosas e cancro [6]. Além disso, o aumento do número de Tregs têm sido observados em pacientes com cancro da bexiga urinária (UBC), com a expressão de Foxp3 tumoral, um marcador Tregs específicos, correlacionada com o prognóstico clínico [7]. acumulação intratumoral de Tregs também têm sido observadas em cancro colorrectal, glioma e carcinoma hepatocelular [8] – [10]. Suprimindo a resposta anti-tumoral, essas Tregs intratumorais acumulados são encontrados para ser relacionada com prognóstico pobre [8] – [10]. Apesar de todos os esforços de pesquisa acima, os mecanismos detalhados ainda não foram bem elucidados. Um estudo recente aproxima acumulação Tregs de uma nova perspectiva, relatando que apoptose celular está envolvido na acumulação de Tregs no processo de envelhecimento. Após 24 h em cultura, a partir de animais velhos Tregs morreu significativamente menos ao longo deste ensaio do que Tregs de ratinhos jovens, sugerindo que Tregs de ratinhos envelhecidos são mais resistentes à apoptose [11]. No entanto, os mecanismos subjacentes à sua resistência a apoptose em seres humanos idosos, especialmente em doentes com cancro com idades estão ainda a ser exploradas.

Estudos recentes têm mostrado que a sobre-regulada senescência celular celulares podem contribuir para a resistência à apoptose de células humanas senescentes. Uma investigação foi feita a identificação de um novo gene,

SENEX

, que regula a tensão induzida vias prematuros senescência (SIPS) em células endoteliais (ECS) [12]. Interessantemente, estas células senescentes induzidas por

SENEX

são resistentes ao factor de necrose tumoral (TNF-α) apoptose induzida por [12]. Além disso, em determinadas circunstâncias, algumas células senescentes poderia até mesmo mudar seus fenótipos em linhagens opostas. novo mecanismo revela que Tregs humanos poderia induzir a senescência, mas não apoptose em células T naive e efectoras respondedoras [13]. Estas células T de resposta senescentes induzidas por Tregs mudar seus fenótipos e perfis de citocinas, e possuem função supressora potente. Grande atenção foi recentemente pago a senescência celular, no entanto, o papel potencial da expressão do gene senescência em pacientes com câncer com idade envolvidos na acumulação Tregs permanece em grande parte desconhecido.

Para analisar a contribuição potencial da senescência e gene apoptose expressão periférica acumulação Tregs em malignidades idosos, temos primeiro classificado CD4 + CD25

oi Tregs em pacientes com idades entre UBC, em seguida, examinou os níveis de transcrição de expressão de mRNA do gene relevante no classificadas CD4 + CD25

oi Tregs. Além disso, os perfis de citocinas relacionadas com a imunopatologia tumor foram avaliadas como a avaliação indireta para a função das células T. Nós também avaliou a relação entre o gene senescência

SENEX

secreção de expressão de mRNA e citocinas. Em seguida, avaliou-se a apoptose celular de Tregs cultivadas a curto prazo de pacientes com idade entre UBC em resposta a H

2O estresse

2 mediada depois

SENEX

expressão do gene foi silenciado com a interferência RNA. Nossos dados fornecidos evidência de que upregulated

SENEX

expressão de mRNA em Tregs de pacientes UBC com idade foram correlacionadas com a concentração de citocinas e expressão de genes pró-apoptóticos. Silenciando

SENEX

expressão do gene aumento da apoptose celular e expressão de genes pró-apoptóticos em Tregs cultura de curto prazo, em resposta a H

2O

2 mediada por estresse. Upregulated

SENEX

expressão de mRNA em conjunto com a diminuição da expressão de gene pró-apoptótico e perturbações na síntese de citocinas pode contribuir para a proliferação de Tregs e promover a tumorigénese e metástase. Em conclusão, nosso estudo fornece uma nova visão sobre a compreensão da acumulação Tregs periférica em malignidades idosos.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Todos os participantes assinaram uma declaração de informado por escrito consentimento. Os procedimentos descritos neste estudo foram aprovados pelo comitê de ética do Hospital Segunda Universidade Médica de Anhui.

Os doentes e dadores saudáveis ​​

O sangue periférico (PB) amostras de 38 pacientes com idades entre UBC (62 a 79 anos, com idade média de 70,13), 34 controles saudáveis ​​idosos (60 a 74 anos, idade 68,72) e 37 controles jovens saudáveis ​​(22 a 56 anos significa, idade 43.25 dizer) foram examinados na segunda Hospital da Universidade de Medicina de Anhui 2010-2013. Nenhum dos pacientes receberam terapia anticâncer antes de ser inscrito. Concurso de doença auto-imune, vírus da imunodeficiência humana (HIV) ea sífilis foi excluído para todos os indivíduos inscritos. O estadiamento clínico foi realizado após exame radiológico pré-operatório e por parâmetros clínicos em conjunto com o exame patológico dos espécimes ressecção transuretral de acordo com a classificação TNM de 1997 (Union Internationale Contre Cancer le).

Os anticorpos e citometria de fluxo

Os seguintes anticorpos monoclonais (mAbs) específicos para antigénios de superfície humanos foram adquiridos a partir de Beckman Coulter Immunotech-(Marselha, França): ficoeritrina (PE) -conjugated anticorpos anti-CD4 (13B8.2 clone); isotiocianato de fluoresceína (FITC) anti-CD25 -conjugated (clone B1.49.9); Peridinina clorofila-Proteína Cychrome5.5 (PerCP-Cy5.5) conjugado anti-CD127 (clone SK3); kit de reagentes de três cores para a Tregs contendo de PE-conjugado anti-CD4, conjugado com FITC anti-CD25, e PerCP-Cy5.5 conjugado anti-127 (UCHT1, 13B8.2 e clone B911); e o seu anticorpo de controlo de isotipo. BU-anexina V-FITC Apoptosis Detection Kit (Biouniquer Nanjing, China) foram utilizados para avaliação de Treg apoptose celular. As células foram analisados ​​e classificados usando fluxo Coulter Epics XL citômetro (FCM) com o sistema II software e COULTER EPICS ALTRA Sistema HyPerSortTM com a Expo 32 multicomp Software (Beckman Coulter, Miami, FL, EUA).

Exame de periférico CD4 + CD25 + CD127

baixas células

Sobre 2-5 ml de PB foi recolhida. Todas as amostras foram anticoagulados com heparina e examinadas dentro de 4 h. Cerca de 100 ul de sangue anti-coagulado foi incubada a 25 ° C durante 15 minutos com 5 ul conjugado com FITC específico-CD25 mAb, 5 ul conjugado com PE específico para CD4 mAb, 5 ul PerCP-Cy5.5-conjugado anti-127 mAb e seus controles isotípicos apropriados. Após a incubação, as células vermelhas do sangue foram lisadas e lavadas em PBS duas vezes. As células coradas foram rapidamente detectadas utilizando o FCM e analisadas usando software de sistema II. Tal como descrito anteriormente [14], a frequência de células CD4 + CD25 + CD127

baixas Tregs foi expressa como uma percentagem de células T CD4 + por gating sequencial em linfócitos e células CD4 + T.

Isolamento das células T CD4 + CD25

altos e CD4 + CD25- Cells

Cerca de 15-20 ml de PB foi coletado para separação de células. As células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram isolados por separação em gradiente de densidade usando CAPPEL de Separação de Linfócitos LSM Médias (MP Biomedicals, Solon, OH). Isolado PBMCs foram lavadas 3 vezes com PBS. Cerca de 1 × 10

7 PBMC foram corados com superfície conjugado com PE e anti-CD4 conjugado com FITC anti-CD25. Então CD4 + CD25

células de alta e CD4 + CD25- foram classificados usando as portas em uma célula-classificador Becton Contador de fluxo de citometria (ALTRA Sistema HyPerSortTM). Como nós previamente descrito [15], a pureza consistente de 93% foi obtido para ambas as frações celulares high T e de células CD25 CD4 + CD4 + CD25

Cultura de Células e Tratamento

a citometria de fluxo classificados CD4 + CD25high Treg CD4 + e CD25- Teffs foram plaqueadas em placas de 24 poços (Wuxi ninho Biotechnology Co., Ltd, Wuxi, China), e cultivadas em meio RPMI-1640 (Hyclone) contendo 10% de FBS ( Gibco) e antibióticos durante 24 h. Em seguida, as células foram tratadas com concentrações de subcytotoxic H

2O

2 (100 uM) durante 2 horas, como um indutor do stress. Todas as células foram incubadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 atmosfera incubadora.

Transfection siRNA

ordenada CD4 + CD25

elevados e CD4 + CD25- células de UBC pacientes idosos e dadores saudáveis ​​foram transfectadas com ARNsi, utilizando lipofectamina 2000 (Invitrogen) de acordo com os protocolos do fabricante. A concentração final de ARNip foi de 33 nM. Os duplexes de siRNA segmentação

SENEX

mRNA (as sequências listadas na Tab 1) e controlar siRNA (sequência mexidos) foram sintetizados pela Invitrogen (Xangai, China).

Exame de Cellular apoptose

a citometria de fluxo ordenado CD4 + CD25

altos Tregs e CD4 + CD25- Teffs foram coradas com anexina V isotiocianato de fluoresceína-(anexina V-FITC) e iodeto de propídio (PI, Biouniquer, Nanjing, China) de acordo com as instruções do fabricante. As células foram então incubadas durante 15 min na obscuridade, antes de ser sujeita a análise num citómetro de fluxo (FACSCalibur, Becton Dickinson).

quantitativa em tempo real A análise de PCR

O ARN total foi isolado utilizando o kit RNeasy (Qiagen). O ADNc foi sintetizado com o SuperScript III (Invitrogen) kit de síntese de transcriptase reversa. Quantitative PCR em tempo real foi realizada em 7000 Real-Time PCR System (Applied Biosystems) usando o Mesagreen qPCR Mistura Principal Plus para SYBR Ensaio (Takara). Os iniciadores utilizados e as suas sequências estão listadas na Tabela 1.

Serum citocinas

As amostras de soro de pacientes UBC e controles saudáveis ​​foram coletadas. A concentração de IL-2, IL-10, IL-17, TNF-α e TGF-β foi determinada utilizando um ensaio de imunossorvente ligado a enzima (ELISA) kits (eBioscience) de acordo com as instruções do fabricante.

Estatística as análises

a análise estatística foi realizada utilizando o software SPSS 15.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). significância estatística das diferenças foi determinado pela não paramétrico desemparelhado de Mann-Whitney

U

-teste e

t

teste de Student paramétrico para amostras pareadas ou não pareadas, quando apropriado. As correlações foram avaliadas pelo teste de coeficiente de Pearson. As diferenças foram consideradas significativas para valores de p inferior a 0,05.

Resultados e Discussão

aumentou acentuadamente CD4 + CD25 + CD127

baixa frequência Treg e Fator de Transcrição FoxP3 mRNA Expression em idosos Pacientes UBC

Tendo em conta o papel fundamental da acumulação Tregs periférica em malignidades com idade, o CD4 + CD25 + CD127

baixa frequência Treg foi examinado no sangue periférico de pacientes UBC envelhecido, controles saudáveis ​​idosos e jovens controles saudáveis. De acordo com estudos anteriores, um aumento da frequência de Treg foi observada em ambos os pacientes com idades compreendidas entre UBC e controlos saudáveis ​​com idades, em comparação com controlos jovens saudáveis. Enquanto isso, a frequência Tregs foi significativamente mais elevada em pacientes com idades de UBC do que em controlos com idade (Figura 1). O aumento da frequência Tregs contribui para imunossupressão relacionada com a idade, aumenta a incidência de infecções e cancro, e faz com que a morbilidade e a mortalidade nas pessoas idosas [4] – [6]. Um estudo mostrou uma folga tumor com defeito dependente da idade, que foi correlacionado com elevação Tregs [16]. Importante, CD25-depleção levou a depuração de tumor, sugerindo que o limite de idade Tregs imunidade anti-tumoral [16].

frequência Treg foi detectado utilizando citometria de fluxo. Um aumento CD4 + CD25 + 127

baixa frequência Tregs (10,67 ± 0,58%) foi observada em idosos Pacientes UBC, em comparação com controles idosos saudáveis ​​(7,14 ± 0,41%) e controles de jovens saudáveis ​​(5,09 ± 0,37%). Expressos como a média ± DP, os dados foram analisados ​​com o teste t de Student paramétrico. ▴ vs. nova saudável Controls, P 0,05; △ vs. Controles saudáveis ​​com idade, P . 0,05

O fator de transcrição Foxp3 desempenha um papel vital na manutenção da auto-tolerância e alta expressão de Foxp3 é necessário para a função supressora na CD4 humana + Tregs [17] – [19]. Neste estudo, foi examinada a expressão de ARNm FoxP3 em ambos os pacientes com idades compreendidas entre UBC e indivíduos saudáveis. Como esperado, os níveis de ARNm de Foxp3 aumentada de forma significativa em células CD4 + CD25

oi Tregs classificados de pacientes com idades compreendidas entre UBC e controlos saudáveis ​​com idades, em comparação com controlos jovens saudáveis. No entanto, não houve diferença significativa na expressão de ARNm de Foxp3 entre Tregs de pacientes com idades compreendidas entre UBC e controlos saudáveis ​​com idades entre (Figura 2). A discrepância entre a frequência Tregs e a expressão de ARNm de Foxp3 podem ter sido causadas por diferenças funcionais, como os estudos anteriores que as células demostrated FoxP3 + T em seres humanos são funcionalmente heterogéneas [1]. Regulada positivamente a expressão de RNAm Foxp3, em conjunto com o aumento da frequência Tregs, pode aumentar tumores escapar, supressão imune e levar a liberação do tumor ineficaz em doentes com idade UBC.

Tregs foram classificadas por FACS, o nível de ARNm de Foxp3 foi detectada por real PCR quantitativo em tempo. expressão de mRNA FoxP3 foi aumentada em Tregs de ambos os pacientes UBC idade (2

– △△ CT = 0,0272 ± 0,0081) e envelhecido controles saudáveis ​​(0,0184 ± 0,0059) em comparação com controles jovens saudáveis ​​(0,0097 ± 0,0039) (p = 0,035 , 0,021, respectivamente). Não foi detectada diferença na expressão Tregs FoxP3 mRNA entre idosos Pacientes UBC e controles saudáveis ​​com idade. Expressos como a média ± SD, a data foram analisados ​​com o Mann-Whitney

U

-teste. ▴ vs. Tregs classificados do Controls jovens saudáveis, P . 0,05

regulada

SENEX

Expressão mRNA e Gene Expression subregulado de

P53

,

P16

,

P21 Comprar e

Caspase-3

em CD4 + CD25

oi Tregs de idosos pacientes UBC

para avaliar a contribuição potencial de acumulação Tregs periférica,

SENEX

expressão de mRNA de CD4 + CD25

oi células CD4 + CD25 efetoras T (Teff) Tregs e foi examinado. Aumento significativo na

SENEX

expressão de ARNm foi detectada em células CD4 + CD25

oi Tregs em comparação com CD4 + CD25- Teffs em pacientes com idades de UBC, e este aumento não foi observado em outros grupos. Enquanto isso,

SENEX

expressão de mRNA de Tregs em pacientes com idades entre UBC foi signicantly maior do que aqueles em controles saudáveis ​​idosos e jovens (Figura 3). Além disso, os níveis de mRNA de caspase-3 gene regulador apoptose, P53, P16 e P21 (2

– △△ CT = 1183,42 ± 321,17, 15,66 ± 4,83, 23,06 ± 4,59 e 2415,85 ± 863,72, respectivamente) foram significativamente diminuída em CD4 + CD25

oi Tregs classificados de pacientes com idades de UBC, em comparação com células T CD4 + CD25 Teffs (Figura 4). Não houve diferença significativa da expressão do gene regulador apoptose foram detectados em CD4 + CD25

oi Tregs classificadas de controles saudáveis ​​idosos e jovens, em comparação com Teffs.

Tregs foram classificadas por FACS,

SENEX

nível de ARNm foi detectada por PCR em tempo real quantitativa. Um aumento significativo em

SENEX

expressão de ARNm foi detectada em células CD4 + CD25

oi Tregs (2

– △△ CT = 0,8532 ± 0,1078) em comparação com células T CD4 + CD25 Teffs (0,1564 ± 0,0731 ) em pacientes UBC idade (

p

= 0,027), e este aumento não foi observado em outros grupos. Tregs

SENEX

expressão de mRNA em pacientes UBC idade estava signicantly superior aos dos controles idosos saudáveis ​​(0,0923 ± 0,0519) e controles jovens saudáveis ​​(0,1455 ± 0,0792) (p 0,05 para cada Mann-Whitney

U

-teste). Os dados foram expressos como a média ± DP. ▴ vs. Teffs classificadas de pacientes UBC envelhecidos, P 0,05; △ vs. Tregs nos controles idosos saudáveis ​​e Controles jovens saudáveis, P . 0,05

Tregs foram classificadas por FACS, os níveis de mRNA foram detectados por PCR em tempo real quantitativo. Em Aged Patiens UBC, genes reguladores de apoptose caspase-3, P53, P16 e P21 expressão de mRNA (2

– △△ CT = 1183,42 ± 321,17, 15,66 ± 4,83, 23,06 ± 4,59 e 2415,85 ± 863,72, respectivamente) diminuiu em Tregs pacientes UBC de idade (

p Art 0,05 para cada Mann-Whitney U Test). Os dados foram expressos como a média ± DP. ▴ vs. Teffs classificadas de pacientes com idade UBC, P . 0,05

gene SENEX

foi provado para fornecer uma função de gatekeeper único nos SIPS e vias de apoptose em células endoteliais [12 ]. A sobre-expressão de

gene SENEX

poderia causar ECs senescência, e estes

SENEX

induzida por células senescentes foram resistentes ao factor de necrose tumoral (TNF-α) apoptose induzida quando ECs foram expostas a concentrações de subcytotoxic H

2O

2. Além disso,

SENEX

sobre-expressão induzida por um aumento tanto do ARNm e os níveis de proteína p16 e houve uma diminuição na expressão da proteína do Rb hiperfosforilada. Estes resultados indicaram que

SENEX

ativado o p16 /pRb caminho [12]. Embora o papel crítico da

gene SENEX

em proteger ECs contra a apoptose celular tem sido bem demonstrado, a expressão de

gene SENEX

em Tregs permanece em grande parte desconhecido. No presente estudo,

SENEX

expressão de mRNA do gene foi encontrado para ser significativamente regulada em periférico CD4 + CD25

oi Tregs classificadas de pacientes UBC idosos, em comparação com Teffs. O up-regulada

gene SENEX

pode desempenhar um papel semelhante de induzir Tregs senescenc e protegê-las da apoptose celular. Estudos anteriores demonstraram que a paragem do crescimento senescente é estabelecida e mantida pela p53 /p21 e /ou p16 /pRB vias supressores de tumor [20] – [22]. Sabe-se que a proteína p53 do tipo selvagem pode induzir a apoptose das células [23]. Caspase 3 é uma protease de cisteína efectoras a jusante na via de apoptose, e é considerado como um dos principais executores da apoptose [24]. do gene p16 e do gene P21 pode inibir cinases dependentes de ciclina (CDK) e induzem a paragem do ciclo celular na fase G0-G1 [25] – [26]. Nós fundamentado que ciclo celular moléculas regulatórias, incluindo p53, p21 e p16 podem estar envolvidos na acumulação Tregs em pacientes UBC idosos. Nossos resultados indicam que a expressão do gene regulador apoptose

P53

,

P16

,

P21 Comprar e

Caspase-3

, o que poderia promover a apoptose celular, previamente descrito [23] – [26], regulados negativamente em Tregs de UBC pacientes envelhecidos. O up-regulada

SENEX

gene juntamente com gene pró-apoptótica down-regulamentado pode levar à diminuição da apoptose em Tregs, e acumulação Tregs no desenvolvimento e progressão do câncer de bexiga urinária idade.

Aumento Os níveis de TGF-β1, IL-10, IL-17 e TNF-α Concentração sérica e diminuição dos níveis de IL-2 Concentração Serum em idosos UBC pacientes

para uma avaliação indireta para a função das células T, avaliamos soro perfis de citoquinas relacionadas com imunopatologia tumor. Em comparação com controlos saudáveis ​​e jovens com idade controlos saudáveis ​​(

P

0,05 para cada teste t), houve um aumento óbvio na concentração de IL-10 (13,03 ± 2,16 pg /ml), IL-17 ( 18,29 ± 3,45 pg /ml), TGF-β1 (16,22 ± 3,35 ng /ml) e TNF-α (25,18 ± 5,74 pg /ml) no soro de pacientes com idades compreendidas entre UBC. Enquanto isso, houve uma diminuição da IL-2 concentração sérica tanto em pacientes com idades entre UBC (165,29 ± 26,45 pg /ml) e controles saudáveis ​​idosos (196,69 ± 32,38 pg /ml), como, em comparação com controles jovens saudáveis ​​(409,24 ± 90,81) . No entanto, foi observada nenhuma diferença estatisticamente significativa na concentração sérica de IL-2 entre os pacientes com idades entre UBC e controles saudáveis ​​com idades entre (p = 0,243) (Figura 5).

expressos como a média ± SD, os dados foram analisados ​​com o teste t de Student paramétrico. ▴ vs. controles saudáveis ​​com idades e Controles jovens saudáveis, P 0,05; △ vs. Controles saudáveis ​​jovens, p .

Como a principal fonte de TGF-β1 e IL-10 na manutenção da auto-tolerância e homeostase de células T, células T reguladoras inibem as células T efetoras 0,05 primariamente através da produção de citocinas, tais como TGF-β1 e IL-10 [27]. Este estudo mostra que as concentrações séricas dos dois TGF-β1 e IL-10 aumentou significativamente em pacientes com idades compreendidas entre UBC. Os níveis elevados de TGF-β1 e IL-10 sugerem que o Tregs acumulada em pacientes com idades compreendidas entre UBC podem possuir elevada capacidade supressiva, inibir as respostas imunitárias antitumorais e promover a fuga imunitária do tumor. TNF-α é a citocina pró-inflamatória prototípico. Embora mostrado originalmente para ser tóxico para as células de tumor em doses elevadas, o TNF-α tem mostrado ter a função de indutor de tumores [28]. Da mesma forma, citocina IL-17, secretado por células Th17, é geralmente preferível na geração de imunidade anti-tumoral de células T, mas estes efeitos são eclipsada pelos seus papéis no crescimento de tumores [29]. No presente estudo, os níveis elevados de TNF-α e IL-17 em pacientes com idades compreendidas entre UBC pode promover a tumorigénese, como estudos anteriores tinham mostrado que podiam promover a angiogénese tumoral.

A interleucina-2 é produzida principalmente por linfócitos T CD4 + T células auxiliares e células T CD8 + em órgãos linfóides secundários, e a produção de IL-2 é fortemente induzida a seguir a activação por antigénio [30]. Capaz de activar vários subconjuntos de células imunitárias, incluindo células T, interleucina-2 é essencial para o desenvolvimento, sobrevivência e função de células Treg [30] – [31]. declínio substancial em IL-2 com a idade tenha sido descrito, principalmente com base em ensaios ex vivo, em que a produção de células T de IL-2 parece ser deficiente [6]. IL-2 actua sobre as células que expressam quer o de elevada afinidade de IL-2R trimérico ou de baixa afinidade dimérico de IL-2R. Os níveis elevados da trimérico IL-2R são transitoriamente expressos por células T CD4 + e CD8 + T após a activação de células TCR whileTreg constitutivamente expressam altos níveis de IL-2R rimeric [30]. Em nosso estudo, observou-se um declínio evidente na concentração sérica de IL-2, tanto em pacientes com idades entre UBC e controles saudáveis ​​idosos. Concentrações baixas de IL-2 pode estimular preferencialmente a proliferação de células T reguladoras através do de alta afinidade a IL-2R trimérico, e contribuir para acumulação Tregs periférica na população idosa.

SENEX

foi Expressão correlacionada com P53, TGF-β1 e expressão de IL-2 em idosos pacientes UBC

Nós explorada a relação entre o gene senescência

SENEX

mRNA perfis de nível e de citocinas no soro ou mRNA do gene regulador apoptose expressão . Usando a análise de correlação de Pearson, os nossos dados indicam que

SENEX

expressão de ARNm foi negativamente correlacionado com a expressão de ARNm de p53 (p = 0,012) e a concentração de IL-2 (p = 0,026), enquanto que uma correlação positiva entre

SENEX

concentração expressão de mRNA e TGF-β1 (p = 0,001) foi descoberto em idosos pacientes UBC.

SENEX

expressão do gene foi negativamente correlacionada com

expressão P53

mRNA (Figura 6A), o que implica que

gene SENEX

pode proporcionar a sua função especial do pró-apoptótica de regulação para baixo gene

P53

expressão. Além disso,

SENEX

expressão do gene foi positivamente correlacionada com o nível de TGF-β1 (Figura 6B), sugerindo que a expressão regulada para cima de

gene SENEX

pode explicar a alta capacidade de supressão das Tregs acumulada em pacientes com idades compreendidas entre UBC. Finalmente,

gene SENEX

foi negativamente correlacionada com a IL-2 concentração sérica (Figura 6C). A proliferação de Tregs podem altamente suprimir as células auxiliares T CD4 + e CD8 +, e inibir a secreção de IL-2 em pacientes com idades entre UBC.

Usando o teste de coeficiente de Pearson,

SENEX

expressão era correlacionada negativamente com (a), a expressão de ARNm P53 (Pearson coeficiente de correlação = -0,405, p = 0,012) e (B), concentração de IL-2 (Pearson coeficiente de correlação = -0,362, p = 0,026) em pacientes envelhecidos UBC. (C) correlação positiva entre o

SENEX

expressão e concentração de TGF-β1 (coeficiente de correlação de Pearson = 0,507, p = 0,001) foi descoberto pelo teste de coeficiente de Pearson.

Silenciar para baixo

SENEX

expressão gênica Aumento Tregs apoptose em resposta a H

2O

stress 2-mediada In vitro

os dados acima sugeriu que a expressão do gene SENEX regulada foi negativamente correlacionada com

P53

mRNA expressão em células CD4 + CD25

altos Tregs, o que implicou que

gene SENEX

pode inibir Tregs apoptose celular por down-regulação da expressão de genes pró-apoptóticos. Para investigar se Tregs de pacientes UBC idade têm uma proporção menor de apoptose celular, CD4 + CD25

altos Tregs e CD4 + CD25- Teffs foram classificadas, seguido por análise de citometria de fluxo após ser corada com anexina V-FITC e PI. Anexina V se liga especificamente ao fosfatidilserina exposta à superfície de células apoptóticas, enquanto PI podem penetrar as células mortas e intercala com ácido nucleico [32]. Os dados relataram que Tregs de pacientes com idades compreendidas entre UBC tinham menos células apoptóticas (0,84 ± 0,34%) em comparação com Teffs (9,27 ± 3,66%) (Figura S1) Anexina V +. Isto é consistente com o estudo anterior [11], sugerindo que Tregs de pacientes com idade entre UBC são mais resistentes à apoptose.

Para aprofundar o estudo do papel potencial dos

gene SENEX

em Tregs apoptose em idade pacientes UBC, nós silenciados para baixo

SENEX

expressão de genes com RNA de interferência em Tregs cultivadas a curto prazo em resposta a H

2O

2 estresse oxidativo induzido. H

2O

2 é um conhecido indutor de estresse oxidativo quando entregue em uma dose subcytotoxic [33]. No presente estudo, escolhidas CD4 + CD25

elevados Tregs CD4 + e CD25- Teffs foram expostas a concentrações de subcytotoxic H

2O

2 (100 uM) durante 2 horas. Nossos resultados indicaram que 100 M H

2O

2 tratamento aumentou anexina V + células em apoptose em ambos os CD4 + CD25

altos Tregs (11,2 ± 2,6%) e CD4 + CD25 Teffs (13,1 ± 4,3%), e nenhuma diferença significativa foi observada em H

2O

2 induzida apoptose celular entre Tregs e Teffs. Silenciando baixo

SENEX

gene por SiRNA transfecção piscina por 24h, follwed por 100 M H

2O

2 tratamento durante 2 horas, o aumento da anexina V + células em apoptose em células CD4 + CD25

altos Tregs ( 21,5 ± 3,4%), mas a sofrer os mesmos procedimentos, células em apoptose anexina V + não foram encontradas para aumentar em células CD4 + CD25-Teffs (13,9 ± 3,1%) (Figura 7). Além disso, não foi observada nenhuma diferença significativa na apoptose celular em ambos Tregs e Teffs quando as células foram tratadas apenas com Transfection siRNA sem H

2O

2 tratamento (Figura 7). Além disso, silenciando as Tregs

SENEX

expressão do gene levou à regulação positiva de genes pró-apoptóticos

P53

,

P16

,

P21 Comprar e

Caspase -3

expressão de mRNA em resposta ao stress (Figura 8). A eficiência de transfecção foi de 45 ± 7,2%, o que foi confirmado por marcado com fluorescência FAM siRNA. Os

SENEX

taxa de inibição de expressão de mRNA foi mais de 90%, em comparação com não-codificante RNA (ncRNA) (Figura S2).

Ordenado CD4 + CD25

altos Tregs foram coradas com anexina V -FITC antes da análise por citometria de fluxo. apoptose celulares foram detectados como células apoptóticas Anexina V +. 100 M H

2O

2 tratamento durante 2 horas aumentou células em apoptose tanto em Tregs (11,2 ± 2,6%) e Teffs (13,1 ± 4,3%), sem diferença significativa observada em H

2O

2 induziu apoptose entre Tregs e Teffs. Silenciando baixo

gene SENEX

com interferência de RNA (RNAi) durante 24 horas, seguido da H

2O

2 tratamento durante 2 horas, aumentou células em apoptose em Tregs (21,5 ± 3,4%), mas passando a mesmos procedimentos, as células apoptóticas não foi encontrado para aumentar em Teffs (13,9 ± 3,1%). Nenhuma diferença foi observada na apoptose celular entre Tregs e Teffs quando as células foram tratadas apenas com SiRNA transfecção.

níveis de mRNA do gene foram detectados por PCR em tempo real quantitativo. Depois de

gene SENEX

foi silenciado para baixo durante 24 horas, seguido de H

2O

2 tratamento por 2 horas, os genes reguladores de apoptose

Caspase-3

,

P53

,

P1

6 e

expressão P21

mRNA (2

– △△ CT = 6705,73 ± 1124,07, 253,08 ± 16,01, 154,58 ± 35,12 e 5135,79 ± 985,47, respectivamente) upregulated em células CD4 + CD25

oi Tregs (

p Art 0,05 para cada Mann-Whitney U Test). Os dados são expressos como a média ± DP. ▴ vs. H

2O

2 tratados com células, P . 0,05

estudo anterior demonstrou que

gene SENEX

contribuiu para a resistência a apoptose de células endoteliais humanas [ ,,,0],12]. No presente estudo, silenciando-se

SENEX

expressão do gene aumentou Tregs apoptose em resposta a H

2O

2 estresse oxidativo induzido.