Abstract

Fundo

próstata dependem de andrógenos para a sobrevivência e função. Em (início) cancro da próstata (PCA) andrógenos também regulam o crescimento do tumor, que é explorado por terapias hormonais na doença metastática. O objetivo do presente estudo foi caracterizar a resposta do receptor de andrógeno (AR) em células PC346 resistente à terapia hormonal e identificar marcadores de doenças em potencial.

foram usadas Metodologia /principais conclusões

oligoarrays 19K Humano para estabelecer o perfil de expressão regulada por andrógenos de células PC346C responsivos aos andrógenos e seus derivados sublinhas resistente à terapêutica: PC346DCC (níveis de AR vestigiais), PC346Flu1 (superexpressão AR) e PC346Flu2 (mutação AR T877A). No total, 107 transcritos foram diferencialmente expressos em PC346C e derivados após R1881 ou estimulações hidroxiflutamida. Os perfis de expressão regulada-AR refletiram as modificações AR dos respectivos sublinhas resistente à terapêutica: AR superexpressão resultou em resposta mais forte e mais ampla da transcrição à estimulação R1881, AR infra-regulação correlacionada com a resposta deficiente de genes AR-alvo e a mutação T877A resultou em transcricional resposta para ambos R1881 e hidroxiflutamida. Esta assinatura AR-alvo foi ligada a linha celular acessível ao público múltiplo e derivada de tumor bancos de dados APC, revelando que os clusters funcionais distintos foram diferencialmente modulados durante a progressão CaP. Diferenciação e secreção funções foram regulados positivamente em CaP primário, mas reprimido na metástase, enquanto a proliferação, a remodelação do citoesqueleto e adesão foram sobre-expressos em metástase. Finalmente, os genes regulados por andrógenos ENDOD1, MCCC2 ACSL3 e foram seleccionadas como potenciais marcadores para a quantificação de doença de RT-PCR em um conjunto distinto de espécimes da próstata humana. ENDOD1 e ACSL3 mostrou sub-regulação de alta qualidade e metastático APC, enquanto MCCC2 foi sobre-expresso em baixo grau CaP.

Conclusões /Significado

modificações AR alteraram a resposta transcricional a (anti) andrógenos em células resistente à terapia. Além disso, a regulação negativa selectiva de genes envolvidos na diferenciação e a regulação positiva de genes que promovem a proliferação e invasão sugerem um equilíbrio perturbado entre as funções de crescimento e de diferenciação da via AR durante a progressão CaP. Esses achados podem ter implicações no tratamento e desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para CaP metastático atual

Citation:. Marques RB, Dits NF, Erkens-Schulze S, van IJcken WFJ, van Weerden WM, Jenster G (2011 ) Modulação do receptor andrógeno Sinalização na Terapia hormonal-resistentes linhas celulares de cancro da próstata. PLoS ONE 6 (8): e23144. doi: 10.1371 /journal.pone.0023144

editor: Laszlo Tora, do Instituto de Genética e Biologia Molecular e Celular, França |

Recebido: 08 de dezembro de 2010; Aceito: 13 de julho de 2011; Publicação: 04 de agosto de 2011

Direitos de autor: © 2011 Marques et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O trabalho apresentada neste manuscrito foi apoiado financeiramente pela Organização holandesa para Pesquisa Científica (NWO), por meio ZonMW concessão 903-46-187, e pelo Cancer Society Holandês (KWF), por meio de doações NKB97-1479 e DDHK 2001-2455. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata é o mais frequentemente diagnosticado malignidade não-cutâneo em homens ea segunda principal causa de mortes por câncer nos países ocidentais [1]. O cancro da próstata é uma doença altamente heterogénea, que apresenta um espectro amplo de manifestações clínicas e biológicas. Enquanto alguns pacientes desenvolvem um curso de doença assintomática e preferia morrer com o câncer do que do câncer, outros apresentam uma doença mais agressiva e /ou mais avançado no momento do diagnóstico [2]. Quando o tumor está confinado à próstata, pode ser eficazmente tratado por cirurgia radical e /ou a terapia de radiação, mas uma vez que o tumor se disseminada, a terapia sistémica é necessária. Dado que as células de cancro da próstata requerem andrógenos para a sua sobrevivência e crescimento, o padrão de ouro para o tratamento de tumores da próstata é evasivas andrógeno ablação química ou através de castração cirúrgica, que pode ser combinada com a administração de receptor de androgénio (AR) antagonistas de [2]. A maioria dos pacientes irão beneficiar desta terapia hormonal, os tumores podem encolher e os sintomas melhoram. No entanto, eventualmente, todos os cancros irá tornar-se resistente e repetem como terapia de refractário ou resistente à castração doença, para o qual, no momento não existe tratamento curativo [3], [4]. A via de AR é muito versátil, estar envolvido em muitos processos biológicos, incluindo a proliferação celular, apoptose e regulação da diferenciação de [5]. O equilíbrio entre estas diferentes funções dita a homeostase da glândula prostática. A questão pertinente é como as células de câncer de próstata que são inicialmente dependentes de andrógenos pode retomar o crescimento em um ambiente privado de andrógeno. Uma possibilidade é que as células cancerosas da próstata conseguir isso, adaptando seu caminho AR aos baixos níveis de andrógenos /alta Antiandrogen, por exemplo, por mutação, amplificação ou truncagem a uma AR constitutivamente activa, a desregulamentação dos cofatores AR e /ou produção de andrógenos intratumoral [6] [7]. Por outro lado, as células cancerosas podem ativar vias de crescimento alternativos, ao encerrar supressores de tumor e sinais apoptóticos [6], [7].

No presente estudo, focado no papel da via AR em a progressão do câncer de próstata. O padrão de genes regulados de androgénios em linhas celulares responsivos aos andrógenos e resistente à castração expressão foi estabelecido, com o objectivo de: (i) determinar se a via de AR é ainda funcionalmente activa nas células PC346 resistente à terapia hormonal; (Ii) identificar o mecanismo (s) através da qual a via de AR podem ser ajustados para os níveis baixos de androgénio /alta Antiandrogen; (Iii) identificar genes regulados por andrógenos que poderia, potencialmente, ser utilizados no diagnóstico /prognóstico de cancro da próstata, ou como um alvo terapêutico. Para este fim, utilizou-se a tecnologia de microarray para caracterizar a programa de transcrição activado por o androgénio sintético R1881 e a hidroxiflutamida antiandrogénio. Como sistema modelo foram utilizadas as linhas celulares PC346 (Tabela 1): a linha de células parental PC346C andrógeno responsivo e suas sublinhas de derivativos resistente à terapêutica PC346DCC, PC346Flu1 e PC346Flu2 [8]. Estes sublinhas resistente à castração reproduzir modificações AR comuns observados na doença resistente à terapêutica:. AR down-regulação (PC346DCC), mutação AR (PC346Flu2) e AR superexpressão (PC346Flu1), tornando-se um modelo único e valioso para este estudo

Métodos

Declaração de Ética

amostras normais e tumorais de pacientes foram obtidos a partir do banco de tecidos congelados do Centro Médico Erasmus (Roterdão, Países Baixos). Os espécimes foram coletados entre 1984 e 2001. Os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética Médica do Erasmus MC de acordo com a pesquisa clínica envolvendo seres humanos Act.

Reagentes e linhas celulares

A cultura básica meio utilizado para a manutenção de linhas de células de PC346 consistiu em meio DMEM-F12 (Cambrex BioWhitaker, Bélgica) suplementado com 2% de soro fetal de vitelo (FCS; PAN Biotech GmbH, Aidenbach, Alemanha), 1% de insulina-transferrina-selênio (Gibco BRL ), 0,01% de albumina sérica bovina (Boehringer Mannheim, Alemanha), factor de 10 ng /mL de crescimento epidérmico (Sigma-Aldrich), antibióticos de penicilina /estreptomicina (100 U /ml de penicilina, 100 mg /mL de estreptomicina; BioWhitaker, Bélgica); mais os seguintes acréscimos: 100 ng /ml de fibronectina (Porto Bio-Products, Tebu-bio, Países Baixos), 20 mg /ml fetuine (ICN Biomedicals, Holanda), 50 ng /ml choleratoxin, fosfoetanolamina 0,1 mM, 0,6 ng /triiodotironina ml e 500 ng /ml de dexametasona (todos de Sigma). PC346C células foram mantidas em cultura em meio completo mencionada acima, suplementado com 0,1 nM de 17-metiltrienolona (R1881; NEN, Boston, MA, EUA). meio de selecção PC346DCC foi completado tal como descrito acima, mas a partir de androgénios empobrecido usando carvão vegetal revestido com dextrano (DCC) tratada FCS. meio de cultura e PC346Flu1 PC346Flu2 também foi androgénio esgotados usando 2% de DCC-FCS, e suplementado com 1 fiM de hidroxiflutamida (OH-flutamida, Research Institute Schering-Plough, New Jersey, EUA). Para os estímulos hormonais, foi utilizada uma versão simplificada do meio de cultura, contendo 2% de FCS DCC- sem as adições acima mencionadas (meio mínimo). As células foram cultivadas em frascos T25 Primaria ™ de cultura de tecidos (BD Biosciences Benelux NV, Holanda) a 37 ° C sob 5% de CO

2 atmosfera humidificada.

estímulos hormonais e análise de expressão de microarray

As células foram semeadas no seu respectivo meio de selecção para alcançar ~ 50% de confluência e deixado a ligar durante a noite. No dia seguinte, o meio foi substituído com 2% de DCC-FCS em meio mínimo e as células foram privadas durante 48 h, para trazer a actividade de AR para níveis basais antes dos estímulos hormonais. Subsequentemente, as células foram estimuladas com quer veículo, 1 nM R1881 ou 1 uM OH-flutamida durante 4, 8 ou 16 h. Após estimulação, as células foram lavadas duas vezes com PBS e armazenadas a -20 ° C até o isolamento de ARN. O ARN total foi isolado com o reagente RNAzol B (Campro Scientific, Veenendaal, Holanda) e adicionalmente purificado por meio de colunas RNeasy (Qiagen) com digestão de ADN em coluna, de acordo com o protocolo do fabricante. qualidade de ARN foi verificada em gel de agarose a 1%.

Cy3- ou sondas de ARN marcado com Cy5 foram produzidos por incorporação UTP amino-alil durante a amplificação de RNA, seguido de acoplamento a N-hidroxisuccinimida corante modificado. Em resumo, 3 ug de ARN foi utilizado para um protocolo de amplificação linear à base de ARNm de T7, descrito anteriormente [9]. UTP amino-alilo, além de uma quantidade igual de rUTP não modificada, foi incorporada com o Kit T7 ARNA MEGAscript (todos da Ambion), de acordo com o protocolo do fabricante. RNA amplificado foi purificado e concentrado utilizando Microcon-YM 30 colunas (Amicon®) para lavar três vezes com 300 mL de água livre de RNAse. Finalmente, 2 ug de ARN, em um máximo de 3,33 mL de água livre de RNase modificado por aminoallyl, foi incubado com 1,66 ul de tampão de bicarbonato de sódio (0,3 M, pH 9) e 5 ul Cy3- ou Cy5-dye (CyScribe Post-Labeling kit, Amersham, NJ, EUA), durante 1 h no escuro a temperatura ambiente. A reacção foi parada com 5 ul de hidroxilamina 4 M de HCl (Sigma), as sondas contra-marcadas foram combinadas e purificadas /concentradas utilizando Microcon YM-30 colunas. Probe foi coletado em 5-15 volume final ul e ressuspensas em 80 ul hibridação Ambion número tampão 1.

Para o microarray usamos oligoarrays double-dye que representam cerca de 15.000 genes humanos, em que rotulados RNA estimulada pela hormona foi cohybridized com o seu veículo de controlo contra-rotulados combinando-tempo (etanol). Dois microarrays foram realizadas por condição: em um experimento as amostras estimuladas foram marcados com Cy3 ea referência não estimulada com Cy5, em outro experimento no vice-versa (dye-swap); isto foi feito para excluir corante preferencial de ligação a oligonucleótidos sobre o micro-arranjo. Além disso, duas passagens celulares independentes foram utilizados para cada uma destas experiências, para ter em conta a variabilidade biológica.

Os oligoarrays utilizados neste estudo foram produzidas no Centro Erasmus para Biomics. Resumidamente, um humano 18,584 oligonucleotídeos biblioteca (Compugen, Sigma-Genosys) foi descoberto em lâminas aminossilano usando um arrayer Virtek Chipwriter Professional (Virtek Vision International, Waterloo, Canadá). pontos de controle incluídos marcos, tampão manchas, oligonucleotídeos alienígenas (SpotReport Oligo estrangeiro matriz, La Jolla, Stratagene), poli d [A] 40-60, ADN de esperma de salmão, e de DNA COT-1 humano. Antes da hibridação, as lâminas de microarray foram pré-hibridados em SSC 5x, SDS a 0,05%, solução de BSA a 4% durante 30 min a 45 ° C, lavou-se duas vezes com água livre de RNase durante 2 min, lavou-se com isopropanol e spin-seco durante 3 min a 1500 g. As hibridações foram realizadas durante a noite Microarray a 45 ° C, com agitação contínua, numa estação de hibridação HS4800 (Tecan Benelux BV). Finalmente, as matrizes foram lavadas automaticamente na Estação A hibridação utilizando: 2 x SSC /SDS a 0,05% (a 45 ° C), 1x SSC e 0,2x SSC (à temperatura ambiente), e secou-se sob uma corrente de N

2, antes da digitalização.

extração de dados e análise

Arrays foram digitalizados em um scanner HT ScanArray Express (Perkin Elmer, Nederland BV) e intensidades exatas foram quantificados utilizando Imagene software (Bio Descoberta Inc, El Sequndo , CA, EUA). Para equilibrar Cy3 e Cy5 intensidades local, Loewess normalização per subarray foi realizada utilizando limma-package (https://bioinf.wehi.edu.au/limma/) a partir Bioconductor (https://www.bioconductor.org) [10] , [11]. Para dimensionar entre matrizes, a intensidade média mundial por matriz foi estabelecido em 1000. intensidades Dye abaixo de 200 foram então thresholded em 200, para minimizar o ruído e fazer fold-change na faixa de baixa intensidade mais firme contra valores extremos. Spots com intensidades abaixo do limiar (200) para os canais Cy3 e Cy5 ambos, em mais do que 50% ( 3/6) das matrizes para cada tempo-curso, foram excluídos da análise. Exemplo para os rácios de controlo de veículo foram então calculados e 2log transformado. Pontos que mostraram efeitos opostos para o corante de troca /réplicas biológicas foram excluídos da análise posterior; efeitos foram chamados oposto, se a relação 2log média para os três pontos temporais testados foram ≥0,5 para um corante e abaixo ≤-0,5 para o dye-swap. Após normalização e todos os controlos de qualidade acima mencionados, as razões de intensidade 2log de ambas as repetições-se a média para cada ponto de tempo. Estes dados foram armazenados em SRS7 (Sequence Retrieval System versão 7, Lion Bioscience AG, Heidenberg, Alemanha) [12], que também foi utilizado para as comparações com outros bancos de dados anteriormente publicados /disponíveis publicamente [13], [14], [15 ], [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22], [23], [24].

agrupamento hierárquico e visualização de dados foi realizadas utilizando programas de cluster e TreeView (Eisen Labs: https://rana.lbl.gov), respectivamente. Análise de significância de Microarrays (SAM; https://www-stat.stanford.edu/~tibs/SAM) foi utilizado para determinar quais os genes foram estatisticamente diferentes entre as amostras estimuladas e não estimuladas referências. agrupamento Gene ontologia foi realizada utilizando banco de dados para anotação, visualização e descoberta integrada (DAVID: https://david.abcc.ncifcrf.gov) [25], [26]. As análises da via e funcionais foram gerados através do uso de Ingenuity Pathways Analysis (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com).

Todos os dados microarray é MIAMI compatível e foi depositado na Gene Expression Omnibus repositório ( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), sob o número de acesso GEO GSE22914.

a síntese de cDNA e análise por RT-PCR

o RNA total foi isolado como descrito acima e o ADNc foi sintetizado utilizando o kit da transcriptase reversa de MMLV-e oligo (dT)

12-18 iniciador (Invitrogen), de acordo com o protocolo do fabricante. amostras de cDNA foram armazenadas a -20 ° C. Para a validação dos resultados de microarray, análise quantitativa por PCR em tempo real foi realizado utilizando um 7700 Sequence Detection System ABI Prism (Applied Biosystems, Foster City, CA). KLK2, PART1, TPD52, FKBP5, GPR88, STEAP1, TRIB1 e ID3 foram quantificados com absoluta QPCR SYBR Mix Verde ROX (Thermo Scientific) e 330 nM de cada iniciador, de acordo com o protocolo do fabricante. Os iniciadores foram concebidos utilizando o programa de computador Oligo Análise Primer Software versão 6.22 (Biologia Molecular Insights Inc, EUA). especificidade Gene foi verificada por BLAST e, sempre que possível, primers,-medindo intron foram escolhidos para evitar a amplificação de ADN contaminante. As sequências dos iniciadores são descritas na Tabela 2. TMPRSS2, PSA e GAPDH foram quantificadas por análise de PCR TaqMan em tempo real, utilizando absoluta ROX Mix QPCR (Thermo Scientific). TMPRSS2 (ensaio ID Hs00237175_m1) e GAPDH (ensaio ID Hs99999905_m1) kits foram adquiridos da Applied Biosystems e execução seguindo as instruções do fabricante. PSA foi quantificada tal como descrito anteriormente [8]. Para cada gene, uma curva padrão foi construída a partir de diluições em série de um pool de RNA transcrito PC346-reversa, a qual foi então usada para determinar a quantidade de mensagem de destino a partir do ciclo limiar (Ct). O gene GAPDH de limpeza foi usado como controle endógeno.

Para a análise quantitativa por PCR do painel de tecidos humanos, amostras normais e de tumores de doentes foram obtidos do banco de tecidos congelados de Erasmus Medical Center (Roterdão , a Holanda). Informações adicionais sobre esses espécimes foi fornecida anteriormente [27]. a análise por PCR em tempo real TaqMan foi realizada num Prism 7700 Sistema de Detecção de Sequência ABI (Applied Biosystems, Foster City, CA), utilizando polimerase de ADN AmpliTaq Gold (Applied Biosystems), de acordo com as especificações do fabricante. primers validados e sondas de Gene TaqMan Ensaios de Expressão (Applied Biosystems) foram utilizados para quantificação de ACSL3 (Hs01071247_m1), MCCC2 (Hs00223257_m1), ENDOD1 (Hs00826684_m1) e GAPDH (Hs99999905_m1), de acordo com as configurações de PCR fornecidos pela Applied Biosystems. PBGD foi quantificada utilizando 330 nm de primers para a frente: 5′-CAT GTC TGG TAA CGG CAA TG-3 ‘e reverso: 5′-GTA CGA GGC TTT CAA TGT TG-3’ primers, no Poder SybrGreen PCR Master Mix (Applied Biosystems ), de acordo com o protocolo de ciclos térmicos recomendado pelo fabricante. quantidades de transcritos para cada amostra foram normalizados contra a média de duas referências endógenos e em relação a um calibrador. Os dois genes de manutenção utilizados como referências endógenos foram PBGD e GAPDH; uma mistura de cDNAs a partir de xenoenxertos de carcinoma da próstata foi usado como o calibrador. Gráficos e estatísticas foram realizadas com GraphPad Prism (versão 3.0). P-valores. 0,05 foram considerados significativos

Resultados

padrão de células PC346 tratados com R1881 e hidroxiflutamida

expressão gênica

Para caracterizar o perfil dos genes alvo do receptor andrógeno expressão em células de câncer de próstata, foi utilizada análise de microarray de expressão no painel de linha celular PC346 incubadas com o análogo de androgénio R1881 ou o anti-andrógeno OH-flutamida. O sistema modelo PC346 é composto por quatro linhas celulares: a PC346C sensível ao androgénio e três sublinhas resistente à terapêutica hormonal, derivado do PC346C parental por longo prazo ablação de androgénios (PC346DCC), suplementado com o antiandrogénio OH-flutamida (PC346Flu1 e PC346Flu2 ). Todos estes sublinhas exibem propriedades diferentes no que diz respeito ao estado e capacidade de resposta AR (resumidas na Tabela 1) [8].

Para a análise de expressão que estimularam as células com 1 nM R1881 ou 1 uM OH-flutamida para 4, 8 ou 16 h e cohybridized o ARN marcado com o seu veículo de controlo com o tempo (de etanol). Dois microarrays foram realizadas por condição, utilizando duas passagens celulares independentes em corante de troca, para ter em conta a variabilidade biológica e possíveis efeitos de corantes preferencial. Os primeiros pontos de tempo foram escolhidos de forma a enriquecer para alvos primários AR, e minimizar os objectivos secundários indirectos.

As duas réplicas por ponto de tempo se a média e um total de 107 transcritos diferencialmente expressas foram seleccionados para constituir o AR via assinatura: 74-regulada e 33 sub-regulada por R1881 e /ou OH-flutamida (Tabelas 3, 4, 5, 6). As manchas foram consideradas diferencialmente expressas-se a razão absoluta 2log ≥0.5 (razão ≥1.42 ou ≤0.71) para todos os três pontos de tempo, para, pelo menos, um tipo de célula. Análise de significância de Microarrays (SAM) foi utilizado para determinar quais os genes foram estatisticamente diferentes entre as amostras estimuladas e não estimuladas referências. No projeto experimental, optamos por realizar os estímulos hormonais em 3 momentos diferentes para que as transcrições com uma resposta mais rápida ou mais lenta não seria desperdiçada. No entanto, o efeito do tempo foi insignificante: a maioria das transcrições regulada por andrógenos foram diferencialmente expressos em todos os horários três pontos de tempo e para a análise estatística decidimos reunir todos os 3 pontos de tempo por condição. No total, havia 253 SAM genes significativos, com uma taxa de descoberta de falsas (FDR), fixado em 0,05 (Tabelas S1, S2, S3, S4). De nossos 107 transcrições de assinatura, considerados diferencialmente expressos de acordo com os critérios de selecção acima referidos, 77 foram estatisticamente significativas por SAM. De facto, a expressão das restantes 30 (28%) de transcritos a assinatura AR-alvo variou entre os 3 pontos de tempo, de modo que estes não atingiu significância estatística na análise SAM reunidas. Esta variação não pode ser explicada por um padrão cinético aparentemente predominantes, nem pode ser atribuído ao ponto de tempo de 4 h, em particular. Desde regulação temporal foi observado para alguns desses transcritos, nenhuma análise foi realizada sobre a dinâmica da variação do gene-expressão ao longo do tempo. Os rácios de expressão apresentados nas tabelas e na Figura 4 estão a partir da média de todos os três pontos de tempo por quadro. Finalmente, o fato de que um número considerável de SAM transcrições significativas não foram incluídos na nossa assinatura regulamentada-AR foi devido a nossa escolha para definir o limite de rácio 2log em 0.5.

O sublinha PC346C sensível ao andrógeno responderam à estimulação R1881 com um aumento da expressão de genes 18, enquanto que 2 foram regulados negativamente. Entre estes são algumas AR regulada genes bem conhecidos, tais como KLK2, STEAP1, TMPRSS2 e FKBP5. As sublinhas resistente à terapia apresentaram respostas distintas para R1881 e OH-flutamida. PC346Flu1, que expressa 4 vezes os níveis mais elevados de AR do que a linha celular parental, mostrou um “super-activação” da via de AR por R1881, não só na magnitude da expressão do gene, mas também no número de genes regulados (20 androgénio genes -regulated na PC346C parental contra 91 em PC346Flu1). Por outro lado, o sub-linha PC346DCC, que expressa níveis residuais de proteína AR, não mostraram alterações detectáveis ​​na expressão de genes após os tratamentos hormonais. Nem PC346C, PC346DCC nem PC346Flu1 mostraram alterações significativas no perfil de transcrição em resposta a OH-flutamida. Em contraste, as células PC346Flu2, que expressam o T877A mutado AR, respondeu a ambos R1881 e este anti-androgénico, embora a resposta para o último foi mais fraca (14 genes sobre-regulada por R1881 versus 8-regulada por OH-flutamida; Tabelas 3 e 5, respectivamente)

Validação do

dados microarray

os dados microarray foi validado por duas abordagens:. uma abordagem experimental utilizando RT-PCR quantitativo, e uma abordagem bioinformática ligando nossa assinatura gene a um conjunto de bases de dados publicamente disponíveis sobre a resposta andrógeno. Foram selecionados 10 genes regulados por andrógenos a ser ainda mais validada por RT-PCR quantitativo: PSA, KLK2, PART1, TPD52, GPR88, FKBP5, TMPRSS2, STEAP1, ID3 e TRIB1. Vale a pena notar que a nossa análise de microarray não detectar a regulação da expressão de PSA em resposta aos tratamentos hormonais, mas uma vez que este é um gene alvo AR proeminente, que foi incluído no passo de validação de RT-PCR. A análise quantitativa por PCR confirmou a expressão diferencial de todos os genes seleccionados na mesma direcção previsto pela análise de microarray (Fig. 1). Além disso, a RT-PCR mostrou também um efeito mais forte da hormona-tratamento sobre a linha de células PC346Flu1, em contraste com a indução de células quase ausente PC346DCC, quando comparado com o PC346C parental, para a maioria dos genes analisados. Tal como observado no ensaio de micromatriz, PC346Flu2 mostraram respostas equivalentes para R1881 e OH-flutamida para muitos genes regulados (Fig. 1, Tabelas 3, 4, 5, 6).

A análise quantitativa por RT-PCR de um conjunto de 10 genes regulados de androgénios em linhas celulares PC346. As células foram estimuladas com 1 nM R1881 (R1881), 1 mM de OH-flutamida (Flut) ou controlo de veículo (DCC-FCS) durante 16 h. Os gráficos mostram a média (± SE) da expressão do gene normalizada (n.g.e.) em relação ao gene GAPDH de limpeza, durante duas passagens celulares independentes. ID3 e TRIB1 foram andrógeno-reprimida nos ensaios de microarray, enquanto os outros genes foram supra-regulados por andrógenos.

Nos últimos anos, uma série de estudos foram publicados que analisou a expressão do gene em resposta à estimulação androgénios em linhas celulares e xenoenxertos (Tabela 7). Dos 107 transcritos em nossa assinatura, 73 estavam presentes em pelo menos 3 dos 5 bases de dados e foram incluídos para análise posterior. Mais de 90% dos genes ligados sobrepostos com alvos regulada de androgénios anteriormente relatados. Genes com as induções mais fortes no nosso trabalho presente também mostraram consistentemente elevados induções em vários relatórios anteriores, sugerindo que os produtos destes genes podem desempenhar um papel fundamental na função biológica da próstata (Fig. 2). Usando nosso painel de linha celular único, fomos capazes de identificar novos genes responsivos aos andrógenos, tais como MAFB, KLF9, NFIB, STBD1, BIK e HLX.

No lado esquerdo, PC346C, PC346Flu1 e PC34Flu2 foram expostos a 1 nM R1881 ou 1? M OH-flutamida para 4, 8 e 16 horas, enquanto que PC346DCC foi estimulado com 1 nM única R1881. No lado direito, a nossa assinatura gene foi avaliada nas bases de dados de DePrimo

et al.

, Nelson

et al.

, Nickols

et al.

, Wang

et al.

e Hendriksen

et al.

(ver Tabela 7 para obter detalhes de banco de dados). Heat-mapa é apresentado para a relação entre a expressão 2log entre as amostras tratadas com hormonas e respectivos comandos do veículo acompanhado em tempo. cores vermelhas e verdes representam indução e repressão, respectivamente, enquanto preta indica nenhum regulamento. Quadrados cinzas indicam dados perdidos devido à baixa expressão, má qualidade dos dados ou ausência de sondas para a respectiva transcrição na plataforma de matriz utilizada para o estudo.

processos biológicos coordenado pela via AR

os genes assinatura regulada por andrógenos foram classificados de acordo com Gene Ontology (GO) Processos biológicos usando o banco de dados para anotação, visualização e descoberta integrada (DAVID: https://david.abcc.ncifcrf.gov) [25], [26].

de acordo com os papeis fisiológicos dos androgénios, esta abordagem revelou que os genes-alvo AR seleccionados no presente estudo operam na regulação da transcrição e vias de sinalização intracelular, o metabolismo de proteínas , lipídios e carboidratos, e a regulação da proliferação e diferenciação celular (Fig. 3A). A maior categoria inclui genes que codificam fatores de transcrição e reguladores de transcrição, tais como NFIB, KLF9, HIF1A, MAFB, EHF, NCOR1, NCOR2, PIAS1 e várias proteínas dedo de zinco (ZNF189, ZBTB10, ZBTB16 e CASZ1). Isto foi seguido por genes envolvidos na transdução de sinal intracelular, incluindo o G receptores acoplados à proteína via (GPR88, RGS2, GNAI1), pequenas GTPases da família Ras (RHOB, RHOU), activada por mitogénio proteína quinase cascata (MAP2K4, MKNK2, TRIB1) e outras cinases de proteína /fosfatases (PPM1A, PPP2CB, PIK3R3, SGK1). Outros genes responsivos a AR tem um efeito sobre a proliferação celular através da regulação do ciclo celular e processos apoptóticos (por exemplo RCC1, BBX, BIK, TP53INP1). Concomitante com o papel dos andrógenos sobre o desenvolvimento da próstata e maturação, outra das principais genes do cluster incluído envolvidos na diferenciação celular, como TPD52, TWSG1, NDRG1, ID1 e ID3. Finalmente, o androgénio induzida metabolismo das proteínas, hidratos de carbono e lípidos que contribuem para a produção e a secreção de fluido prostático. Tais genes alvo R1881 incluídos MTHFD1, PSPH, PSAT1 e MCCC2, que codifica as enzimas do metabolismo de ácidos metionina, serina e leucina, respectivamente. Além disso, a sobre-regulação do factor de iniciação da tradução EIF2C3 potencialmente promove a síntese de péptidos. Além disso, genes que participam no enovelamento de proteínas (PDIAS5, FKBP5), glicosilação (FUT8, GALNT1) eo tráfico (DMN1L, KDELR2) também foram reguladas por R1881. Além de proteínas e aminoácidos, fluido prostático é também rico em lípidos, poliaminas, sorbitol e vários iões metálicos. Com efeito, R1881 também estimulou a expressão de ACSL3 e ELOVL5, que participam no alongamento de ácidos gordos, espermina sintase (SMS), que faz parte da via de síntese poliamina, sorbitol desidrogenase (SORD), secretado pela próstata para o fluido seminal, e os canais de íon ACCN4 e KCNJ10.

(a) Pie-gráfico representando genes categorizados de acordo com a função biológica mais proeminente. anotações Gene ontologia foram extraídos utilizando DAVID [25], [26]. (B) O envolvimento dos genes da via AR na doença determinada usando Ingenuity Pathway Analysis (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com).

Para automatizar a classificação funcional, quantificar o grau de enriquecimento de cada agrupar e selecione categorias funcionais estatisticamente significativas que usamos a ferramenta de anotação funcional Clustering DAVID. Esta ferramenta identificados 6 Clusters de anotação estatisticamente significativos, que associados com o metabolismo de ácidos orgânicos (lipídios e aminoácidos), apoptose, diferenciação celular, processos de desenvolvimento, regulação da transcrição e regulação de processos celulares (Tabela 8).

o envolvimento de genes regulados por andrógenos em condições patológicas foi investigado usando o banco de dados Ingenuity (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com). As associações mais fortes foram encontrados para o câncer, o sistema reprodutivo, dermatológicas e doenças cardiovasculares (Fig. 3B).

A via AR no desenvolvimento do câncer de próstata e progressão

Para investigar como a via AR é modulada durante o desenvolvimento e progressão do cancro da próstata que ligada a assinatura do gene regulado de androgénios a sete bases de dados de microarray de cancro da próstata independente. Estes estudos incluíram amostras de “próstata normal” e tumores da próstata a partir de diversas fases da doença, cujas características principais estão resumidos na Tabela 7. Um total de 89 genes da hormona de resposta estavam presentes em, pelo menos, 4 dos 7 bases de dados, e foram seleccionados para posterior análise. Na figura 4, mostramos o agrupamento hierárquico dos genes R1881-responsivos (primeiro bloco de 4 colunas), ao lado de cancro primário contra próstata normal (segundo bloco), metástase contra o cancro primário (terceiro bloco), e finalmente recorrente contra não- recorrente e hormonal resistente à terapêutica versus doença hormônio-naïve (quarto bloco).