Abstract

O ácido betulínico é um triterpeno pentac�lico que exibe funções anticancerígenos em células cancerosas humanas. Este estudo fornece provas de que o ácido betulinico é altamente eficaz contra a linha celular de cancro cervical humano HeLa, induzindo a apoptose da dose e dependente do tempo. O processo de apoptose foi investigado usando uma abordagem proteômica para revelar as mudanças de expressão de proteína em células HeLa após o tratamento ácido betulínico. proteomic análise revelou que havia seis para cima e trinta regulada negativamente proteínas em células HeLa induzida por ácido betulinico, e estas proteínas foram então sujeitas a análise de caminho funcional usando software de análise múltipla. UDP-glucose-6-desidrogenase, 6-fosfogluconato desidrogenase descarboxilação, cadeia A-Horf6 uma nova enzima peroxidase humana que a envolvida no processo redox, verificou-se ser sub-regulada durante o processo de apoptose da via de resposta ao estresse oxidativo. Consistente com os nossos resultados ao nível da proteína, um aumento de espécies de oxigénio reactivo intracelular foi observado em células tratadas com ácido betulinico. O TIP47 proteína proteína e carga-selecção proteínas glucose-regulados, que estão envolvidos na via retículo endoplasmático, foram up-regulada por tratamento com ácido betulínico. Enquanto isso, 14-3-3 proteínas da família, incluindo 14-3-3β e 14-3-3ε, foram regulados negativamente em resposta ao tratamento com ácido betulinico, o que é consistente com a diminuição da expressão de genes alvo a

14 -3-3β

e

14-3-3ε

. Além disso, verificou-se que o anti-apoptótico

Bcl-2

gene foi regulada para baixo enquanto que a pró-apoptótica

Bax

gene foi regulada para cima após tratamento com ácido betulinico em células HeLa. Estes resultados sugerem que o ácido betulinico induz a apoptose de células HeLa por desencadear tanto a via do retículo endoplasmático e da via mitocondrial ROS mediada

citação:. Xu T, Pang Q, D Zhou, Zhang A, Luo S, Wang Y, et al. (2014) proteômica Investigação sobre apoptose Betulinic Acid-Induced das células cervicais Human Cancer HeLa. PLoS ONE 9 (8): e105768. doi: 10.1371 /journal.pone.0105768

editor: Daniela Flavia Hozbor, Universidad Nacional de La Plata, Argentina

Recebido: 18 Abril de 2014; Aceito: 26 de julho de 2014; Publicação: 22 de agosto de 2014

Direitos de autor: © 2014 Xu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Esta pesquisa foi financiada pelo Fundo Indústria Florestal Pesquisa Especial de Bem-Estar Público (201004069) e os Fundos investigação fundamental para as Universidades Central ( DL13EA02-03). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o ácido betulinico (3β-hidroxi-Lup-20 (29) -en-28-óico) (BA) é um triterpeno do tipo lupano natural encontrado na casca das árvores de vidoeiro branco. BA desempenha um papel crucial como uma fonte para os compostos anti-cancro potenciais [1]. Estudos in vitro têm mostrado que este agente é potentemente eficazes contra uma ampla variedade de células cancerosas, incluindo melanoma, leucemia, carcinoma do cólon, carcinoma do pulmão, carcinoma da próstata e mieloma múltiplo [2] – [8], ao mesmo tempo, BA e os seus análogos podem ser utilizados como agentes terapêuticos potenciais para o HIV-1 infecção [9], [10]. É bem conhecido que as mitocôndrias desempenham um papel importante na via intrínseca da apoptose de mamíferos. Uma diminuição no potencial de membrana mitocondrial interna está associada com o tratamento BA, que sugerem que a via intrínseca mitocondrial está envolvida na apoptose induzida por BA. A via mitocondrial é precedida pela geração de espécies reactivas de oxigénio (ROS) e é regulada pela família Bcl-2 de proteínas, o qual consiste em prosurvival (por exemplo, Bcl-2, Bcl-XL e Mcl-1) e pró-apoptótica (Bax , proteínas ruim e BH3-somente) membros [10], [11]. BA foi mostrado para induzir a apoptose de uma forma de CD-95 e independente de p53 por um efeito directo sobre as mitocôndrias [4], [12], [13]. Formações de ROS e proteína neosynthesis foram relatados a ser exigido para a morte induzida por BA celular [14], [15], [16]. Um estudo anterior da apoptose pela BA descobriram que a via mitocondrial foi inibido por Bcl-2 /sobre-expressão de Bcl-xL em células de mieloma múltiplo humano [15], BA induz apoptose principalmente através de uma via mitocondrial com especificidade tumoral.

cancro do colo do útero é o terceiro tipo mais comum de tumor em mulheres [17]. Vários tratamentos são utilizados para o cancro do colo do útero, mas cada um deles tem efeitos adversos graves. Portanto, é ainda necessário encontrar um tratamento mais seguro e mais eficiente. BA é um triterpeno pentacíclico derivado de plantas que é tóxico para as células cancerígenas, mas não tem nenhum efeito sobre as células não transformadas [1], [2], [8]. Tem sido relatado que a BA induz atividade antiproliferativa sobre o cancro do colo do útero [18], mas os mecanismos moleculares deste processo não são totalmente compreendidos.

O principal objetivo do presente estudo é investigar os mecanismos moleculares subjacentes à efeitos anticancerígenos potenciais de BA em células cancerosas cervicais humanos. profiling proteoma global levou à identificação de várias vias que respondem ao tratamento BA e ajudaram a compreender melhor os mecanismos relacionados com a apoptose da BA. Neste trabalho, caracterizamos o perfil de proteína relacionada com a apoptose de células HeLa tratadas com BA usando uma abordagem comparativa proteômica 2-DE. As funções moleculares e os processos biológicos envolvidos no mecanismo da apoptose induzida por BA vai ser discutido. Alterações na expressão de quatro genes que codificam proteínas relacionadas com a apoptose foram analisados ​​através da realização de análise de PCR em tempo real (qRT-PCR).

Materiais e Métodos

cultura celular e Ensaio de Proliferação

BA foi adquirido de Boyle Chemical CO., LTD (Xangai, China). A linha celular de cancro humano HeLa foi adquirido a partir do centro do tumor (Pequim, China). As células foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Hyclone, Logan, UT, EUA) com 10% de FBS (PAA, Áustria), 100 U /mL de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina (Hyclone, Logan, UT, EUA). As células foram semeadas em microplacas de 96 poços e em seguida incubadas a 37 ° C em 5% de CO

2. Após 24 h, o meio foi removido e substituído com meio fresco contendo várias concentrações de BA. Em seguida, 30 uL de 3 mg /ml de MTT (Amresco, EUA) em PBS foi adicionado a cada poço, e, em seguida, a placa foi ainda incubada durante 4 h. O sobrenadante remanescente foi removida, e 150 mL de DMSO foi adicionado a cada poço e misturou-se cuidadosamente para dissolver os cristais de formazano que se formaram. Após 10 minutos de incubação, a absorvância de cada poço foi lida a 490 nm utilizando um leitor de placas Biotek-ELISA (BioTek Instruments, Winooski, EUA). A concentração de BA inibir o crescimento celular em 50% (valor de IC50) foi calculada a partir de curvas de dose-resposta. Todas as determinações foram realizadas em triplicado.

alterações morfológicas

Para detectar alterações morfológicas que ocorreram durante a apoptose, coloração nuclear foi realizada usando uma coluna 5 ug /ml Hoechst 33258 (Sigma, St. Louis, MO , EUA) mancha, e as amostras foram visualizadas utilizando um microscópio de fluorescência Nikon (eclipse Ti-S, Nikon, Tokyo, Japão) [19].

análise de citometria de fluxo de apoptose celular

BA apoptose induzida foi observada por AnnexinV-FITC /coloração de PI (Beyotime Biotech, Pequim, China) de acordo com as instruções do fabricante. A citometria de fluxo (Partec citometria de fluxo, Alemanha) foi utilizado para analisar as diferenças na apoptose entre o controlo e tratados com BA (15 umol /L, 30 nmol /L e 50 nmol /L), as células às 48 horas pós tratamento. As células foram recolhidas e analisadas por contagem de células normais, as células apoptóticas em fase inicial, e as células apoptóticas /necróticas de fase tardia em três campos de visão do microscópio. A aquisição e análise de dados foram realizados utilizando software FloMax. As células foram processados ​​como descrito no protocolo do fabricante e analisadas em triplicado.

Preparação

Proteína de 2-DE

células Hela tratadas com 30 mmol /l de BA foram colhidas após 48 h de incubação. As células foram lavadas duas vezes com PBS arrefecido em gelo, em seguida, extraiu-se com tampão de lise contendo 7 mol /L de ureia, 2 mol /L-tioureia, 4% CHAPS, pH 3-10% 2 /4-7 tampão de IPG linear (GE Healthcare, EUA ), 20 mmol /L dithiothreilol (DTT, Sigma, EUA), 40 mmol /L de Tris (Sigma, EUA) e Mini cocktail inibidor da protease livre de EDTA completo (Roche, EUA). Após sonicating10 vezes durante 30 segundos com pausas de 30 s, num banho de gelo-água e, em seguida, incubando a 4 ° C durante 1 h, os lisados ​​celulares foram centrifugados a 14000 rpm durante 1 h a 4 ° C. As proteínas presentes no sobrenadante resultante foram quantificados de acordo com o Bio-Rad reagente de ensaio de proteína de acordo com o método de Bradford (Bio-Rad, Hercules, EUA) [19].

bidimensionais-electroforese em gel de

Os lisados ​​de proteína de célula (130 ug) foram misturados com uma solução de re-hidratação contendo 7 mol /L de ureia, 2 mol /L-tioureia, CHAPS a 2%, 0,5% tampão de IPG e 0,002% de azul de bromofenol e DTT até um volume final de 450 uL. Pré-fabricados 24 cm tiras de pH imobilizados (IPG gradiente, de pH 3-10, de pH 4-7, GE Healthcare) foram reidratadas durante 12 h a 30 V. A separação de uma Ettan IPGphor 3 (GE Healthcare, Alemanha) foi realizada com o seguintes parâmetros: 100 V durante 2 horas, a 200 V durante 1 h, a 500 V durante 1 h a 1000 V durante 1 h, e 8000 V durante 3 horas, seguido por um padrão de passo-and-hold de 8000 V durante 8 h. Após a focagem isoeléctrica, as tiras foram incubadas durante 15 min em solução de equilíbrio I (6 mol /L de ureia, 2% de SDS, 30% glicerol, 1% DTT, 0,002% de azul de bromofenol, 50 mmol /L de Tris-HCl, pH 8,8) e por mais 15 min em solução de equilíbrio II (1% DTT foi substituído com 2,5% de iodoacetamida). Subsequentemente, as tiras de IPG foram transferidas para o topo de geles de poliacrilamida e incorporado utilizando 0,5% (w /v) de solução de agarose contendo azul de bromofenol. Bidimensional SDS-PAGE foi levada a cabo a 25 ° C e 3,5 W /gel durante 30 min e, em seguida, 17,5 W /gel durante 4 h 30 min até que a frente de azul de bromofenol corante chegou na parte inferior dos géis usando o Ettan DALT seis sistema (GE Healthcare). Os geles foram fixados numa mistura de 40% de etanol e 10% de ácido acético glacial durante a noite. As proteínas foram visualizadas por coloração de prata, e as imagens de gel foram adquiridos utilizando um ImageScanner (GE Healthcare) com imagem Mestre 2D Platinum Software Versão 7.0 (GE Healthcare). A fim de obter resultados fiáveis ​​a partir de 2-DE imagens, manchas foram bem resolvidos nos três réplicas biológicas. A medição foi levada a cabo para cada réplica biológica, e os volumes normalizados foram calculados utilizando o procedimento de normalização de volume total de mancha do software. foi assumido o volume normalizado de cada ponto para representar sua abundância expressão. Somente aqueles pontos que mudaram de forma consistente e significativa (mais de 1,5 vezes e

p Art 0,05). Foram selecionados para análise de espectrometria de massa

espectrometria de massa e classificação de proteínas

péptido MS e MS /MS foram realizadas num 5800 MALDI-TOF /TOF Além disso espectrómetro de massa ABI (Applied Biosystems, EUA). Os dados foram adquiridos em um refletor MS positiva usando um padrão CalMix5 para calibrar o instrumento (Mistura ABI5800 Calibração). Ambos os dados da MS e MS /MS foram integrados e processados ​​usando o software V3.6 GPS Explorer (Applied Biosystems, EUA) com os parâmetros por defeito. Baseado no combinado MS e MS /MS espectros, as proteínas foram com sucesso identificados com base na de 95% ou superior intervalo de confiança de sua pontuação no motor MASCOTE V2.3search (Matrix Ciência Ltd., Reino Unido), utilizando os seguintes parâmetros de pesquisa: NCBInr-humandatabase ; tripsina como a enzima de digestão; um perdido local de clivagem; modificações fixos de Carbamidomethyl (C); modificações parciais de acetilo (proteína N-terminal), Deamidated (NQ), Dioxidation (W), oxidação (M); 100 ppm para a tolerância precursor ion e 0,5 Da para a tolerância fragmento de íons.

Com base na classificação PANTHER (versão 7.2, https://www.pantherdb.org/), função molecular e processo biológico do correspondente identificado proteínas foram classificados [20]. A rede de interação proteína gerada com STRING (versão 9.05, https://string-db.org) revelou as ligações funcionais entre proteínas diferentes [21], [22].

Medição do estresse oxidativo

os níveis de intracelular ROS foram determinados utilizando um kit de ensaio de ROS (Beyotime Biotech, China) seguindo o protocolo do fabricante. As células foram colhidas após 48 h de 30 umol /L BA tratamento e, em seguida, lavada duas vezes com PBS e incubadas com DCFH-DA (10 umol /L) a 37 ° C durante 40 min numa câmara escura para análise por citometria de fluxo. Todas as determinações foram realizadas em triplicado.

Isolamento de ARN e análise de qRT-PCR

O ARN total foi isolado utilizando o reagente Trizol (Invitrogen, EUA). A transcrição reversa foi realizada utilizando um PrimeScriptTM transcriptase reversa (Takara, Tóquio, Japão), e transcritos foram então sujeitas a qRT-PCR usando um Kit de SYBR Green PCR Reagentes (Takara, Tóquio, Japão). Os ensaios quantitativos foram realizadas em triplicado utilizando 1 mL de ADNc (diluição 1:10) e um SYBR Green Master Mix (Takara, Tóquio, Japão) e analisados ​​utilizando um sistema de detecção de sequência ABI 7500 (Applied Biosystems, EUA). A amplificação de desidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH) foi usada como um controlo interno e para normalizar os dados. Os detalhes dos iniciadores utilizados são mostradas na Tabela 1 [23].

A análise estatística

Os dados são apresentados como a média ± desvio padrão (SD) de amostras em triplicado. A análise estatística foi realizada com software estatístico (SPSS versão 17.0). Os dados foram analisados ​​utilizando uma análise de variância (ANOVA) seguida por comparações múltiplas de Bonferroni. Um valor de

p Art 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

Efeito da BA sobre a proliferação e apoptose das células HeLa

células

HeLa foram. tratadas com diferentes concentrações (15 umol /L, 30 nmol /L, 50 nmol /L) de BA durante 24 h, 48 h e 72 h. A viabilidade celular mostrou uma diminuição geral com concentrações crescentes de BA na duração média do tratamento e como analisado por um ensaio de MTT (Fig. 1A). Este resultado sugere que a BA inibe a proliferação de células HeLa de uma maneira dose e dependente do tempo. A IC

50 era 30,42 ± 2,39 uM quando as células HeLa foram tratados com BA, durante 48 h.

(A) Efeito de BA em relação a células HeLa, tal como determinado pelo ensaio de MTT. As células foram tratadas com concentrações de BA (0 nmol /L, 15 nmol /L, 30 nmol /L, 50 nmol /L) durante o tempo indicado (24 h, 48 h, 72 h). Os valores para cada uma das concentrações testadas BA representam a média de três experiências, Dados são apresentados como média ± desvio padrão da média; **

p Art 0,01 em comparação com o grupo controle (0 mmol /L BA). (B) a Hoechst 33258-coloração de células HeLa tratadas com 15 nmol /L, 30 nmol /l de BA. As setas vermelhas indicam várias células apoptóticas com a condensação de cromatina normal.

Para determinar se a actividade anti-proliferativa induzida por BA em células HeLa foi mediada pela indução de apoptose, foram avaliados por exame morfológico de apoptose por microscopia de fluorescência e citometria de fluxo. Após o tratamento com 15 nmol /L e 30 pmol /l de BA durante 48 h, as células HeLa foram coradas com 5 ug /ml de Hoechst 33258 e visualizada utilizando microscopia de fluorescência. A morfologia típica da apoptose foi detectada em células HeLa tratadas com BA (Fig. 1B). Isto revelou que havia um aumento significativo na percentagem de células apoptóticas após o tratamento BA em comparação com as células de controlo. Além disso, BA causou apoptose dependente da dose, tal como indicado por annexinV-FITC /PI utilizando citometria de fluxo. A percentagem total de células apoptóticas foi de 20,53 ± 0,81% (13,45 ± 0,80% das células no início apoptóticas e 7,07 ± 0,51% das células tarde apoptóticos) e 38,56 ± 1,79% (30,92 ± 1,22% das células no início apoptóticas e 7,64 ± 0,53% de células apoptóticas tarde) para células tratadas com 30 pmol /L e 50 nmol /L de BA após 48 h, respectivamente (como mostrado na Fig. S1).

2-dE análise das diferenças na expressão da proteína induzida pela BA

Proteomics é uma plataforma poderosa para investigar a expressão da proteína e modificações em resposta às condições fisiológicas específicas em sistemas biológicos. Os proteomas de controle e /L células HeLa tratadas com BA 30 umole foram analisados ​​por 2-DE. Dois gradiente de gama tiras de IPG (pH 3-10 e 4-7) foram usadas como a primeira dimensão. padrões representativos de proteínas 2-ED na região pi de 3-10 mostraram que as proteínas focado principalmente na gama de pH 4,2-7,0 (Fig. 2A). Para separar ainda mais esse exemplo, gradientes de pH estreita-range (4-7) foram utilizados (Fig. 2B), o que nos permite aumentar tanto a carga de proteína nos géis ea resolução das proteínas nesse intervalo. As manchas de proteína com alterações mais de 1,5 vezes (

P

0,05) foram então sujeitas a identificação das proteínas por MALDI TOF /TOF-MS análise (Tabela S1). géis à base de IPG Um total de 18 spots de proteínas a partir da vasta gama 2D (pH 3-10) e 19 spots de proteínas de géis 2D baseados em IPG diminuir a distância (pH 4-7) apresentaram alterações reprodutíveis e estatisticamente significativas nas amostras tratadas com BA em comparação com amostras de controlo (fig. 2). Proteínas de todos os spots de proteínas foram identificados com sucesso por MS e MASCOTE pesquisas de banco de dados com alta confiança (Tabela 2). profiling proteína (pH 3-10) revelou 5 proteínas up-regulamentados e 13 proteínas regulada em células tratadas com BA. Além disso, os perfis de proteínas (pH 4-7) revelou uma proteína sobre-regulada e 18 proteínas sub-regulada em células tratadas com BA. Inesperadamente, havia apenas 1 proteína (gi4826760) na sobreposição entre o pH 3-10 géis (Ponto NO. 868) e pH 4-7 (Ponto NO. 626).

(A) 2-DE foi realizada com 130 ug de proteína utilizando 24 cm de pH de 3-10 tiras de IPG NL e 12,5% de SDS-PAGE. (B) 2-DE foi realizada com 130 ug de proteína utilizando 24 cm pH 4-7 NL tiras IPG e 15% de SDS-PAGE. Os géis foram visualizados por coloração de prata e analisados ​​com software da imagem Mestre.

categorias funcionais de proteínas diferencialmente expressos

Para classificar melhor as proteínas identificadas, duas categorias independentes de gene ontologias foram usadas para descrever a função dos produtos de genes: função molecular e os processos biológicos, como identificado pelo sistema de classificação Panther. Porque EEF (gi530425157, manchar 932) foi determinado a ser o mesmo que EEF2 (gi4503483, manchar 673) e GLOD4 (gi4929769, manchar 146) não foi identificado pelo sistema de classificação Panther 34 proteínas modificadas foram analisadas pelo software. As proteínas identificadas foram classificadas em 9 grupos com base em processos biológicos: processos metabólicos (31,90%), processos celulares (19,10%), organização componente celular ou biogênese (14,90%), processos de desenvolvimento (10,60%), localização (10,60%), regulação biológica (4,30%), resposta a estímulos (4,30%), processos organismais multicelulares (2,10%) e os processos do sistema imune (2,10%) (Fig. 3A). tratamento BA inibida proteína dobrar (spot 81, 655, 1109, 613, 981), que é importante para a biossíntese de proteínas. Além disso, a glicólise (spot 372), tradução (spot 673, 885) e splicing do mRNA (spot 868) estão envolvidos em processos metabólicos e foram regulados negativamente pela BA-tratamento. BA suprime a maioria dos processos biológicos para bloquear processos normais metabólicas, tais como processos celulares (spot 361, 128, 1087, 970, 823, 991, 842), processos de desenvolvimento (spot 361, 128, 1087, 970), localization (spot 120, 970, 991), as respostas ao estímulo (spot 81), os processos organismais multicelulares (ponto 81), e processos do sistema imune (ponto 81). De facto, algumas proteínas estão envolvidas em vários processos biológicos, e proteínas que foram envolvidos nos processos celulares também contribuiu para organização componente celular (ponto 361, 128, 1087, 970). De acordo com a sua função molecular, as proteínas moduladas foram classificados em 5 grupos: atividade catalítica (36,00%), atividade molécula estrutural (32,00%), de ligação (20,00%), atividade regulador de tradução (8,00%) e atividade antioxidante (4,00% ) (Fig. 3B). Na categoria de atividade catalítica, atividade dissulfeto isomerase proteica (manchar 655, 1109) e da atividade oxidorredutase (spot 542, 526, 1120, que estão na cadeia de transporte de elétrons mitocondrial) foram inibidos por tratamento BA. Simultaneamente, a atividade antioxidante (spot 542) também foi reduzida pelo tratamento BA. Além disso, a maioria das proteínas envolvidas na actividade molécula estrutural (spot 81, 361, 1085, 1087, 970), ligação (local 128, 573, 868) e a actividade do regulador de tradução (spot 673, 885) foram reduzidos significativamente em BA trataram células HeLa .

com base na classificação PANTHER e gene categoria, processo biológico (a) e função molecular (B) das proteínas identificadas correspondentes foram classificados.

a rede de interação de proteínas foi gerado por cordas, que oferece uma melhoria na análise funcional (Fig. 4). A rede de interação de proteínas fornece uma plataforma para analisar as funções das proteínas identificadas, as interações proteína-proteína, vias biológicas e funções moleculares. Consequentemente, quatro grandes redes foram gerados: (1) neurotrofina via de sinalização, (2) depressão a longo prazo, (3) cardiomiopatia arritmogênica do ventrículo direito, e (4) VEGF via de sinalização. MAP2K2 (ponto 942), YWHAB (spot 823) e YWHAE (spot 842) foram as proteínas centrais das redes que interagem, e os seus níveis foram reduzidos por tratamento BA, que pode desempenhar um papel importante na via de sinalização de neurotrofina. Das proteínas identificadas, as proteínas 14-3-3 estão envolvidas em muitas vias fisiológicas, e estas proteínas têm sido mostrados para ser responsável pela capacidade de crescimento e apoptose de muitos tumores malignos.

As proteínas modificadas de proteómica análise foram enviados para a ferramenta de string para identificar redes de sinalização funcionais. As ligações funcionais previstos consistem em até oito linhas:. Uma cor para cada tipo de prova

geração de ROS em células HeLa tratadas com BA

ROS desempenham um papel importante na indução de apoptose porque está envolvido na permeabilização da membrana mitocondrial e a indução de morte celular. De acordo com o perfil de proteínas das células tratadas com BA, UDP-glucose-6-desidrogenase (spot 526), ​​desidrogenase de 6-fosfogluconato (ponto 1120) e a enzima da peroxidase (spot 542) foram envolvidos no processo biológico de oxidase de resposta ao stress, que correlaciona com a apoptose induzida por BA das células HeLa. O nível de produção de ROS foi detectado após o tratamento das células HeLa com BA (15 umol /L, 30 nmol /L) durante 48 h. O nível de ROS nas células tratadas com BA aumentaram significativamente. O nível de ROS nas células tratadas com BA foi 9,28 vezes e 12,77 vezes superior ao nível de ROS nas células de controlo para os tratamentos de 15 nmol /L e 30 pmol /l, respectivamente, e uma tendência sobre-regulada foi observada ao longo da experiência (Fig. 5). Estes resultados sugerem que a BA induz a apoptose através da activação de mecanismos de morte celular ROS mediadas em células HeLa.

células HeLa foram tratados com 15 nmol /L, 30 nmol /l de BA durante 48 h e, em seguida, incubadas com 10 mmol /L de DCFH-DA, durante 40 min. A intensidade de fluorescência de DCFH foi medida por citometria de fluxo. (A) espectros real a partir de um experimento único representante. (B) A intensidade de fluorescência das células coradas foi determinada por citometria de fluxo. As colunas mostram os valores médios de três experiências (± desvio padrão). **

p Art 0,01 em comparação com o grupo controle (0 mmol /L BA)

análise de qRT-PCR de genes envolvidos na induzida por BA apoptose celular

.

Como 14-3-3 proteínas estão envolvidas em muitas vias fisiológicas, incluindo crescimento e apoptose, as alterações de expressão de dois genes que codificam a 14-3-3 família de proteínas identificadas foram seleccionados para posterior análise por qRT-PCR. A infra-regulação dos dois genes selecionados (

14-3-3β

e

14-3-3ε

) no nível de transcrição foi consistente com os dados de 2-DE. Os níveis de expressão

14-3-3β

e

14-3-3ε

foram significativamente regulada pelo tratamento BA. Genes

Bcl-2

e

Bax

foram investigadas para explorar ainda mais os papéis de acumulação de ROS na apoptose induzida por BA porque a via mitocondrial é regulada por prosurvival Bcl-2 e pró-apoptótica Bax. O nível de

foi observada Bcl-2

expressão a ser significativamente menor do que o nível de controle. Em contraste, a expressão de pró-apoptótica

Bax

foi significativamente aumentada em comparação com os controlos por qRT-PCR (Fig. 6).

células HeLa foram tratados com 30 nmol /L durante 24 h BA e, em seguida, o ARN total foi isolado utilizando o reagente Trizol um. As colunas mostram os valores médios de três experiências (± desvio padrão). *

p Art 0,05, **

p

. 0,01 em comparação com o grupo controle (0 mmol /L)

Discussão

BA, um triterpeno pentacíclico que ocorre naturalmente com o potencial para matar células de melanoma [1], tem sido demonstrado que induzem a apoptose em muitas linhas celulares de cancro [2] – [8]. BA tem sido relatada como sendo desprovido de efeitos citotóxicos contra células saudáveis. As células normais, tais como fibroblastos da derme, linfoblastos de sangue periférico [2], [14] melanócitos e astrócitos humano [15], têm sido mostrados para serem resistentes ao tratamento BA in vitro. Vários estudos têm fornecido recursos consideráveis ​​para a citotoxicidade induzida-BA. BA também suprimiu o crescimento tumoral in vivo num número de estudos com animais. Em um modelo de murganho de xenoenxerto de cancro do ovário administração de BA aumentaram significativamente o tempo de sobrevivência [25]. Schettino, M T aproveitou BA no tratamento de vírus do papiloma humano, que é considerado necessário para o desenvolvimento de cancro do colo do útero, os resultados sugerem BA pode ser uma das drogas promissoras para tratar o cancro do colo do útero [26]. O objetivo do presente estudo foi o de elucidar o mecanismo molecular (s) dos efeitos apoptóticos de BA em uma linha de células de câncer cervical (HeLa) e investigar os efeitos da BA sobre o crescimento de células HeLa.

para determinar a concentração apropriada de BA para as experiências de proteómica, células HeLa foram tratados com uma série de concentrações de BA durante 24 h, 48 h e 72 h, e, em seguida, a viabilidade celular foi medida por um ensaio de MTT e a taxa de apoptose foi analisada por fluxo citometria. O resultado revelou a BA inibe a proliferação de células HeLa de uma maneira dose e dependente do tempo, e o CI

50 era 25,93 ± 1,87 | iM durante 72 h, o que foi consistente com o CI

50 (26,0 ± 2.1 uM) de Rita C testado células HeLa expostos ao tratamento BA durante 72 h [24]. inibição significativa do crescimento e apoptose celular foram observados quando as células foram expostas a 30 umol /l de BA durante 48 h. Para cumprir com um padrão que a apoptose das células deve ser induzido, mas células vivas suficiente também deve ser mantida para extração de proteínas e proteômica estudo, 30 mmol /L BA foi escolhido para tratamento das células HeLa.

Proteomics oferece um método para a identificação de proteínas que medeiam a vias apoptóticas em células tratadas com agentes quimioterapêuticos [27] – [29]. Uma vez que o mecanismo molecular envolvido na indução da inibição da proliferação e apoptose pelo BA ainda não é claro, foi implementado um esquema de proteómica globalmente busca de proteínas expressas diferencialmente em células HeLa afectadas pela BA. A maioria das proteínas (30 pontos) foram diminuídas e algumas proteínas (6 pontos) foram amplificados pelo tratamento BA. análise da categoria funcional sugere que as alterações na expressão da proteína após o tratamento BA estão associados a diferentes processos biológicos e funções moleculares. Estes resultados sugerem que a apoptose induzida por BA de células HeLa baseia-se principalmente sobre a inibição de proteínas envolvidas na síntese e metabolismo.

Entre as proteínas de processos relacionados com quinze metabólicas, duas das proteínas sobre-regulada (HSPA5, 613 e detectar PLIN3, manchar 248) estão envolvidos na via do retículo endoplasmático (ER), que está envolvida em respostas apoptóticas complexos. A resposta ao stress ER pode promover a reparação celular e sobrevivência prolongada, reduzindo a carga de proteínas desdobradas por meio de atenuação global de síntese de proteína ou a sobre-regulação de chaperones, enzimas e componentes estruturais do ER [30]. Embora o mecanismo ainda não está claro, quando o estresse ER é esmagadora, as células sofrem apoptose [31]. A proteína regulada por glucose HSPA5 (spot 613), que é um acompanhante ER-residente, responde à via do ER através de uma rede de reguladores e novos mecanismos que conduzem à paragem do crescimento [32]. Carga, incluindo PLIN3 (spot 248), é translocado para o RE e é, em seguida, incorporado em pequenas transportadores vesiculares que medeiam o transporte de compartimentos de Golgi [33]. Outra proteína sobre-regulada é IL18 (ponto 27), uma citocina pró-inflamatória romance que induz a expressão do factor de necrose tumoral a (TNF-a), e ligando Fas, assim como a translocação nuclear do factor nuclear kB (NF-kB) [ ,,,0],34], [35]. NF-kB é um regulador chave da activação transcricional induzida por stress, e BA, também tem sido relatado para inibir a activação inflamatória do NF-kB [36]. No presente trabalho, foi detectada a expressão da proteína-regulada, o que pode mediar o processo de ER de BA em células HeLa.

Dois já foram regulamentados proteínas atividade antioxidante, UGDH (spot 526) e PGD (spot 1120) , catalisar a oxidação de álcoois C6 em ácidos carboxílicos em duas NAD sucessiva

+ – etapas dependentes sem a libertação de um aldeído intermediário, e estas proteínas são muito importantes para a cadeia de transferência de electrões nas mitocôndrias [37], [38]. Além disso, a proteína PRDX6 actividade antioxidante (spot 542) pode proporcionar protecção contra a tensão nitroxidative e reparação de moléculas oxidativamente danificados, e esta proteína desempenha um papel importante na limpeza de ROS em condições fisiológicas [39]. Ao mesmo tempo, o nível de produção de ROS detectada por citometria de fluxo foi aumentada após o tratamento de células HeLa com BA, e este resultado está em conformidade com os resultados dos ensaios de actividade de oxidoredutase anteriores e pode ajudar a explicar os efeitos apoptóticos de BA. Estes resultados indicam que a via mitocôndria foi activada por BA, que, em seguida, induzida apoptose das células HeLa. O stress oxidativo tem sido conhecido por ser um mediador de apoptose induzida por uma variedade de accionadores, e as mitocôndrias são considerados como sensores de dano oxidativo e pode desempenhar um papel importante na apoptose [40], [41]. A família Bcl-2 de proteínas podem regular a via mitocôndrias através da alteração permeabilização da membrana mitocondrial [42]. Anti-apoptótico Bcl-2 e Bax pró-apoptótica é muito importante para mediar a permeabilização da membrana mitocondrial externa e via de apoptose mitocondrial [43]. Nós descobrimos que o tratamento BA suprimida a expressão de

Bcl-2

transcrições, facilitou a expressão de

Bax

por qRT-PCR.