Abstract

Fundo

Celastrol é um inibidor do proteassoma natural que exibe efeitos promissores anti-tumorais em tumores humanos, especialmente o câncer de próstata andrógeno-independente (AIPC) com constitutiva da activação de NF-kB . Celastrol induz apoptose por meio de inibição de proteassoma e suprime o crescimento do tumor da próstata. No entanto, o mecanismo de acção detalhado permanece elusiva. No estudo atual, pretendemos testar a hipótese de que Celastrol suprime a progressão AIPC via inibição da actividade de NF-kB constitutivo, bem como modulação das proteínas da família Bcl-2.

Metodologia /Principais Achados

Foi examinada a eficácia de Celastrol tanto

in vitro

e

in vivo

, e avaliou o papel de NF-kB na AIPC regressão mediada por Celastrol. Descobrimos que inibiram a proliferação de células Celastrol em todas as três linhas celulares AIPC (PC-3, DU145 e CL1), com IC

50 na gama de 1-2 uM. Celastrol também suprimiu a migração celular e invasão. Celastrol induziu significativamente a apoptose como evidenciado pelo aumento da população sub-G1, a activação de caspase e clivagem de PARP. Além disso, Celastrol promovido a clivagem da proteína de Mcl-1 e anti-apoptótica activada a proteína pro-apoptótica Noxas. Além disso, Celastrol bloqueado rapidamente degradação citosólica IκBα e a translocação nuclear de RelA. Da mesma forma, Celastrol inibiu a expressão de múltiplos genes alvo de NF-kB que estão envolvidos na proliferação, invasão e anti-apoptose. Celastrol suprimida a progressão do tumor AIPC inibindo a proliferação, aumentando a apoptose e diminuição da angiogênese, no PC-3 modelo de xenoenxerto em ratinho nu. Além disso, o aumento da IκBα celular e expressão inibida de vários genes alvo NF-kB foram observadas em tecidos tumorais.

Conclusões /Significado

Nossos dados sugerem que, através de segmentação do proteassoma, Celastrol suprime a proliferação, invasão e angiogênese, induzindo a maquinaria apoptótica e atenuando constitutiva atividade NF-kB na AIPC ambos

in vitro

e

in vivo

. Celastrol como um ingrediente activo da medicina tradicional à base de plantas, assim, poderia ser desenvolvido como um novo agente terapêutico para o cancro da próstata refractário a hormonas

citação:. Dai Y, DESANO J, Tang W, X Meng, Meng Y, E Burstein , et ai. (2010) Natural Proteasoma Inhibitor Celastrol Suprime andrógeno-independente cancro da próstata Progressão através da modulação de apoptose Proteínas e NF-kappaB. PLoS ONE 5 (12): e14153. doi: 10.1371 /journal.pone.0014153

editor: Gen Sheng Wu, Wayne State University, Estados Unidos da América

Recebido: 10 de julho de 2010; Aceito: 10 de novembro de 2010; Publicação: 10 de dezembro de 2010

Direitos de autor: © 2010 Dai et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado em parte pelo Departamento de Defesa Programa de Pesquisa em Câncer de próstata [W81XWH-06-1-0010] e os Institutos Nacionais de Saúde (NIH) Instituto Nacional do Câncer [R01 CA121830 (S1), R21 CA128220 e R01 CA134655] para LX, e por NIH através de uma University of Cancer Center Support Grant Michigan [5 P30 CA46592]. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o proteassoma é um complexo de protease multicatalítica responsável pela degradação de várias proteínas intracelulares que estão envolvidos em diversos acontecimentos celulares, incluindo a reparação do ADN, do ciclo celular, sobrevivência e a apoptose. Por exemplo, p27, um regulador chave para G1 para S transição do ciclo da célula, é rapidamente ubiquitinadas e degradadas por proteassomas levando a semi-vida curta de p27 [1]. Além disso, a maioria das proteínas da família Bcl-2 são degradadas pelo sistema de ubiquitina-proteassoma (UPS) [2], [3], [4]. factor nuclear kapaB (NF-kB) é um importante factor de pró-sobrevivência que está articuladamente regulada pelo proteassoma, uma vez que é bem conhecido que na clássica via de NF-kB, IκBα, o sequestrante de NF-kB, é degradada pela proteassoma, portanto liberando NF-kB para ativação [5].

Cada vez mais evidências revela que a ativação sustentada ou constitutiva do NF-kB contribui para a progressão maligna e resistência terapêutica na maioria dos cânceres humanos [6]. Por exemplo, no cancro da próstata, constitutivamente activa NF-kB foi mostrado estar inversamente correlacionada com o estado do receptor de androgénio e ligados à resistência a independência e a terapêutica hormonal [7]. A elevada do NF-kB via de sinalização sobreviver no cancro da próstata independente de androgénios (AIPC) parece estar correlacionado com a elevada actividade do proteassoma, tal como reflectido por uma rotação mais rápida de IκBα [8], [9]. Com base nessas evidências, visando proteasomas pode diminuir a atividade de NF-kB e, assim, ser uma estratégia útil na intervenção AIPC. Na verdade, a modulação da função do proteossoma com inibidores específicos já tem sido demonstrada como uma abordagem promissora para o tratamento de cancro da próstata humano. Bortezomib (Velcade; PS-341), o primeiro a utilizar um inibidor de proteassoma de uma aplicação clínica, demonstrou actividade anti-tumoral quando usado como um agente único ou em combinação com terapias convencionais em cancro da próstata refractário a hormonas [10]. Em modelos pré-clínicos de cancro, inibidores de proteassoma induzir a apoptose de câncer de próstata, tanto

in vitro

e

in vivo

[11], [12], proporcionando provas substanciais de que os inibidores de proteassoma pode ser aplicado como uma terapêutica estratégia para AIPC.

Celastrol é um inibidor natural de proteassoma que tem sido relatado para mostrar efeitos anti-proliferativos e apoptose em diversos modelos de cancro da pré-clínicos [12], [13]. Mecanisticamente, o NF-kB foi demonstrado ser um alvo chave da Celastrol [14]. Estudos recentes têm sugerido que Celastrol pode intensificar a apoptose e bloquear a activação de NF-kB induzida quer constitutiva ou com outros agentes terapêuticos, tais como o factor de necrose tumoral [15], temozolomida [16] e ácido gambogic [17]. Além disso, é proposto Celastrol para suprimir o crescimento do tumor xenoenxertado através da segmentação angiogénese [18], [19]. Na configuração do cancro da próstata, por si só Celastrol desencadeia apoptose por meio de inibição de proteassoma e suprime o crescimento do tumor da próstata [12]. No entanto, o mecanismo de acção directa permanece indefinida. No estudo atual, pretendemos testar a hipótese de que Celastrol suprime a progressão AIPC via inibição da actividade de NF-kB constitutivo, bem como modulação das proteínas da família Bcl-2. Determinou-se a eficácia da Celastrol ambos

in vitro

e

in vivo

, e avaliou o papel de NF-kB na AIPC regressão mediada por Celastrol.

Materiais e Métodos

Reagentes e Cultura de células

Celastrol (98% de pureza) foi comprado de Gaia Chemical (Gaylordsville, CT). O pó foi resolvido em sulfóxido de dimetilo (DMSO) e armazenados como alíquotas (20 mM) a -70 ° C. MG-132 foi adquirido a partir de BIOMOL (Plymouth Meeting, PA). mistura de inibidores de protease foi fornecido pela Roche (Indianapolis, IN). Outros produtos químicos foram adquiridos da Sigma, a menos que indicado de outra forma. linhas celulares de cancro da próstata humano PC-3, DU145 e LNCaP foram adquiridos da American Type Culture Collection. A linha celular de cancro de próstata independente de androgénios CL1, derivada da linha celular de LNCaP dependente de androgénios [20], foi amavelmente fornecido pelo Dr. Arie Belldegrun (Universidade da Califórnia, Los Angeles, CA). As células foram mantidas em meio RPMI-1640 (PC-3) ou DMEM (DU145, LNCaP e CL1) suplementado com 10% de FBS, 100 U /ml de penicilina, e 100 ug /ml de estreptomicina, e incubadas numa atmosfera de 5% de CO

2 incubadora humidificada a 37 ° C.

a proliferação celular e a morte celular

As células foram semeadas numa placa de 96 poços e tratadas com Celastrol em triplicado. Após 4 dias de incubação, as células viáveis ​​foram identificados utilizando um kit de contagem de células com WST-8 (Dojindo, Rockville, MD) e a absorvância foi testado colorimetricamente a 450 nm. A viabilidade celular (%) foi a relação de absorvância de amostra tratada com o controlo não tratado [21], [22]. Alternativamente, as células foram semeadas numa placa de 24 poços a uma densidade de 2 × 10

5 células /poço e tratadas com Celastrol em poços duplicados. células ligadas foram recolhidas e contadas utilizando um contador de células Coulter (Fullerton, CA) a cada 24 horas durante 4 dias. A morte celular foi testado por exclusão com azul de tripano para ambos flutuantes e ligados células [21], [23]. Os dados foram representados graficamente e analisados ​​por GraphPad Prism 5.0 (San Diego, CA). concentrações inibitórias cinquenta por cento (IC

50) foram calculados usando uma análise dose-resposta sigmoidal não linear de regressão (Prism 5.0) [21], [22], [24].

A migração celular

a migração celular foi determinada por um “-cicatrização de feridas” de ensaio [25], [26]. As células foram semeadas numa placa de 6 poços e cresceu durante 48 h, para se alcançar confluência. Lacunas foram criados artificialmente por arranhar a monocamada de células. A migração celular foi fotografado 6 h, 24 he 48 h após cada zero. As células que migram para a área desnudada foram marcados a partir de quatro campos aleatórios.

celular Invasion

Invasion foi testada usando Transwell (8 de poro) pré-carregado com Matrigel (BD Biosciences, San Diego, CA ). As células foram incubadas com ou sem Celastrol (1? M) num meio isento de soro e carregada na câmara de topo (2 × 10

4 /pastilha). O meio completo (10% de FBS) foi adicionado para a câmara inferior para gerar um chemotractant. Vinte e quatro horas após a sementeira de células, as inserções foram esfregadas com uma mecha de algodão para remover o matrigel, e coradas com violeta de cristal (0,1%). células invasoras na parte inferior do filtro foram marcados a partir de oito campos aleatórios.

Análise do Ciclo Celular

As células foram fixadas em 70% de etanol a 4 ° C durante a noite, e, em seguida, tratada com iodeto de propídio ( PI, 50 ug /mL) e RNase a (1 ug /ml) durante 30 min. As amostras foram analisadas por citometria de fluxo (FACScalibur, BD Biosciences). A população sub-G1 foi apontado da marca de conteúdo hipodiploidia DNA [24], [27]. Os dados foram analisados ​​usando WinMDI 2,8 software (Purdue University Citometria Laboratory).

Caspase Activation

As células foram homogeneizadas num tampão de lise (BioVision, Mountain View, CA), e os lisados ​​de células inteiras (40 ug) foram incubados com 20 ^ M de substrato fluorogénico LEHD-AFC ou DEVD-AFC num tampão de reacção (BioVision) contendo DTT 5 mM a 37 ° C durante 1 h. libertação proteolítica de AFC foi monitorizada a λex = 405 nm e λem = 500 nm, utilizando um leitor de microplacas de fluorescência (BMG LABTECH, Cary, NC). A actividade é expressa como “dobrar aumento”, e calculada como a proporção de sinal de fluorescência em amostras tratadas com as células de controlo não tratadas.

Western Blot

célula inteira lisados ​​de células ou tecidos de tumor e foram feitas experiências de western blot foram realizados tal como foi descrito anteriormente [26]. Os anticorpos contra a poli (ADP-ribose) polimerase (PARP) (F-2), Mcl-1 (S-19), Bcl-2 (C-2), ubiquitina (P4D1), caspase-3 (H-277), IκBα (C-15), RelA (M-6), tubulina (4G1) e GAPDH (G-20) foram obtidos de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). O anticorpo anti-Noxas foi adquirido de Calbiochem (Gibbstown, NJ). O anticorpo anti-β-actina (CA-74) foi obtido a partir de Sigma (St. Louis, MO). densidade de banda foi quantificada por software TotalLab (Durham, NC).

subcelular Fracionamento

Foram preparadas citosólico e frações nucleares como descrito anteriormente [24], [25]. Resumidamente, extracto citosólico foi obtida por homogeneização de células num tampão hipotónico [HEPES 10 mM, KCl 5 mM, MgCl 1,5 mM

2 ditiotreitol e 1 mM (DTT) com o cocktail inibidor de protease], seguido pela adição de Igepal CA- 630 (0,5%). Os peletes foram resolvidos num tampão hipertónico (HEPES 20 mM, KCl 50 mM, NaCl 300 mM, PMSF 1 mM, DTT 1 mM, e inibidores de protease) para obtenção de extractos nucleares. proteínas subcelulares foram quantificados por ensaio de Bradford antes de Western blot.

quantitativa PCR em tempo real (qPCR)

qPCR foi realizado para determinar o NF-kB expressão do gene alvo [28]. O RNA total foi extraído usando o reagente TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante. O ADNc foi obtido por transcrição reversa com 1 ug de ARN total utilizando um Kit de Transcrição Reversa TaqMan (Applied Biosystems). SYBR Green foi utilizado para a PCR quantitativa. As sequências de iniciadores dos genes listados na Tabela S1. As reacções com TaqMan PCR Master Mix (Applied Biosystems) foram realizadas no Mastercycler

realplex

2 sistema S (Eppendorf, Westbury, NY). Os níveis de ARNm de genes alvo foram normalizadas para GAPDH utilizando a fórmula: [2∧- (C

T alvo-C

T Actina)] x 100%, em que C

T é o limiar de ciclo [27] . a expressão de ARNm é expresso como “aumento de vezes” e foi calculado dividindo-se a expressão do gene alvo normalizado da amostra tratada com células de controlo não tratadas.

estudo animal

ratinhos nu atímicos fêmea /nu (5 semanas) foram inoculados subcutaneamente (SC) com as células PC-3 (3 × 10

6) em ambos os lados da parte inferior das costas. Quando os tumores cresceram até 100 mm

3, os ratinhos foram distribuídos aleatoriamente e tratados diariamente por meio de gavagem oral (p.o.) com o controle do veículo [12] ou Celastrol a uma dose de 1 mg /kg com 5 dias por semana durante 3 semanas. O tamanho do tumor foi medido no último dosagem de Celastrol (dia 18). O volume do tumor foi calculada como (comprimento x largura

2) /2. As amostras dos tumores foram fixados em paraformaldeído a 4% e embebidos por parafina. A análise imuno-histoquímica foi realizada por Ki67, o terminal desoxinucleotidilo transferase de biotina-dUTP nick end rotulagem (TUNEL) e coloração de CD31 para a detecção da proliferação, apoptose e angiogénese, respectivamente, como descrito anteriormente [22], [23], [26] . Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com protocolos aprovados pela Universidade de Michigan Diretrizes para Uso e tratamento dos animais.

Análise Estatística

Dois-atado Estudante de

t

-test WAS empregada para analisar ambos

in vitro Comprar e

in vivo

dados. Toda a análise foi realizada por GraphPad Prism 5.0. Um limite de

P

. 0,05 foi definido como estatisticamente significativa

Resultados

Proliferação celular Celastrol Inibe o cancro da próstata

Celastrol tem sido relatada a mostrar actividade anti-tumoral em células de cancro da próstata humanos [12]. Em nosso estudo, confirmamos que Celastrol reduziu a viabilidade celular em ambos (PC-3, DU145, CL1) células cancerosas da próstata (LNCaP) e andrógeno-independente andrógeno-dependentes, com um IC

50 de citotoxicidade inferior a 2 m ( Fig. 1A). Para as células PC-3, Celastrol inibiu a proliferação dependente da dose (Fig. 1B), com inibição do crescimento de 65% no ic

dose de 50 (~ 1 ^ M) no dia 3. No 2 uM, Celastrol completamente o crescimento celular inibido em as linhas celulares testadas. Estes dados demonstram que Celastrol diminui de forma consistente a proliferação celular e a viabilidade AIPC nas concentrações 2 uM

(A): As células foram tratadas com várias doses de Celastrol e a viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de MTT.. IC

50 foi mostrado como calculado por Prism 5.0. Os dados são média ± SD (n = 3). (B): PC-3 células foram tratadas com diferentes doses de Celastrol (Cel). células ligadas foram recolhidas e contadas todos os dias durante 4 dias. Os dados apresentados são média ± SD (n = 6).

Celastrol Migração Suprime e Invasion

Como uma maior concentração de Celastrol foi citotóxico (Fig. 1), foi avaliado o efeito de Celastrol na migração celular e invasão usando doses não-tóxicas ( 1 pM). Celastrol inibiu a migração de células PC-3 em ambas uma dose e forma dependente do tempo (Fig. 2A). Com concentrações (0,5 uM) que minimamente afectadas proliferação, Celastrol impedido motilidade das células 24 h pós-tratamento (

P

0,001, Fig. 2B). Além disso, a invasão de células DU145 foi inibida a 70% por 1 uM de Celastrol (

P

. 0,001, Figura 2C e D). Estes dados sugerem que Celastrol suprime a migração celular e invasão AIPC em concentrações subcytotoxic

(A):. PC-3 de células em monocamada foram riscados e tratada com Celastrol a 0,5 e 1 uM. “Cicatrização de feridas” foi testada em 6 h, 24 he 48 h pós-zero. ampliação original, × 100. (B): quantificação da migração celular em A a partir de 4 campos aleatórios em amostras em duplicado.

Colunas

, média;

bares

, SD (n = 8). ***,

P Art 0,001. (C): células DU145 tratados com ou sem 1 ^ M de Celastrol foram semeadas em inserções Transwell revestidas com Matrigel (2 × 10

4 /inserção) durante 24 h. As células na parte inferior do filtro foram coradas. ampliação original, × 200. (D): em células invasoras (C) foram marcados a partir de 8 campos aleatórios.

Colunas

, média;

bares

, SD (n = 8). ***,

P

. 0,001

Celastrol induz a apoptose e modula Mcl-1