Sumário

Os microRNAs (miRNAs) foram demonstrados para participar em muitos processos celulares importantes incluindo radiossensibilização. família VEGF, um importante regulador da angiogénese, também desempenha um papel crucial na regulação da radiossensibilidade de células cancerígenas. VEGFR2 medeia as principais acções de crescimento e de permeabilidade de VEGF de um modo parácrino /autócrino. MiR-200c, no nexo de transição epitelial-mesenquimal (EMT), está previsto para atingir VEGFR2. O objetivo deste estudo é testar a hipótese de que a regulação do VEGFR2 caminho pelo miR-200c pode modular a radiossensibilidade das células cancerosas. análise bioinformática, ensaios de repórter de luciferase e os ensaios bioquímicos foram realizados para validar VEGFR2 como um alvo directo de miR-200c. Os efeitos radiossensibilizadora de miR-200c em células A549 foram determinadas por ensaios clonogénicos. O mecanismo de regulação a jusante do miR-200c foi explorada com ensaios de mancha ocidental, FCM, ensaios de formação do tubo e ensaios de migração. Identificamos VEGFR2 como um novo alvo de miR-200c. O ectópica miR-200c aumentou a radiossensibilidade do A549 enquanto miR-200c infra-regulação diminuiu ele. Além disso, provamos que miR-200c radiosensitized células A549, visando VEGF-VEGFR2 via especificamente, levando assim a inibição da sua transdução de sinalização pró-sobrevivência a jusante e angiogênese, e serve como um alvo potencial para a investigação radiosensitizition.

citação: Shi G, S Zhang, Wu H, Zhang L, Dai X, J, Hu, et al. (2013) miR-200c Aumenta a Radiosensibilidade de não-pequenas células do cancro do pulmão A549 Linha celular por Segmentação VEGF-VEGFR2 Caminho. PLoS ONE 8 (10): e78344. doi: 10.1371 /journal.pone.0078344

editor: Junming Yue, The University of Tennessee Health Science Center, Estados Unidos da América

Recebido: 03 de julho de 2013; Aceito: 11 de setembro de 2013; Publicação: 30 de outubro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Shi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo projecto Hubei Provincial Natural Science Foundation (Não: 2009CDA061). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

os pacientes sofriam de conta de cancro do pulmão de células não pequenas-(NSCLC) por aproximadamente 85% de todos os casos de câncer de pulmão [1], [2]. A radioterapia (RT) é uma modalidade eficaz amplamente utilizado na clínica contra as células cancerosas. No entanto, muitos deles apresentam radiorresistência intrínseca ou adquirida até à temperatura ambiente que conduz à falha [3] tratamento. Acumulando a evidência mostra que radiorresistência é não só pelas características intrínsecas, mas um resultado de interações entre células cancerosas e fatores do microambiente. O papel parácrino /autócrina do factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) através da ligação aos seus receptores é uma componente importante do microambiente do tumor e a sua auto-regulação. Supressão da expressão do gene de VEGF pode aumentar a radiossensibilidade das células cancerosas [4], [5]. E VEGFR2 é geralmente considerado para mediar a principal função atribuída ao VEGF. A radioterapia combinada com VEGFR2 e bloqueio EGFR causou um aumento significativo de efeitos anti-tumorais em um modelo ortotópico de câncer de pulmão [6]. inibição molecular de VEGFR2 poderia melhorar a resposta a radiação tumor por meio de segmentação molecular da vasculatura do tumor [7]. sinalização de modo parácrino de VEGF anfitrião a célula cancerosa VEGFR2 pode ser um componente significativo de falhas RT [8].

Os microRNAs (miRNAs) são um grupo de pequenos RNAs não-codificantes que suprimem a expressão de destino através da ligação ao 3 ‘não traduzida (3’UTR). Um estudo que identificou miARNs específicos do pulmão de rato por miARN microarray revelou que o miR-200c especificamente expresso em tecidos normais do pulmão de ratos [9]. E perda de expressão de miR-200c poderia induzir um fenótipo agressivo, invasivo e resistente à quimioterapia em cancro do pulmão de não-pequenas células [10]. Além disso, estudos independentes mostraram que o restabelecimento de miR-200c pode aumentar a sensibilidade aos agentes de quimioterapia em vários tumores [11], [12]. O mesmo acontece com miR-200c desempenhar um papel semelhante na radioterapia do cancro do pulmão de não-pequenas células

análise bioinformática mostraram que VEGFR2 foi um bom alvo previsto de miR-200c com dois sítios de ligação. Neste experimento, nós investigamos se VEGFR2 poderia ser regulada por miR-200c, levando a modulação da radiosentivitiy de células A549.

Resultados

VEGFR2 é um alvo direto de miR-200c

Bioinformatic análise revelou que VEGFR2 (receptor do factor de crescimento endotelial vascular 2) é um alvo previsto de miR-200c, que pode inibir directamente a expressão do gene (Fig. 1A). As células A549 foram transfectadas com imita o miR-200C (50 nM) ou inibidores de miR-200C (100 nm) para aumentar ou diminuir a expressão de miR-200c. controlos Imita (50 nM) ou controlos de inibidores (100 nM) foram transfectados em células A549 como controlos negativos, respectivamente. Em tempo real de PCR mostrou que imita o miR-200C e inibidores de miR-200C poderia aumentar significativamente ou diminuir a expressão de miR-200c de A549 (dados não mostrados). Para confirmar ainda se miR-200c poderia vincular diretamente a 3’UTR de VEGFR2, foi realizado ensaio de gene repórter luciferase dupla utilizando o plasmídeo pLuc-VEGFR2-3’UTR em células A549. transfecção transiente de células A549 com o plasmídeo pLuc-VEGFR2-3’UTR e imita o miR-200C levou a uma diminuição significativa da actividade de luciferase em comparação com os controlos (Fig. 1B). Para examinar se miR-200c poderia afetar a expressão da proteína VEGFR2 em células A549, realizou-se ensaios de parafuso ocidentais e descobriu que imita miR-200C reduziu a expressão da proteína de A549 significativamente em comparação com os controles (Fig. 1C).

(A) miR-200C resíduos no local de destino no 3′-UTR de VEGFR2 gene inspeccionados por bioinformática. (B) O constructo pLuc-VEGFR2-3’UTR contém uma sequência de tipo selvagem da 3’UTR de VEGFR2. A construção pLuc-VEGFR2-3’UTR foi co-transfectado com imita o miR-200C em células A549. A actividade de luciferase foi detectada 48 h após a transfecção. E a razão entre o valor da luciferase normalizada é mostrado. a expressão da proteína (C) VEGFR2 em células A549 foram medidos por Western blot 48 h pós-transfecção. Cada experimento foi repetido três vezes. erros padrão da média são mostradas por barras de erro. * Indica p . 0,05 em relação ao controle

Mimics miR-200C Aumentou o Radiosensibilidade de células A549 enquanto os inibidores de miR-200C Diminuição Se

Para estudar se o miR-200c afetados celular radiossensibilidade, células A549 foram transfectadas com imita o miR-200C ou inibidores. ensaios de sobrevivência da colônia, um padrão-ouro para a estimativa radiossensibilidade, foram avaliadas após 0-8 radiação Gy. A transfecção das células A549 com imita o miR-200C (50 nM) diminuiu significativamente a sobrevivência das células após a exposição à radiação (SER

0,5 1,47, Fig. 2A). Por outro lado, a transfecção de células A549 com inibidores de miR-200C (100 nm) causou um aumento significativo da sobrevivência de células após 0-8 Gy de radiação em comparação com os controlos (SER

0,5 0,79, Fig. 2B).

a sobre-expressão de miR-200c (a) aumentaram a radiossensibilidade de células A549 para o tratamento de IR, enquanto que a inibição de miR-200 ° C (B) mostrou o efeito oposto. O Si-VEGFR2 construir inibiram a expressão da proteína VEGFR2 48 h pós-transfecção (C) resultando na radiossensibilização de células A549 (D). Imita controlo, controlo e inibidores de ARNsi de controlo foram transfectados em células A549, respectivamente, como controlo negativo. Os ensaios de sobrevivência clonogénicas foram repetidas três vezes com resultados semelhantes. erros padrão da média são mostradas por barras de erro.

VEGFR2 knockdown foi feito por interferência de RNA utilizando o reagente lipo2000 transfecção. ensaio de sobrevivência das colónias mostraram o knockdown de VEGFR2 níveis de expressão de proteína (Fig. 2C) resultaram em um aumento no radiossensibilidade de A549 (SER

0,5 1,34) (Fig. 2D).

Neutralização VEGF aboliu a radiossensibilização efeito de miR-200c

Foi examinada a variação de secreation VEGF no meio extracelular após expressão ectópica de miR-200c, utilizando um ensaio de ELISA de VEGF. E nenhuma mudança significativa de VEGF secreation após intervenção miR-200c têm provado após testes duplicados (Fig. 3a). Bevacizumab (Bev, 1 mg /ml), um anticorpo bloqueador específico monoclony-VEGF, foi então adicionada ao meio de cultura de células A549 para diminuir a concentração de VEGF extracelular 1 hora antes da transfecção. Os ensaios de sobrevivência das colónias foram realizadas para investigar o efeito de radiossensibilização de miR-200 ° C com ou sem neutralização VEGF. Os resultados mostraram que o miR-200c não poderia diminuir fracção de sobrevivência pós-radiação sem activação induzida por VEGF (Fig. 3B).

Ensaio (A) O ensaio ELISA foi utilizado para detectar alterações da secreção de VEGF após transfecção de miR- imita 200C em células A549. Bevacizumab (B) e su1498 (C) foram aplicados para bloquear o VEGF-VEGFR2 via. Em seguida, ensaios clonogénicos foram realizados para examinar o efeito de radiossensibilização de miR-200 ° C após o VEGF-VEGFR2 bloqueio. Cada experimento foi repetido três vezes. erros padrão da média são mostradas por barras de erro.

VEGFR2 bloqueio aboliu a radiossensibilização Efeito do miR-200c

VEGFR2 foi bloqueada por su1498, um inibidor da tirosina quinase de crescimento endotelial vascular receptor do factor de 2 (VEGFR2). Su1498 foi adicionado no meio de crescimento de células A549 a uma concerntration final de 5 uM de uma hora antes da transfecção. Os ensaios clonogénicos foram realizados para aceder a sobrevivência de células A549 depois de diferentes doses de radiação. Os resultados mostraram que a inibição por rdiosensitization VEGFR2 foi significativamente bloqueada por inibição da via de VEGFR2 (Fig. 3C). Então miR-200c aumentou a radiossensibilidade do A549, principalmente, visando VEGFR2 via.

miR-200c inibiu a Ativação de ERK1 /2 e Akt

Para estudar mais aprofundadamente se os jusante vias de transdução de sinal de VEGFR2 estavam envolvidos em radiossensibilização de A549, investigamos MAPK e AKT percursos que eram mais importantes vias pró-sobrevivência a jusante de VEGFR2. As células A549 foram transfectadas com imita o miR-200C ou inibidores. Em seguida, examinou-se o nível de expressão e a activação de ERK1 /2 e AKT, que são as moléculas efectoras de MAPK e Akt. Em comparação com as células tratadas com controlos mimetiza, a activação de ERK1 /2 e AKT indicado por P-ERK1 /2 e P-Akt foram significativamente regulada negativamente em células A549 tratadas com imita o miR-200C (Fig. 4). Pelo contrário, os inibidores de miR-200C aumentou a activação de ERK1 /2 e AKT em comparação com controles de inibidor. Estes dados sugerem que a activação de ERK1 /2 e AKT modular o efeito de radiossensibilização de miR-200c (Fig. 4).

A expressão ectópica de miR-200c inibiu a fosforilação de Akt e ERK1 /2, a inibição da miR- 200c aumento da ativação da Akt e ERK1 2 pathway /. Cada experimento foi repetido três vezes.

miR-200c inibido Angiogenesis e migração de células HUVEC

Nós investigado que se miR-200c, um regulador direto de VEGFR2, poderia regular a angiogénese de células endoteliais. 48 horas após a transfecção, as células HUVEC foram jejuadas durante a noite e semeadas em placas de 96 poços que foram pré-revestidas com Matrigel. Após incubação durante 16 horas, as células miR-200c-transfectadas mostraram uma diminuição significativa da capacidade formação do tubo. Além disso, a sub-regulação de VEGFR2 por Si-VEGFR2 poderia também inibir a angiogénese de células HUVEC. Uma vez que a migração é um passo importante da angiogénese, também detectado o impacto de miR-200c sobre a migração de células HUVEC. Como mostrado na Figura 5, a expressão ectópica de miR-200 ° C, inibiram significativamente a angiogénese e a migração de células HUVEC. Por outro lado, a supressão de miR-200c aumento da formação do tubo e da migração por cerca de 30% para as células HUVEC.

HUVECs foram transfectadas com imita o miR-200C, inibidores de miR-200C ou Si-VEGFR2. HUVECs (A) foram cultivadas sobre Matrigel 48 h após a transfecção. Imagens representativas de estruturas do tipo capilar formadas e (B) o comprimento da estrutura capilar foram quantificados. (C) As HUVECs transfectadas também foram semeadas na câmara superior do poro de 8,0 mm 24 poços placas Transwell para investigar a capacidade de migração de células tamanho. (D) As células foram contadas migratórias e analisados ​​estatisticamente. Cada experimento foi repetido três vezes. erros padrão da média são mostradas por barras de erro. * Indica p 0,05 em comparação com o controle

Discussão

trabalhos anteriores do nosso grupo e outros têm sugerido que VEGF modula a sobrevivência do tumor através de uma variedade de maneiras, incluindo radiossensibilização [13]. – [15]. VEGF induz efeitos biológicos de um modo parácrino /autócrino através da ligação aos seus receptores, especialmente VEGFR2 (KDR, Flk-1). Alguns estudos pré-clínicos demonstraram que os benefícios terapêuticos da radioterapia pode ser melhorado quando combinado com inibidores da VEGFR2 [16]. Segmentação VEGFR2 via fornece uma nova maneira de superar radiorresistência na terapia de radiação de vários cancros. Recentemente, alguns miARNs foram demonstrados para modular a terapia de radiação de células cancerosas. MiR-200c é o regulador chave da epitelial para mesenquimal transição (EMT) que está associado com a embriogénese, a progressão do cancro e metástases. E miR-200c é expresso especificamente em tecidos do pulmão de rato normais [9] enquanto que a perda de expressão de miR-200c induziu um fenótipo agressivo, invasivo e resistente à quimioterapia no cancro do pulmão de células não pequenas [10]. VEGFR2 é um alvo previsto de miR-200 ° C por análise bioinformática (https://www.targetscan.org). Portanto, é importante para descobrir se miR-200c pode modular a radiossensibilidade das células cancerosas, visando VEGFR2 via.

Por ensaios de gene repórter duplo de luciferase e western blot, provamos VEGFR2 como um alvo direto de miR-200c . Em seguida, testámos os efeitos de expressão ectópica de miR-200c na radiossensibilidade de células A549. Verificou-se que a sobre-regulação de miR-200c com imita o miR-200C reduziu significativamente a expressão da proteína VEGFR2 e aumento da radiossensibilidade de células A549 depois de diferentes doses de radiação. No entanto, a infra-regulação da expressão de miR-200c com inibidores de miR-200C aumentou a sobrevivência das células e diminuiu radiossensibilidade. Nós ainda construído Si-VEGFR2 para inibir proteína VEGFR2 de células A549. Os resultados mostraram que a diminuição da expressão de VEGFR2 usando Si-VEGFR2 poderia aumentar a radiossensibilidade das células A549, que foi consistente com os efeitos de VEGFR2 sub-regulação de outras linhas de células de tumor [17], [18]. Então miR-200c poderia aumentar a radiossensibilidade do A549 por inibir a expressão VEGFR2.

No entanto, um único miRNA pode regular centenas de genes alvo. O mesmo acontece com as células radiossensibilizar A549 miR-200C principalmente através de segmentação VEGFR2 caminho? Su1498 é um inibidor da tirosina-cinase específica para VEGFR2. Descobrimos que miR-200c não poderia radiossensibilizar A549 enquanto VEGFR2 foi inibida por su1498. Uma vez que o VEGF é o principal ligando de VEGFR2 funcionado de uma forma parácrina /autócrina, examinamos primeiro variação da secreção de VEGF após transfecção de miR-200c e descobriram que imita o miR-200C não poderia afectar a secreção de VEGF de A549. Em seguida, neutralizada VEGF segregada fora das células A549 com bevacizumab antes de transfecção de miR-200c, e obteve um resultado negativo, assim como a inibição VEGFR2. Então, isso sugere que o miR-200c poderia radiossensibilizar células A549, visando VEGF-VEGFR2 via.

mecanismos jusante Então nós ainda investigados de radiossensibilização miR-200c. MAPK e de sinalização PI3K /AKT vias de transdução são duas importantes vias de sinalização a jusante de VEGFR2 [19]. direccionamento directo e inibição destas duas vias podem aumentar a radiossensibilidade das células cancerosas. Fosforilação de p44 /42 MAPK-(Thr202 /Tyr204) e AKT (Ser473), que são as moléculas chave da MAPK e PI3K /AKT vias de sinalização, geralmente aumenta a sobrevivência de células cancerígenas após a radiação. No nosso estudo, os ensaios de Western blot foram levados para examinar as alterações do nível de fosforilação de Akt e ERK1 /2 (p44 /42 MAPK-) após tansfection imita de miR-200C ou inibidores em células A549. Verificou-se que ao passo que o aumento da expressão de miR-200 ° C levou a uma inibição de Akt e ERK1 fosforilação 2 /, diminuição da expressão de miR-200c reforçada Akt e ERK1 /2 fosforilação em A549.

hipóxica microambiente extrínseco para células cancerosas contribui significativamente para a radiorresistência de radioterapia [7]. Supressão da angiogênese aumentou significativamente radiossensibilidade das células cancerosas. E VEGFR2, um mediador chave da angiogênese, poderia afetar a microbiota do tumor (TME) que modulam radiossensibilidade de células cancerígenas. Nossos dados sugerem que a expressão ectópica de miR-200c reprimida angiogênese de células HUVEC.

Além disso, nós também investigou outros mecanismos de interação miR-200c-VEGFR2. Com ensaios FCM ou MTT, não foram encontrados efeitos significativos de miR-200c no ciclo celular, apoptose ou a proliferação de células A549 (dados não mostrados).

Tomados em conjunto, os nossos resultados indicam que a inibição de miR-200c mediada da cascata de sinalização VEGF-VEGFR2 poderia radiossensibilizar células linha de células A549 NSCLC humano à radiação, que é um alvo terapêutico de radiossensibilização.

Conclusões

Nossos dados sugerem que miR-200c poderia significativamente radiossensibilizar A549 células por segmentação VEGF-VEGFR2 via.

Materiais e Métodos

Cultura de células

células A549, obtido a partir do celular Banco da Academia chinesa de Ciências (Xangai, China), foram cultivadas em meio RPMI 1640 contendo 10% de soro fetal de bovino a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 atmosfera. células HUVEC a partir da American Type Culture Collection (ATCC) foram cultivadas em meio de células endoteliais (ECM; Sciencell, EUA). O meio de cultura foi renovada a cada 2-3 dias. E as células foram passadas a cada 4 dias 1:6 seguinte tripsinização com 0,05% de tripsina-EDTA.

transientes transfecção e tratamentos com células

imita miR-200C, inibidores de miR-200C, Si- VEGFR2, controles imita, controles inibidores, e siRNA controles foram sintetizados por Ribobio (Guangzhou, China). As células foram semeadas a 4 x 10

5 por células em placas de 6 poços um dia antes da transfecção. Lipofectamina reagente 2000 (Invitrogen) de transfecção foi utilizado para transfectar células com imita o miR-200C (50 nM), inibidores de miR-200C (100 nM) ou ARN pequeno interferente VEGFR2 (Si) (100 nM). controlos não-alvo imita (50 nM), controlos de inibidores (100 nM) ou controlo de ARNsi (100 nM) foram transfectados em células de controlos negativos, respectivamente. 6 horas após a transfecção, o meio de crescimento celular foi removido e incubado em meio contendo 5% de FBS por mais 24-72 horas. Outras experiências foram realizadas com células transfectadas ou lise celular. Su1498 (Santa Cruz Biotechnology) ou Bevacizumab (Roche) foi administrado 60 minutos antes da transfecção.

identificação de alvos de miR-200C

Usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen), células A549 foram transfectadas com o repórter luciferase construções contendo o 3 ‘UTR de VEGFR2 ou os vectores de controlo negativo (Promega). As misturas de transfecção continha 100 ng de plasmídeo repórter fireflyluciferase e 50 nM de dúplex miR-200c sintética. As células A549 foram recolhidas 48 horas após a transfecção, e a actividade de luciferase foi medida utilizando o sistema duplo de Luciferase Reporter Assay (Promega).

Ensaio clonogénico

Sensibilidade de células A549 à irradiação foi determinado pelo ensaio clonogénico após as doses variáveis ​​de radiação (0Gy, 2 Gy, 4Gy, 6Gy, 8Gy) utilizando um acelerador linear (Primus K, Siemens, Munique, Bayern, Alemanha). Após incubação durante 10-14 dias, as colónias formadas foram fixadas com metanol e coradas com 1% de violeta de cristal. Apenas colónias constituídas por mais do que 50 células foram contadas. Os dados foram ajustados a um modelo linear-quadrática usando software SigmaPlot, onde as curvas de sobrevida foram gerados e os parâmetros de radiossensibilidade foram calculados. As experiências foram repetidas três vezes

Medição do VEGF Nível

O nível de secreation VEGF por células A549 foi avaliada pelo kit de VEGF-ELISA (R D, EUA). De acordo com o protocolo do fabricante .

Western Blotting

As células de lise foi preparado e separado por 8-12% de SDS-PAGE, seguido de transferência para membranas de PVDF (Millipore). Para a detecção, as membranas foram incubadas com anticorpos primários específicos e anticorpos secundários sequencialmente. Os anticorpos primários contra VEGFR2 ou β-actina foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology. Os anticorpos primários contra a P-ERK1 /2 e P-Akt foram adquiridos a partir de Cell Signaling. 2 anticorpo ERK1 /Akt e anticorpo foram adquiridos a Proteintech. bandas de proteínas foram desenvolvidas utilizando quimioluminescência aumentada em filmes ou imagens de fluorescência.

Formação tubo de ensaio e Cell Migration Assay

Para o ensaio formação do tubo, 1 × 10

4 células HUVEC foram semeadas em placas de 96 poços que foram pré-revestidas com 50 uL /​​poço de Matrigel (BD Biosciences) e incubou-se a 37 ° C. Cerca de 16 horas mais tarde, os tubos capilares formados foram avaliadas em campos aleatórios. Para o ensaio de migração, intervindo as células HUVEC foram adicionadas à câmara superior de placas de tamanho de poro de 24 poços Transwell de 8,0 mm (Millipore). A câmara inferior foi preenchida com o meio de crescimento completo como um quimioatractor. Após incubação a 37 ° C durante 24 horas, as células na superfície superior da membrana foram removidos. As células migradas foram fixadas e coradas com violeta de cristal com tampão de 0,5% para cerca de 20 minutos. Os valores contabilizados de campos aleatórios sob um microscópio foram analisados ​​estatisticamente.

Análise Estatística

Todos os dados foram apresentados como média ± SD e analisados ​​estatisticamente usando

t

um teste de Student. valor de P 0,05 foi considerado significativo

.