Abstract

Fundo

peroxissoma delta do receptor activado pelo proliferador (PPARd) é receptor da hormona nuclear envolvidos no câncer colorretal ( CRC) diferenciação e progressão. O objetivo deste estudo foi determinar a prevalência e espectro de variantes no

gene PPARd

no CRC, ea sua contribuição para endpoints clínico-patológicas.

métodos e resultados

A sequenciação directa do

gene PPARd

foi realizada em 303 tumores primários, em amostras de sangue de 50 pacientes com ≥3 parentes de primeiro grau afetados, 50 pacientes com 2 afetadas parentes de primeiro grau, 50 pacientes esporádicos, 360 controles saudáveis, e em 6 linhas celulares de cancro do cólon. análise de mutação revelou 22 transversões diferentes, 7 deles eram novos. Três de todas as variantes foram somática (c.548A G, p.Y183C, c.425-9C T, e c.628-16G A). Duas mutações missense (p.Y183C e p.R258Q) foram patogênicos usando

in silico

programa preditivo. Cinco variantes recorrentes foram detectados em /adjacente aos exões 4 (c.1-87T C, c.1-67G A, c.130 + 3 G A, e c.1-101-8C T) e o exão 7 (c.489T C). Variant c.489C /C detectada em tumores foi correlacionada a pior diferenciação (

P

= 0,0397).

Conclusões

Encontramos 7 novas variantes entre 22 hereditária ou adquirida

PPARd

variantes. variantes somáticas e /ou missense detectados em pacientes com CCR são raras, mas indicam a importância clínica da

PPARd

gene

Citation:. Ticha I, Gnosa S, Lindblom A, Liu T, Sun XF (2013) Variantes do

Gene PPARd

e seu significado clínico-patológicos em câncer colorretal. PLoS ONE 8 (12): e83952. doi: 10.1371 /journal.pone.0083952

editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japão

Recebido: 17 Setembro, 2013; Aceito: 10 de novembro de 2013; Publicação: 31 de dezembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Ticha et al. . Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento: Conceder um apoio Este trabalho foi apoiado por subsídios da Fundação do Câncer sueco, Swedish Research Council e pelo Conselho de Pesquisa de Saúde no Sudeste da Suécia. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

em todo o mundo, o diagnóstico de cancro colorectal (CRC) ocupa o segundo lugar no sexo feminino e em terceiro lugar no sexo masculino, e é a quarta causa mais comum de mortalidade por câncer. Além disso, a taxa de incidência de CRC é em ascensão [1]. A patogênese da CRC é complexa e ainda não totalmente compreendida. CRC é pensado para ser um processo de vários passos que implica uma acumulação de aberrações genómicas, insuficiência de apoptose, e anomalias de múltiplas vias de sinalização [2]. Um estudo recente das famílias suecas afetadas pela CRC demonstra o efeito significativo da predisposição genética dos pacientes CRC familiares [3]. Esses genes envolvidos na iniciação e progressão da CRC são limitados. genes de baixa penetrantes podem desempenhar um papel importante na tumorigênese colorretal e precisam ser identificados.

Durante a última década, grande atenção tem sido dada à investigação do papel do delta PPAR (PPARd) CRC em [4]. Anteriormente, grupo de pesquisa da Sun realizada mRNA e analisa proteína em tecidos e células linhas CRC, que sugeriram um papel inibitório da PPARd na tumorigénese colorectal [5] – [8]. Harman

et al

. [9] forneceram evidências também forte que PPARd atenua carcinogênese do cólon, utilizando modelos de ratos geneticamente modificados. Especificamente, PPARd promove a diferenciação e suprime a proliferação de células, que é suportada também por outros [10]. Além disso, a Sun e colaboradores encontraram uma correlação entre a expressão mais elevada de PPARd e sobrevivência favorável em pacientes com câncer retal [6].

Este factor de transcrição activado por ligando pertence à superfamília do receptor da hormona nuclear, e é codificado pelo gene

PPARd

(MIM # 600409), que tem nove exons, cinco deles são de codificação, e se estende por cerca de 85 kb no cromossoma 6p21.2 [11]. PPARd podem ser activados por ácidos gordos e seus derivados, e a sua expressão é relativamente elevado no tracto gastrointestinal, em comparação com outros tecidos [12]. PPARd tem sido mostrado para ser envolvido na regulação do metabolismo lipídico e da glucose e distúrbios [13] relacionada – [15], e é considerado um alvo de droga promissora para o tratamento de doenças da síndrome metabólica [16]

Apesar. o consenso emergente de que PPARd é um jogador chave no CRC, os resultados divergentes complicar o papel específico na tumorigênese. Se PPARd tem um papel promoção ou inibição da carcinogênese colorretal ainda está em debate [17], [18]. variantes genéticas no

gene PPARd

pode ser responsável por estes resultados controversos e até agora o papel da

PPARd

variantes na CRC não foi investigada. Poucos estudos investigaram a relação entre polimorfismos no

PPARd genes e características do metabolismo lipídico e de carboidratos [19]

, [20]. Codificação exons 4-9 do

gene PPARd

foram sequenciados na grande análise do genoma humano de mama e colorretal [21], [22]. No entanto,

PPARd

não foi validada como gene do cancro candidato nestas análises. Variant c.489T C (rs2076167) foi fechado em uma busca de alelos candidatos susceptíveis de CRC, mas sem correlação com o risco de CRC foi encontrado [23]

PPARd foi demonstrado estar envolvido no desenvolvimento de CRC. pelo nosso grupo e outros. No entanto, o significado do

PPARd

alterações genômicas em CRC não foi totalmente resolvido. Os objetivos do presente estudo foram (

i

) para determinar a frequência e espectro de variantes no

gene PPARd

em quatro grupos diferentes de pacientes com CCR incluindo 303 amostras de tecido de CRC, e 150 amostras de sangue a partir de: 50 pacientes CRC esporádicos, 50 pacientes com 2 afetadas parentes de primeiro grau, e 50 pacientes hereditários com ≥3 afetados parentes de primeiro grau, e (

ii

) para avaliar o potencial relação de variantes com clínico-patológico variáveis. Seis linhas celulares de cancro do cólon humano, comumente usado como

in vivo

modelos de câncer de cólon em laboratório do Sol e por outros, foram incluídos neste estudo.

Materiais e Métodos

Ética declaração

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade de Linköping, na Suécia e Karolinska Institutet, na Suécia.

pacientes e controles saudáveis ​​

Este estudo incluiu tecido CRC primário, e, quando disponível, mucosa normal distante de portadores do

PPARd

variante de 303 pacientes (grupo I) diagnosticados nos Hospitais da Universidade de Linköping e do Hospital Vrinnevi em Norrköping. O tecido foi coletada durante a cirurgia primária entre 1989 e 2004, e armazenadas a -70 ° C. As amostras de sangue não estavam disponíveis para esta coorte. Além disso, amostras de sangue de pacientes com CCR não relacionados: 50 pacientes esporádicos CRC (Grupo II), 50 pacientes com 2 afetadas parentes de primeiro grau (grupo III), 50 pacientes hereditários com 3 ou mais afetados parentes de primeiro grau (grupo IV), e 360 controles não-cancerosas, foram examinados. As amostras de sangue (grupo II-III) foram obtidos entre 2004 e 2009 a partir de 14 hospitais diferentes em meio a Suécia. Para estimar a frequência população das

PPARd

variantes, controlar subgrupo não-câncer, compreendendo doadores de sangue recrutados durante o ano de 2010 a partir da região Uppsala da Suécia, foram utilizados. Ambos os casos e controles eram de ascendência europeia e da Suécia. consentimento informado por escrito do doador ou o parente mais próximo foi obtido para o uso de suas amostras para fins de pesquisa. Características dos pacientes e controles são apresentados na Tabela 1. Os tumores com uma melhor diferenciação incluídos bem e moderadamente diferenciadas tumores, e pior diferenciação incluídos carcinoma pouco diferenciado, mucinoso ou células em anel de sinete. dados de diferenciação do tumor não pôde ser obtida para os grupos II a IV.

Linhas Celulares

A análise da mutação também foi realizado em 6 linhas celulares de cancro do cólon comumente usados. As linhas de células SW480 e SW620 foram obtidas de American Type Culture Collection. A linha celular SW480 foi estabelecida a partir de um adenocarcinoma de cólon primário, e o SW620 a partir de uma metástase de nódulo linfático, feita a partir do mesmo paciente um ano depois [24], [25]. O KM12C, linhas celulares KM12SM e KM12L4a foram gentilmente cedido pelo Prof. I.J. Fidler (M.D. Anderson Cancer Center, Houston, TX) [26], [27]. O KM12C é derivado a partir de um paciente com a fase II do cancro do cólon. O KM12SM é uma metástase hepática espontânea surgido a partir da injeção de KM12C no ceco de ratos nus. KM12L4a, uma metástase do fígado experimental, é produzida por injecção intra-baço repetido e colheita das metástases do fígado de ratinhos nus. A linha de células do cancro do cólon HCT-116 foi uma simpática oferta do Prof. B Vogelstein (O centro da célula núcleo, Johns Hopkins University, Baltimore, MD) [28], [29]. As linhas de células SW480, SW620, KM12C, KM12SM, e KM12L4a foram cultivadas em meio mínimo de Eagle essencial (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) e a linha de células HCT-116 em McCoys5A (Sigma Aldrich), suplementado com 10% inactivado pelo calor fetal de albumina de soro de bovino (Gibco, Invitrogen, Paisley, Reino Unido), 0,5% de L-glutamina (GIBCO), 1% de penicilina e cocktail de estreptomicina (GIBCO) a 37 ° C e 5% de CO

2 numa incubadora humidificada. Para a solução de vitaminas células KM12 2% (GIBCO) foi adicionado. As células foram colhidas a 80% de confluência.

Isolamento de ácidos nucleicos a partir de tecidos, linhas celulares do sangue e do

O ADN foi isolado a partir de tecido fresco congelado do tumor, e linhas de células de sangue periférico total utilizando procedimentos convencionais execução Assistente Sistema de purificação de ADN genómico (Promega, Madison, WI) ou DNeasy Blood Kit de tecido (Qiagen, Hilden, Alemanha). O ARN total de amostras de tecido e em particular células de cultura foi isolado utilizando RNeasy Mini Kit (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante.

Análise Mutação

A região de codificação da

PPARd

gene foi rastreada por PCR e sequenciação directa de ADN em 203 Sanger tumores, 150 amostras de sangue de pacientes de CRC (grupo II-IV), e 6 linhas de células. Por causa do tempo e eficiência de custos, a 100 amostras tumorais adicionais assim como controlos foram pesquisados ​​em duas regiões mais frequentemente alterados abrangendo os exões 4 e 7. A adenina do codão de iniciação da tradução é de 102 de base de exão 4. Assim, os exões 4 a 9 e adjacente intrónica sequências do gene da

PPARd

foram amplificados usando FastStart sistema de PCR de alta fidelidade (Roche Applied Science, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. Big Dye Terminator

v

3.1 Mix de Reacção Pronto (Applied Biosystems, Foster City) foi utilizado para a reacção de sequenciação e separação foi realizada em ABI 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Os dados coletados foram analisados ​​usando o software analisador Sequence (Applied Biosystems). iniciadores desenhados utilizados para a amplificação e análise de sequenciação são mostrados na Tabela S1. Cada mutação ou suspeitos fragmentos foram verificados por uma outra análise independente amplificação e seqüência de PCR.

análise de transcriptase reversa-PCR usando High Capacity cDNA Transcrição Reversa Kit (Applied Biosystems) foi realizada de acordo com as instruções do fabricante em 3 estojos variantes c.130 + 3 G A e c.1-101-8C T com ARN disponível a partir do tumor e tecido normal correspondentes. Um fragmento de ADNc de 856 pb delimitada pelos iniciadores RP_01 /02F ‘junção de passagem de exões 1 e 2, e PRD_08R 5′-TCTGCCTGCCACAATGTCTC-3′ 5’-CAGTGTTGTACAGTGTTTTG-3 situados no exon 8 foi amplificado por PCR e directamente sequenciado (Fig. 1) . O mesmo fragmento de ADNc foi sequenciado em SW480, SW620, KM12C, KM12SM, e linhas celulares KM12L4a

Representante de análise de sequenciação de ADNc isolado a partir de mucosa normal a partir do transportador de variantes c.130 + 3 G . Um (intrão 4) e c.1-101-8C T (intron 3) mostra falta do exão 4; em peso – sequência do tipo selvagem, mut – mutado sequência. junção exão é indicada por

linha tracejada

. Exon 3 estava ausente, tanto do tipo selvagem eo alelo mutado.

Nomenclatura das Mutações

As mutações foram descritas de acordo com o sistema de nomenclatura recomendada pelo Genome Variation Sociedade Humana (veículos pesados) [30 ]. Designação das alterações genômicas no

gene PPARd

é baseado nas sequências de referência GenBank NG_012345.1 e NM_001171818.1. Mutações que não foram encontrados na literatura, o banco de dados Single Nucleotide Polymorphism (dbSNP, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/, acessado em 8 de agosto de 2013) [31], ou no Catálogo de as mutações somáticas em Câncer (COSMIC, https://www.sanger.ac.uk/cosmic, acessado em 08 de agosto de 2013 [32], foram considerados como novos. Há inconsistência na descrição do variantes c.1-87C T (rs2016520) na região 5 ‘não traduzida (UTR) do exão 4, e c.489C T (rs2076167; p.N163) no exão 7. de acordo com a sequência de referência de GenBank (NCBI) o alelo de tipo selvagem é C, mas de acordo com a genotipagem no grupo controle (Tabela 2), o C-alelo é menor para ambas as variantes. Ele está em concordância com outros dois estudos que realizaram genotipagem incluindo estes dois polimorfismos em coortes maiores [15], [19] . É de notar, Skogsberg

et al

[15] chamado variante c.1-87T .. C + como 294T /C Nisto, nomeamos estas variantes c.1-87T C e c.489T C.

In silico

ferramentas de previsão para avaliar o impacto da detectado missense variantes

para a avaliação da importância funcional de variantes missense detectados foram empregados vários amplamente utilizado

in silico

programas de previsão. Estes programas sugerem a possível interferência com a função biológica e estabilidade da proteína: SIFT como parte do programa comercial Alamut 2,0 (Interactive Biosoftware, Roven, França), PolyPhen-2 (https://genetics.bwh.harvard.edu/pph2 /), PROVEAN (https://provean.jcvi.org/index.php), Align GVGD (https://agvgd.iarc.fr), Mutation Taster (https://www.mutationtaster.org), MUpro ( https://mupro.proteomics.ics.uci.edu).

Análises estatísticas

as análises foram realizadas usando o STATISTICA 10 (SatSoft, Tulsa, OK). O teste do qui-quadrado foi aplicado para determinar a relação entre a recorrente

PPARd

variantes e variáveis ​​clínico-patológicas, para avaliar as diferenças em alterações frequências entre grupos II-IV e controles, e para testar a distribuição de genótipos nos controles para uma saída do equilíbrio de Hardy-Weinberg. Modelo proporcional de perigo de Cox foi utilizado para testar a relação entre variantes PPARd ea sobrevida do paciente, bem como o método de Kaplan-Meier foi utilizado para as curvas de sobrevida. Todos os testes foram frente e verso, e uma

P

-valor inferior a 0,05 foi considerado como significativo.

Resultados

Variantes do

Gene PPARd

em CRC pacientes, controles saudáveis, e linhas celulares

a análise da sequência de ADN directa do

gene PPARd

demonstra 22 variantes de um único nucleotídeo diferentes, daqueles 5 eram recorrentes e 7 eram novas variantes (Tabela 2 e 3). A frequência de repetição de cinco

PPARd

variantes em diferentes coortes de pacientes de CRC, controlos saudáveis, e linhas de células são mostradas na Tabela 2. As distribuições genotípica de variantes de um único nucleótido recorrentes hereditárias eram consistentes com o equilíbrio de Hardy-Weinberg (dados não mostrados ). Todas as variantes detectadas foram transições (4 missense, 3 em silêncio, e 15 variantes não codificadoras). Para avaliar os efeitos previstos das variantes missense sobre a função da proteína, seis

in silico

ferramentas de previsão foram utilizados. Na verdade, p.Y183C mutação somática, e p.R258Q mutação foram categorizados como deletéria (Tabela 4).

Recurrent

PPARd

Variant em relação às variáveis ​​clínicopatológicos

Associação de variantes recorrentes com características clínico-patológicas, incluindo sexo, idade, localização do tumor, estágio e diferenciação, foi investigada. c.489C Variante /C foi significativamente relacionado a pior diferenciação comparar com T /C e genótipos de T /T (

P

= 0,0397, Tabela 5). Os dados clínico-patológicos dos pacientes com a variante detectada c.489C /C são apresentados na Tabela S3.

Não houve relação significativa da recorrente

PPARd

variantes com outras variáveis ​​clínico-patológicas, incluindo o género , idade, localização do tumor e estágio. (

P Art 0,05, dados não mostrados)

Caracterização de Recurrent

PPARd

Variantes

No total, 196 variantes em 106 (35%) pacientes dos pacientes fora do grupo II, 45 variantes em 22 (44%) pacientes fora do grupo III, e 22 variantes em 11 grupo I, 28 variantes em 17 (34%) (22% ) pacientes fora do grupo IV foram detectados. Cinco alterações recorrentes da linha germinativa (Tabela 2), quatro localizados dentro ou adjacente ao exão 4 (c.1-87T C, c.1-67G A, e variantes conjunta c.130 + 3 G A e c.1-101 -8C T) e um no exon 7 (c.489T C) foram responsáveis ​​por grande maioria de todas as variantes identificadas, e muitas vezes ocorreu em conjunto, sem um padrão rigoroso de combinação variante. A maioria dos portadores de, pelo menos, uma menor C-alelo no c.1-87 posição em 5′-UTR eram também portadoras de pelo menos uma menor C-alelo no c.489 posição. Portadores da variante c.1-67G A a 5′-UTR do exão 4 transportados também uma outra variante, quer c.489T /C ou c.489C /C, com excepção de um caso (grupo II) com as variantes c. 1-101-8C T e c.130 + 3G A. O intrônica germinal variantes c.1-101-8C T e c.130 + 3G A, localizado a oito pares de bases a montante e 3 pares de bases a jusante do exão 4, respectivamente, ocorreram sempre juntos. Todos os pacientes e controles com estas variantes eram portadores de heterozigotos variante c.489T /C, exceto dois pacientes (Grupo II) – uma que carregava variantes c.489C /C e c.1-67G /A, e um portador da variante c .1-67G /a.

analisa mutação em amostras de sangue mostraram que a quantidade de pacientes portadores alterações hereditárias foram menores no grupo IV compara com os grupos II e III combinados (

P

= 0,037 ), enquanto que não foi observada nenhuma diferença entre os grupos II e III (

P

= 0,305; Tabela 2). A frequência de variantes recorrentes em exons 4 e 7 não diferiram significativamente entre população de controlo e de subgrupos II, III ou IV, com excepção variantes comuns c.1-101-8C T e c.130 + 3G A, que foram encontrados em 10% dos pacientes no grupo III, em comparação com 2,5% no grupo controlo (

P

= 0,003; Tabela 2).

Misto variantes c.1-101-8C T e c.130 + 3G a está na vizinhança de locais de splicing de consenso e tem o potencial de alterar splicing pós-transcricional. Para avaliar o impacto destas variantes, a partir de ARN do tumor e tecido normal de 3 indivíduos afectados e de controlo inalterados foram extraídos e transcrição reversa foi realizada. A análise da sequência do fragmento de PCR, compreendendo a região a partir da extremidade do exão 1 ao exão 8 de ADNc, revelou falha do exão 4 (Fig. 1). Todas as amostras analisadas foram falta o exão 3. A sequenciação do fragmento de ADNc mesmo em linhas celulares também revelou falta do exão 3 (dados não mostrados). Cinco variantes de transcritos alternativos conhecidos de PPARd foram descritos (https://www.ncbi.nlm.nih.gov, Gene ID: 5467) e apenas uma dessas variantes contém o exão 3 na sequência de mRNA. número transcrição Alternativa 4 com ausência de exons 3 e 4 tem códon de iniciação alternativo no exão 2 e isoforma proteína expressa 3, que difere em N-terminal por causa da falta de uma parte de 5′-sequência de codificação. Outras variantes de transcritos têm códon de iniciação no exão 4.

Análise de forma aleatória 20 amostras pareadas (amostras que foram heterozigotos ou homozigotos de variante mutada em pelo menos um dos sítios polimórficos c.1-87 ou c.489) revelaram igual heterozigotia nos sítios polimórficos c.1-87T /C e c.489T /C em 4 tecidos normais, enquanto que nas amostras de ADN de tumor correspondentes foi observada diferente proporção de ambos os alelos repetidamente (Figura 2).

N – tecido normal, o t – tecido de tumor; # 516 é exemplo de análise da sequência com o mesmo padrão em tecido normal e tumoral.

caracterização de novos e /ou somática

PPARd

Variantes

Sete novas variantes foram detectadas em pacientes, controlos e /ou em linhas de células (Tabela 3). Destes, três variantes foram missense e 6 localizado em íntrons. Uma dessas novas variantes intrônicas foi somática, um foi encontrado no grupo controle, e um em cada linha de células HCT-116. Todas estas variantes foram heterozigotos e detectou apenas uma vez. Além de novas variantes, mais 2 esporádica e 8 variantes raras foram detectados. Características dos doentes com a variante rara detectados são relatados na Tabela S2

Curiosamente, duas das três variantes somáticas detectados, c.425-9C . T (sete pares de bases a partir do sítio de splicing de consenso 3 ‘) e C .548A G (no exão 7, que leva à alteração da tirosina de aminoácidos altamente conservada a cisteína no codão 183, e ocorreu em conjunto com variantes comuns c.1-101-8C T e c.130 + 3 G a) , foram detectados nem em outras duas amostras de DNA extraído de espacialmente diferentes partes do tumor nem na mucosa normal correspondente

a mutação missense c.773G . a (p.R258Q) no exão 8 foi detectado em SW480 ( a linha celular derivada de adenocarcinoma do cólon), mas não em células SW620 (linhagem celular derivada de linfonodo metástases). Esta variante ocorre num domínio de ligação ao ligando e leva à alteração da altamente conservada aminoácido arginina para glutamina

Ambos missense variantes c.548A . G (p.Y183C) e c.773G A (p. R258Q) foi sugerido como fator patogênico usando

in silico

programas preditivos (Tabela 4).

Discussão

o presente estudo mostra pela primeira análise de sequência de tempo do

gene PPARd

em diversos grupos de pacientes com CCR, controles saudáveis, e modelos de linhas celulares de cancro do cólon. Detectamos 5 recorrente e 17 variantes raras, dos quais 7 foram relatados pela primeira vez neste estudo. Dois ou mais

PPARd

variantes, em sua maioria alterações recorrentes, ocorreu junto na maioria dos pacientes com a variante detectada. Dois dos quatro variantes missense detectados (p.Y183C e p.R258Q) foram classificados pela

in silico

programas de previsão da probabilidade patogênicos.

Ainda mais interessante, analisa em uma coorte de 303 CRC pacientes (grupo I) revelaram que os portadores da variante c.489C recorrente /C tinha tumor pior diferenciada em comparação com o c.489C /T e c.489T /T. No entanto, não está claro se esta variante impulsiona o desenvolvimento do tumor, ou se é apenas uma mutação de passageiros sem efeito direto sobre a aptidão das células tumorais.

Foi proposto que os cancros do proximal e distal cólon pode ser de dois tipos de câncer distintas com diferentes fatores de risco genéticos e ambientais, e não foram descritas as diferenças genéticas entre os tipos de câncer que surgem no proximal e distal do cólon [33]. No entanto, não revelou diferenças significativas na distribuição de alterações entre cólon e reto carcinomas, nem entre tumores lados esquerdo e direito.

Além disso, três somática

PPARd

variantes, c.425-9C T, c.548A G (p.Y183C), e c.628-16G a, foram detectadas em três tumores do cólon esporádicos (grupo I). Observou-se uma variante somática heterogênea que não era detectável em todas as partes do tumor sequenciado. A variante c.548A G foi anunciada no banco de dados COSMIC de mutações somáticas em um paciente afetado por carcinoma de células escamosas [32]. Até à data, o COSMIC contém 40 diferentes

PPARd

variantes somáticas, espalhados em todo o gene, detectados em 43 pacientes únicas. Destes, 3 variantes silenciosas e 7 missense foram encontrados em 10 adenocarcinomas mucinosos do cólon, e uma variante missense na amostra de tumor rectal. Somatic

PPARd

variantes foram descritos também no pulmão, da mama, dos ovários, endométrio, fígado e tumor da próstata, e de neuroblastoma. A presença de variantes somáticas em tumores CRC suporta a relevância da

PPARd

no CRC tumorigênese.

Screening nas amostras de sangue de pacientes revelou frequência semelhante das variantes recorrentes localizadas em ou adjacentes a elas, exons 4 ou 7, entre os grupos de pacientes II, III e IV em comparação com o grupo controle, com exceção de uma maior prevalência da articulação variantes c.1-101-8C T e c.130 + 3G a no grupo III. Curiosamente, observou-se a maior frequência de variantes da linha germinativa na população de baixo risco de pacientes com dois parentes de primeiro grau afetados (grupo III), enquanto que a frequência mais baixa foi observada no grupo de alto risco de pacientes com CCR hereditárias (grupo IV). No entanto, qualquer interpretação substancial dos dados está limitado por pequenos conjuntos de amostras e a pouco, embora estatisticamente significativa, as diferenças. Outras análises de séries maiores de pacientes são desejados para análises comparativas precisas

Encontramos nova mutação missense c.773G . A (p.R258Q) na linha de células de câncer de cólon primário SW480 e não na célula metastático de linfonodos linha SW620. Uma característica única de linhas celulares SW480 e SW620 é que eles são derivados a partir de tumores primários e secundários ressecados a partir do mesmo paciente. Outra variante, c.1078 + 22G A, está presente apenas na primária derivada tumor de células linhas KM12C mas não nas linhas de células metastático experimentais KM12SM e KM12L4a. estatuto distinto mutação em linhas de células de tumor primárias e linhas de células metastáticas, bem como a detecção de variantes somáticas apenas numa parte do tumor (c.425-9C T e c.548A G) estão em concordância com o modelo de clonal evolução do câncer e intratumoral heterogeneidade genética [34], [35]. distribuição espacial de subclones com diferentes aberrações cromossômicas dentro de tumores e metástases foi descrita recentemente [36]. A ocorrência do

PPARd

mutação em linhas de células primárias, mas não na linha de células metastático pode ser também explicada por deleção no

PPARd

loci durante tumor e formação de metástases. Além disso, a análise da sequência de ADN nas amostras emparelhadas (grupo I) mostraram, em vários casos proporção diferente de alelos em dois sítios polimórficos, localizada no exão 4 e 7, quando comparado com o tecido normal de tumor. Considerando o fato de que o

gene PPARd

está localizado no antígeno leucocitário humano (HLA) complexa na região cromossómica 6p, que é frequentemente afectada por deleções e rearranjos em cancros humanos [37], [38], a nossa observação pode sugerir perda de heterozigosidade no

PPARd

loci em subclones de células tumorais durante o desenvolvimento do tumor.

de nota, grande maioria das alterações detectadas são transcricionalmente silencioso, quer localizado em 5′- ou 3 ‘ -UTRs ou em íntrons. Diversas linhas de evidência sugerem que qualquer variante de nucleotídeos (intrônica, nonsense, missense, sinónimo) pode ser considerado como potencialmente deletéria, pois pode alterar o normal splicing de pré-mRNA

via

mudanças nas sequências de consenso de emenda, criação de novos críptica sequências, carinho de taxa de translação, ou muda de mRNA ou a estabilidade da proteína [39] – [41]. Tais variantes anteriormente negligenciadas poderiam ser susceptíveis a doenças hereditárias. Infelizmente, em nosso estudo não foi possível testar todas as variantes no nível de mRNA devido à falta das amostras particulares tecidos ou sangue para isolamento do RNA. No entanto, a análise da sequência de ADNc em portadores de variantes herdadas c.130 conjunta + 3 G A e c.1-101-8C T revelou salto do exon 4, o que pode conduzir a tradução da isoforma com PPARd mudado N-terminal de proteína em comparação com a forma de tipo selvagem. O

PPARd

variantes em 5′-UTR pode ser de especial interesse, por causa do papel regulamentar a hipótese de expressão de mRNA. No entanto, na coorte de 303 pacientes com CCR, não encontramos uma associação entre variantes recorrentes em 5′-UTR (c.1-87C T e c.1-67G A). E variáveis ​​clinicopatológicas

Nós gostaríamos de reforçar a importância da caracterização da base genética de linhas celulares utilizadas como sistemas modelo. Por exemplo, dois laboratórios mostraram que a expressão da proteína PPARd era dependente de APC /

beta

via -catenina [42], [43]. Sua conclusão foi baseada na observação de que a expressão relativa da PPARd foi semelhante ou menor em células SW480 que têm um mutante

APC

gene e uma do tipo selvagem

beta

gene -catenina. No presente estudo, detectou missense

PPARd

mutação (p.R258Q) em células SW480 que podem influenciar a interpretação desses resultados e indica o uso limitado de linha de células SW480 para o

In vivo

estudos . Além disso, a análise abrangente do

gene PPARd

poderia ser útil na concepção de medicamentos, uma vez que PPARd fornece um alvo atraente para intervenção terapêutica até agora em pacientes com síndrome metabólica [16].

Em conclusão, identificamos 22

PPARd

variantes, embora variantes potencialmente funcionais detectado no

gene PPARd Quais são raros. variante sinónimo c.489T C (p.N163N; rs2076167) poderiam ser de interesse clínico para sua associação com CRC pior diferenciado. Em última análise, os futuros estudos em uma série de amostras clínica independente vai ajudar a resolver se qualquer um dos

PPARd

variantes são possíveis modificadores de CRC suscetibilidade ou prognóstico.

Informações de Apoio

Tabela S1. .

Iniciadores utilizados para amplificação por PCR e análise da sequência

doi: 10.1371 /journal.pone.0083952.s001

(DOCX)

Tabela S2.

Rare

PPARd

variantes em função das características clínico-patológicas

doi:. 10.1371 /journal.pone.0083952.s002

(DOCX)

Tabela S3.

homozigótica c.489C variante em relação às características clinicopatológicas

doi:. 10.1371 /journal.pone.0083952.s003

(DOCX)

Reconhecimentos

Agradecemos para médicos e pacientes para a sua colaboração. Os agradecimentos especiais pertencem ao Dr. Gunnar Arbman (Departamento de Cirurgia em Östergötland, Norrköping, Suécia) para a recolha de amostras e dados, Assoc. Prof. Zdenek Kleibl MD, Ph.D (Instituto de Bioquímica e Oncologia Experimental da Universidade Charles, em Praga, República Checa) para as discussões críticas, Brandon R. Macias Ph.D (UCSD Medical Center, da Universidade da Califórnia, San Diego, CA ) e Veronika Patcha Brodin Ph.D (Divisão de Oncologia do Departamento de Medicina Clínica e Experimental, Faculdade de Ciências da Saúde, Conselho do Condado de Östergötland, Universidade de Linköping, Linköping, Suécia) para a revisão do manuscrito, e Birgitta Holmlund (Departamento de Medicina Clínica e Experimental, Universidade de Linköping, Linköping, Suécia) para excelente assistência técnica durante o isolamento de DNA.