Abstract

terapia de gene adenoviral e onc�ise seria criticamente beneficiar da entrada de célula alvo de capsids geneticamente modificados. Isto requer tanto a ablação de tropismo adenovírus nativo e a identificação de ligandos que permanecer funcionais no contexto de vírus. Aqui, nós estabelecemos a entrada de tipo específico de células de vetores baseados em HAdV-5 pela inserção ligando genética em uma fibra quimérico com domínios eixo e botão de curto HAdV-41 fibra (Ad5T /41sSK). Este formato de fibra foi relatado para retirar transdução

in vitro Comprar e biodistribuição para o fígado

in vivo

. Mostra-se que o péptido YSA, de ligação ao marcador do EphA2 pan-cancro, pode ser inserido em três posições da fibra quimérico, resultando em forte transdução do EphA2-positivas mas não células EphA2-negativa de biópsias de melanoma humano e de xenoenxertos de tumor depois injecção intratumoral. Transdução foi bloqueada pelo peptídeo YSA solúvel e restaurado para células EphA2-negativo após a expressão do EphA2 recombinante. O peptídeo YSA também pode ser inserido em três posições de um carro de ligação-extirpadas HAdV-5 fibra permitindo transdução específica; no entanto, o formato /41sSK Ad5T foi superior

in vivo

. Em conclusão, podemos estabelecer um capsídeo adenovírus facilitar a inserção funcional dos peptídeos de segmentação e um adenovírus romance usando o EphA2 marcador tumoral como receptor com alto potencial para a terapia genética do cancro e onc�ise viral

Citation:. Behr M, Kaufmann JK, Ketzer P, Engelhardt S, Mück-Häusl M, Okun PM, et al. (2014) Adenoviruses Usando o marcador do cancro do EphA2 como um receptor in vitro e in vivo por inserção genética ligando em diferentes Cápside andaimes. PLoS ONE 9 (4): e95723. doi: 10.1371 /journal.pone.0095723

editor: Ilya Ulasov, Swedish Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 03 de dezembro de 2013; Aceito: 30 de março de 2014; Publicação: 23 de abril de 2014

Direitos de autor: © 2014 Behr et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela subvenção Helmholtz-Universidade Young Investigator Grupo VH NG 212 e do Deutsche Krebshilfe (Câncer Aid Alemão) concedem 10-7946. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Os adenovírus recombinantes (ADS) estão em desenvolvimento pré-clínico e clínico como agentes oncolytic e vetores para a vacinação e terapia genética [1], [2] .uch medicamentos à base de anúncios podem a beneficiar consideravelmente, ou até mesmo dependem um modo específico do tipo de célula de acção, a fim de limitar os efeitos secundários, enquanto retém potência terapêutica. Celular tipo especificidade de vetores e oncolíticos baseados em Ad tem sido bem estabelecida em nível de pós-entrada pela segmentação da transcrição e regulação microRNA [3], [4] .Em contrapartida, o alvo da entrada de célula do anúncio, que seria melhor evitar efeitos colaterais e sequestro de vírus, permanece um desafio. estratégias genéticas para a entrada segmentação de anúncios facilitar a produção grau clínico simples (sem modificações químicas ou adaptadores separados são necessários) e assegurar que as progênies anúncios oncolytic produzidas nos tumores dos pacientes mantêm as propriedades melhoradas. No entanto, as estratégias para a entrada genético segmentação dos anúncios são dificultadas pela estrutura do capsídeo Ad rígida, a incapacidade de moléculas de anticorpos, como porções de direccionamento preferenciais, para dobrar corretamente após a fusão com expressa cytosolically proteínas do capsídeo de anúncios, e as complexas interações de fatores do hospedeiro modulando Ad a entrada celular em doentes (ver abaixo)

entrada segmentação dos anúncios requer dois passos:. ablação de tropismo natural para as células saudáveis ​​e re-direccionamento de um receptor expresso especificamente em células alvo através da inserção de um ligando correspondente para o capsídeo anúncio. entrada de célula de anúncios nativos é iniciada através da ligação da fibra proteína do capsídeo ao receptor de apego, que é receptor Coxsackie-Ad (CAR) para o sorotipo mais amplamente utilizado HAdV-5 [5] internalização .Virus é então desencadeado pela ligação do base de Penton a integrinas celulares [6] .Para aplicações terapêuticas de anúncios não destinados para atingir tecido hepático, fígado de-segmentação é de importância fundamental para evitar efeitos secundários tóxicos. No entanto, a ablação CAR ligação por mutação a fibra não reduziram a transdução do fígado após a injeção do vírus sistêmica [7] supressão .Additional de integrina de ligação através da mutação da base pent� resultou na transdução do fígado reduzida em alguns, mas não todos os estudos [7] .Além disso, Penton mutações de base pode ser contraproducente no contexto da segmentação de anúncios, como passos de entrada de vírus e pós-entrada de vírus alvo re-pode ser comprometida [8] transdução .Liver por HAdV-5, independentemente da sua interação com CAR e integrinas, foi atribuída a fatores de coagulação do sangue ligados a hexon e fibra [9] – [11] .que receptor medeia transdução de hepatócitos por HAdV-5

in vivo

ainda está sendo discutido [12], [13]

.

a nossa abordagem para a entrada de segmentação de vírus HAdV-5-derivados é substituir os domínios do eixo da fibra e maçaneta com os correspondentes domínios do HAdV-41 fibras curtas (Ad5T /41sSK) e para inserir ligandos peptídicos para este cápside quimérico. HAdV-41 se liga carro através de uma segunda fibra longa, enquanto nenhuma actividade de ligação celular tem sido atribuída ao curto fibra. transdução correspondentemente, fortemente reduzida

in vitro

e transdução do fígado

in vivo

foram demonstradas por vários grupos de vetores baseados em HAdV-5 contendo fibras curtas de HAdV-41 ou do HAdV intimamente relacionado -40 [14] – [19] .que já demonstraram que a infecciosidade dos anúncios com Ad5T quimérico /fibra 41sSK (então denominado F5 /41s) pode ser restaurado pela inserção ligando peptídico genética utilizando a ligação RGD4C-peptídeo como um peptídeo modelo de integrina [14] .Em facto, foram identificados vários locais de inserção funcionais, estabelecendo, assim, a fibra Ad5T quimérico /41sSK como um andaime de fibra flexível para inserção do ligando: o HI e EG laços no lado do botão e para o circuito de IJ no seu topo , resultando numa elevada eficiência de transdução superior em comparação com as fusões C-terminais. No entanto, como as integrinas são ubiquamente expressas, o péptido RGD4C não era adequado para demonstrar o potencial de o formato Ad5T /41sSK para entrada de células específicas do tipo de célula e transdução. Portanto, o objetivo do presente estudo foi estabelecer a entrada nas células alvo pela estratégia Ad5T /41sSK usando um ligando peptídico celular selectiva e para comparar esta estratégia com uma abordagem visando à base de fibras HAdV-5.

A YSA péptido, um 12-mer identificados por apresentação de fagos, liga-se selectivamente ao receptor de quinase de tirosina do EphA2, mas quinases não relacionadas [20] .que focada nosso estudo sobre este ligando peptídico porque, em contraste com vários outros péptidos testados reteve cell- a actividade de ligação no contexto da fibra Ad. Importantemente, o EphA2 está a ganhar cada vez mais atenção como alvo para a terapia do cancro, porque é (i) regulado positivamente na maior parte dos tumores sólidos e no endotélio do tumor, (ii) mais acessíveis em tumores que muitas vezes não possuem ligandos associados a células, (iii) funcionalmente associado com o tumor progressão, e (iv) foi recentemente relatado para ser um marcador de células estaminais do cancro [21], [22] .Several EphA2-alvo modalidades terapêuticas têm mostrado prova de conceito, em estudos pré-clínicos, incluindo inibidores de cinase, anticorpos, imunotoxinas, engenharia células T, receptores solúveis e vacinas [22] – [24].

Aqui, nós investigamos entrada segmentação de anúncios

in vitro

e

in vivo

inserindo geneticamente o peptídeo YSA em diferentes suportes de fibra Ad receptores-cego de ligação EphA2. Especificamente, nós exploramos locais para inserção peptídeo YSA funcional nos domínios maçaneta da fibra curta HAdV-41 e da fibra HAdV-5. Para além da produção de vírus por superinfecção de transfecção /vírus fibra combinada como fizemos antes [14], nós investigamos engenharia directa de genes de fibras nos genomas de vírus, o que é de vantagem ou requeridas para facilidade de fabricação vírus e para oncólise virai, respectivamente . A selectividade e a eficiência da entrada de célula ad mediada pelo péptido YSA foi investigada em cultura de células, as metástases humanos biópsias, e modelos de xenoenxerto em animais comparando três formatos de fibras: (i) a fibra quimérico Ad5T /41sSK, (ii) uma fibra quimérico longo shafted contendo a cauda HAdV-5 fibra e domínios de eixo eo botão de fibra curta HAdV-41, e (iii) uma longa-shafted mas CAR de ligação ablated fibra HAdV-5.

resultados

transdução específico de células EphA2-positiva por anúncios com peptídeo YSA inserido em fibras quiméricas contendo a maçaneta da HAdV-41 fibras curtas de

Nós investigamos entrada segmentação dos anúncios pela inserção genética de um péptido alvo em fibras quiméricas com HAdV -41 botão como um andaime alvejado-de. Para este fim, inseriu-se o 12-mer péptido de ligação do EphA2 YSA [20] flanqueado por ligantes curtos para a HI, IJ ou EG ciclos deste domínio botão. Para explorar a relevância do comprimento do eixo na transdução Ad YSA mediada, que combinou estes YSA contendo botões com o eixo curto HAdV-41 fibra (vírus Ad5T /41sSK, Fig. 1A) ou o eixo de fibra longa HAdV-5 (Ad5TS /vírus 41sK, Fig. 1B). Num terceiro conjunto de fibras, que incorporou o eixo longo da fibra HAdV-5 com um proteoglicano de sulfato de heparina mutado (HSPG) liga�o ao motivo (Ad5TS * /vírus 41sK, a Fig. 1C). Esta mutação foi relatado para conferir uma melhor segmentação de-[17], [25], [26] .Após plasmídeo de transfecção, todas as construções foram expressas e possuíam uma capacidade de trimerização, mas trimerização foi claramente menos eficientes para as construções longas-sha, especialmente aqueles contendo o péptido no circuito de HI (Fig. 2A). Usando um protocolo de transfecção /superinfecção combinada (ver Materiais e Métodos), fomos capazes de produzir elevado título pseudotipados LacZ vectores repórter de anúncios com todos os formatos de fibra. Incorporação de moléculas de fibra em partículas virais foi eficiente para a fibra curta-shafted e, apesar de a capacidade de trimerização reduzida, para as longas-shafted fibras IJ-YSA (Fig. 2B). As fibras longas-shafted EG-YSA e HI-YSA mostrou reduzida ou faltava incorporação fibras em partículas virais, respectivamente.

(A) fibras quiméricas curto-shafted com a cauda HAdV-5 fundido com o eixo e botão de do HAdV-41 fibras curtas. (B, C) fibras longas-shafted quiméricos contendo a cauda HAdV-5 e do tipo selvagem (B) ou mutante eixo (C) fundido com o botão de fibras curtas de HAdV-41. (D) CAR ligação-ablated HAdV-5 fibras. locais de inserção peptídeo YSA são indicados por loops. A inserção da sequência de ligante em diferentes posições do botão de fibra circuito IJ HAdV-5 resultou na perda da capacidade de trimerização (dados não mostrados) e os vírus não foram produzidos para este local de inserção.

(A) imunotransferência de lisados ​​de células não fervidos após a transfecção transiente de expressão fibra de plasmídeos em células 293T. (B) Immunoblot de partículas virais purificadas de vírus repórter LacZ pseudotipado gerados pelo protocolo de transfecção /superinfecção. (C) Transdução de células EphA2-positivas e EphA2-negativa com vírus pseudotipados repórter LacZ. As células SK-MEL-28 foram transduzidas, em quadruplicado, todas as outras linhas celulares foram transduzidas em triplicado. Colunas e barras de erro mostram valores médios e desvios-padrão de atividade β-Gal, respectivamente. RLU, unidades de luminescência relativa; * P 0,05, ** p 0,01, *** p . 0,001 versus 5T41sSK na respectiva linha celular

Em seguida, analisou-se a expressão do EphA2 em um painel de células cancerígenas pancreáticas, células de melanoma , células endoteliais, e uma linha de células hepáticas. Detectamos forte expressão do EphA2 em células de cancro do pâncreas, células endoteliais, e para quatro de seis culturas de células de melanoma (Fig. S1). EphA2 não foi detectada para as duas linhas de células de melanoma SK-MEL-28 e Mel624 e a linha celular HepG2 hepática. experiências de transdução com linhas celulares EphA2 positivo PANC-1, MIA PaCa-2, Capan-1 (cancro do pâncreas) e C8161 (melanoma) produziu resultados que foram semelhantes para as respectivas linhas celulares: Todos os três vírus pseudotipado com a YSA curto-shafted fibras mostraram transdução, que foi substancialmente mais forte do que para os vírus de controlo sem péptido YSA (Fig 2C;. 10 vezes para aumento de 35 vezes na actividade de β-Gal). No caso de vírus não modificado com eixo HAdV-5, a inserção de YSA nas laçadas de IH, IJ e EG mostrou fraca, forte, e o intermediário da eficiência de transdução, respectivamente. O vírus IJ-YSA longo shafted foi mesmo superior ao dos vírus curtos-sha (p 0,05 para todas as linhas celulares.). Para todos os vírus com o eixo longo mutado, observou-se a transdução ineficiente (mostrado em células PANC-1 e C8161). Em células SK-MEL-28 EphA2-negativa, o vírus EG-YSA e especialmente o vírus da IJ-YSA com o eixo longo não modificado mostrou transdução significativamente maior do que os vírus de controlo. Conclui-se que os vírus curto-shafted Ad5T /41sSK com peptídeo YSA inseridos no EG, HI ou IJ loop de transdução selectivamente células tumorais EphA2-positivo, enquanto os Ad5TS longa shafted /41sK-IJ-YSA vírus mostrou ainda mais forte, mas transdução menos seletivas .

em seguida, investigamos como a eficiência de transdução de vírus YSA pseudotipados compara com vírus contendo o, peptídeo RGD de ligação de integrina estabelecido em células endoteliais do tumor e. A maioria dos estudos anteriores sobre a inserção ligando peptídico genético utilizado péptidos contendo RGD e demonstrou melhoria, mas não segmentada entrada de célula [27] – [29] .Indeed, HAdV-5 com vírus péptido RGD no circuito HI estão a ser investigados em estudos clínicos, por causa da sua maior eficiência a entrada nas células [30] .que encontramos que, no contexto da Ad5T /41sSK fibra quimérico YSA transdução mediada por péptido de células EphA2-positivo foi semelhante ou mesmo superior à transdução de mediado pelo péptido RGD4C inserido no HI ciclo (Fig. 3A e B), o local de inserção mais eficaz para este péptido [14] .Em células do EphA2-negativas SK-MEL-28, apenas o vírus de RGD resultou na transdução significativamente maior do que o vírus de controlo sem péptido. Finalmente, pudemos mostrar que a transdução de células EphA2-positiva por Ad5T /41sSK-HI-YSA e Ad5T /41sSK-IJ-YSA mas não Ad5T /41sSK-HI-RGD é bloqueado pelo peptídeo YSA solúvel, enquanto que um peptídeo de controle com sequência aleatória não bloqueiem a transdução (Fig. 3B). No geral, estes resultados demonstram potente YSA transdução mediada especificamente de células EphA2-positiva por anúncios com péptido YSA inserido no Ad5T quimérico /fibra 41sSK.

(A) Transdução das células do EphA2-positivas e negativas por o EphA2- vectores Ad pseudotipados contendo fibras curtas quiméricas-sha com inserção genética do péptido YSA em comparação com vectores correspondentes com inserção genética do péptido RGD4C. As células foram transduzidas em quadruplicado. (B) Transdução das células PANC-1-EphA2 positivo após a competição com o péptido YSA solúvel ou com o péptido de sequência aleatória de controlo. As células foram transduzidas com anúncios pseudotipados em triplicado. Colunas e barras de erro mostram valores médios e desvios-padrão de atividade β-Gal, respectivamente. RLU, unidades de luminescência relativa; *

/# p 0,05, **

/## p 0,01 *** p . 0,001 versus T5 /41sSK (*) ou T5 /41sSK-HI-RGD (

#)

transdução específica de células EphA2-positiva por anúncios com peptídeo YSA inseridas no CAR ligação-ablated HAdV-5 fibra

Para aplicações específicas, por exemplo, aqueles que exigem específico do tumor transferência de genes, mas não fígado-de segmentação (ver discussão), os anúncios com uma fibra à base de HAdV-5 pode ser suficiente ou vantajoso em comparação com vírus contendo fibras quiméricas mais amplamente modificados. Por esta razão e para comparar o nosso formato de fibra quimérico com um nativo, investigamos quais locais de inserção de permitir a incorporação genética do peptídeo YSA dentro do carro ligação-ablated HAdV-5 fibra botão KO1 (mutações S408E e P409A, Ref [31], A Fig. 1D). Verificou-se que o péptido YSA pode ser inserido na unidade de CD, EG e lacetes HI da capacidade de fibra de retenção de trimerização (um pouco menos eficaz para a espira CD) e a capacidade de incorporação em partículas virais geradas pelo protocolo de transfecção /superinfecção (Fig. 4A e B). Nós também explorado o loop IJ como uma posição de inserção possível para o ligando peptídico considerando a localização favorável sobre a parte superior do domínio de botão. No entanto, observou-se perda de trimerização da fibra após a inserção de um elemento de ligação nas posições H561 G560 /ou I564 /N565 (não mostrado). Anúncios pseudotipado com o péptido YSA inserido no EG, HI ou espira CD do botão KO1 mediada transdução eficiente de células EphA2-positivo, que foi de 8 vezes a 230 vezes superior ao Ad5KO1 vírus de controlo sem inserção de péptido (Figura 4C. ). O vírus Ad5KO-HI-YSA foi mais eficiente do que os vírus Ad5KO-EG-YSA e Ad5KO-CD-YSA em todas as linhas celulares testadas, bem como superior ao Ad5T /41sSK-EG-YSA. Além disso, o vírus Ad5KO-HI-YSA mostrou eficácia de transdução semelhante ou superior em comparação com o vírus Ad5WT, contendo o tipo selvagem fibra HAdV-5. Em células EphA2-negativo, nenhum dos vírus com o péptido YSA inseridos na fibra KO1 aumento da eficiência de transdução em comparação com o vírus parental (Fig. 4C), que demonstra a falta de transdução de fora do alvo. Em conclusão, a eficácia de transdução de anúncios com inserção péptido YSA na fibra HAdV-5 depende do local de inserção com a inserção HI mostrando a melhor eficiência de transdução e especificidade.

(A) de imunotransferência de lisados ​​de células não fervidos depois transfecção transiente de expressão fibra de plasmídeos em células 293T. (B) Immunoblot de partículas virais purificadas de vírus repórter LacZ pseudotipado. (C) Transdução de células EphA2-positivas e EphA2-negativa com vírus pseudotipados repórter LacZ. As células foram transduzidas em quadruplicado, colunas e barras de erro mostram valores médios e desvios-padrão de atividade β-Gal, respectivamente. RLU, unidades de luminescência relativa; *

/# p 0,05, **

/## p 0,01, ***

/### p 0,001 versus T5 /41sSK (*) ou 5KO1 (

#) .

transdução mediada pelo EphA2 de tumor e células endoteliais por genomically modificado de fibra de Anúncios

a seguir, desenvolvido vírus alvejado-EphA2 com fibras modificadas codificadas pelo seu genoma, em vez de pseudotipado por transfecção . Genomically vírus modificados simplificará os procedimentos de produção e facilitar a produção em larga escala de vírus. Além disso, a inserção genómica de fibra é necessário, no contexto de oncólise virai. No entanto, não é clara a forma como a substituição de fibra genómico afecta a produção de vírus infecciosos. Na verdade, um estudo anterior reportado defeitos de crescimento e /ou partículas defeituosas para vectores de Ad com o gene da fibra nativa substituído por um gene que codifica toda a curto HAdV-41 com inserções de fibra peptideo [32] tecnologia recombineering .Usando BAC, que clonado seis genomas de GFP primeira geração /Luc vírus repórter. Em três genomas da fibra HAdV-5 foi substituída por uma fibra YSA contendo representando cada um dos formatos de fibras (Ad5T /41sSK-IJ-YSA, Ad5TS /41sK-IJ-YSA e Ad5KO1-HI-YSA). Os outros três genomas representados os vírus controle Ad5T /41sSK, Ad5wt e Ad5KO1. Todos os vírus podem ser produzidos a título elevado e mostrou incorporação de fibra eficiente (Fig. 5A). Os resultados das experiências de transdução com estes vírus geneticamente modificados reproduzido aos obtidos com vírus pseudotipados produzidos pelo protocolo de transfecção /superinfecção, demonstrando que a inserção de fibra genómico foi bem sucedida (Figura 5B-D.): Em células EphA2-positivo cancro do pâncreas, células de melanoma e endotelial células, mais uma vez observado um aumento dramático na eficiência de transdução de YSA contendo vírus em comparação com os vírus controle do receptor-cego (15 vezes a 236 vezes). A inserção do péptido na fibra YSA KO1 resultou na maior aumento da eficiência de transdução. A fibra vírus quimérico IJ-YSA com eixo longo foi novamente um pouco mais forte do que o vírus correspondência com um eixo curto. De nota, vírus YSA resultou na transdução mais forte, mesmo em comparação com o vírus contendo o tipo selvagem HAdV-5 em células de fibra EphA2-positiva. Este foi o caso não só para as células fracamente transduzidas com vírus contendo a fibra de HAdV-5, isto é, as células C8161 (36 vezes a 220 vezes), mas também no EphA2- e [33], [34] CAR-células positiva MIA PaCa-2, PANC-1 e HUVEC. Em células SK-MEL-28 e HepG2 EphA2-negativos, Ad5T /41sSK-IJ-YSA e Ad5KO1-HI-YSA não mostrou aumento significativo na eficiência de transdução comparados com os respectivos controles sem inserção peptídeo, enquanto Ad5TS /41sK-IJ-YSA mais uma vez mostrou um pouco aumentado transdução. Visualização de expressão GFP confirmou que os anúncios com peptídeo YSA resultou na transdução de um aumento marcado das percentagens de células EphA2-positivos em comparação com os vírus controle sem peptídeo, como em comparação com Ad5wt (Fig. S2). Em células EphA2-negativos, a eficiência de transdução, determinado por este leia-out com base em GFP foi fortemente reduzida para Ad5T /41sSK-IJ-YSA, Ad5KO1-HI-YSA, Ad5T /41sSK e Ad5KO1 em comparação com Ad5wt, mas nem tanto para Ad5TS /41sK-IJ-YSA. Estes resultados confirmam que vírus Ad5T /41sSK-IJ-YSA e Ad5KO1-HI-YSA apresentam a melhor capacidade de segmentação de entrada para as células EphA2-positivo. De nota, a transdução de SK-MEL-28 de células por vírus YSA mas não por vírus de controlo sem inserção de péptido pode ser restaurada por superexpressão do EphA2 recombinante (Fig. 6, Fig. S3), demonstrando que o EphA2 medeia a entrada celular de YSA p�tido contendo vírus.

(A) Immunoblot de partículas virais purificadas gerados por inserção genómica de fibras recombinantes. (B-D) Transdução das células cancerosas EphA2-positivas (B), células EphA2-negativa (C) e células endoteliais EphA2-positivo (D) com vírus /repórter da GFP modificada genomicamente-Luc fibra. Células C8161 foram transduzidas, em triplicado, todas as outras linhas celulares foram transduzidas em quadruplicado. Colunas e barras de erro mostram valores médios e desvios-padrão de expressão Luc, respectivamente. RLU, unidades de luminescência relativa; *

/# p 0,05, **

/## p 0,01, ***

/### p 0,001 versus T5 /41sSK (*) ou 5KO1 (

#) .

SK-MEL-28 transfectadas com plasmídeo de expressão EphA2 (pcDNA-EphA2) ou plasmídeo de controlo (pcDNA) foram transduzidas com vírus /repórter GFP genomically modificado de fibra de Luc. As células foram transduzidas em quadruplicado, colunas e barras de erro mostram valores médios e desvios-padrão de expressão Luc, respectivamente. RLU, unidades de luminescência relativa; ** P 0,01, *** p 0,001 para comparações indicadas. Para a detecção de expressão do EphA2 de células transfectadas ver Fig. S3.

YSA transdução adenoviral de câncer e de melanoma xenotransplantes pancreáticas

mediada por peptídeo in vivo

Produção de preparações de elevado título de vírus modificado com capsídeo genomically permitiu-nos para realizar estudos em animais para explorar YSA transdução de adenovírus mediada por peptídeo

in vivo

. Para este fim, foram utilizados camundongos NOD-SCID com tumores de xenoenxerto subcutâneas de PANC-1 células de câncer de pâncreas ou C8161 células de melanoma. a expressão do EphA2

in vivo

foi verificada em ambos os modelos de tumor (Fig. S4). Em um primeiro experimento, foi injetado animais tendo PANC-1 ou C8161 tumores intratumoral (i.t.) com Ad5T /41sSK-IJ-YSA ou Ad5T /41sSK (Fig. 7A). Em ambos os modelos de tumor que observado transdução significativamente mais forte com Ad5T /41sSK-IJ-YSA (2,9 vezes para PANC-1 e 5,9 vezes para C8161), demonstrando que a transdução YSA-péptido-mediada é funcional

In vivo

. Em um segundo experimento foi injetado C8161 tumores i.t. com os anúncios YSA contendo representando cada um dos formatos de fibras (Ad5T /41sSK-IJ-YSA, Ad5TS /41sK-IJ-YSA e Ad5KO1-HI-YSA) ou com vírus de controlo (Fig. 7B). O aumento da transdução de Ad5T /41sSK-IJ-YSA contra Ad5T /41sSK foi confirmada. Ad5TS /41sK-IJ-YSA mostrou transdução pouco maior do que Ad5T /41sSK-IJ-YSA. Estes resultados estão de acordo com o

in vitro

resultados de transdução. No entanto, em contraste com o

in vitro

dados Ad5KO1 mostrou eficiência de transdução semelhantes do que Ad5wt após i.t. injeção em xenoenxertos C8161 revelando perda de de-alvo. Por conseguinte, o aumento na transdução por inserção YSA péptido foi menor (1,6 vezes), mas atingiram significância. Portanto, de- e re-segmentação dos anúncios para a entrada específica via EphA2 após i.t. injeção

in vivo

foi melhor implementado com o formato de fibra Ad5T /41sSK. No geral, estes resultados mostram que a entrada mediada por péptido alvo usando o Ad5T /formato de fibra 41sSK é funcional

In vivo

após i.t. injecção do vírus.

(A, B) 2 × 10

10 vp de vírus, Luc repórter modificada com fibra orientada-EphA2 /GFP e de controlo foram injectados intratumoralmente genomicamente em ratinhos NOD-SCID portadores de xenoenxertos de tumor ( n = 6 a 9 tumores por grupo). a expressão do gene repórter de luciferase em tumores foi quantificada 3 dias depois da injecção do vírus. Colunas e barras de erro mostram valores médios e desvios-padrão, respectivamente. RLU, unidades de luminescência relativa. * P 0,05 em relação T5 /41sSK,

# p 0,05 e

### p . 0,001 versus 5KO1

YSA transdução de adenovírus mediada por peptídeo em biópsias de metástases de melanoma humano

a seguir, investigou se os anúncios segmentados por EphA2 resultar em aumento da transdução não apenas em culturas de células de tumor monocamada e xenoenxertos de células tumorais, mas também no material tumoral recém-biópsia de pacientes. Estes representam substratos clinicamente mais relevantes em relação à fisiologia da célula tumoral e presença de microambiente do tumor. Biópsias de metástases de melanoma foram cortados em fatias de tecido que vivem imediatamente após a cirurgia e foram posteriormente transduzidas com, YSA contendo anúncios modificado por capsídeo genomically representando cada um dos formatos de fibra ou com vírus de controlo. a expressão do EphA2 em vivo foi detectado fatias de tecido de todas as biópsias obtidas a partir de 5 pacientes. No entanto, a expressão variou entre pacientes e foi mais fraca do que para culturas em monocamada (Fig. S5A). Isto era esperado como biópsias conter uma mistura de células, das quais apenas uma fracção são células tumorais. Observou-se mais forte a eficiência de transdução, tal como determinado por expressão da GFP para vírus com o péptido YSA e para o vírus de controlo com fibra nativa HAdV-5, confirmando transdução mediada YSA péptido (Fig. S5B). Como os sinais de GFP em fotografias 2D não quantitativamente representam eficiência de transdução, em parte devido à forma enrugada das fatias após a cultura de 3 dias, quantificou expressão de luciferase para essas fatias (Fig. 8A) e de biópsias de quatro pacientes adicionais (Fig. 8B-e, uma biópsia rendeu apenas fatias suficientes para a transdução com Ad5T /41sSK-IJ-YSA e Ad5T /41sSK). Note-se que as leituras de luciferase são elevados porque nós realizada transduções título elevado para permitir o monitoramento de expressão GFP. Observou-se significativamente aumentada transdução de Ad5T /41sSK-IJ-YSA comparação com Ad5T /41sSK em 5 de 5 biópsias (significância foi alcançada em 3 biópsias com 4.3- às diferenças 576 vezes, não nas biópsias restantes devido ao material limitado) . O aumento mais forte na transdução foi observada para a biópsia, que mostrou mais forte expressão do EphA2. Ad5TS /41sK-IJ-YSA mostrou transdução maior do que Ad5T /41sSK em 4 de 4 biópsias, mas foi inferior do que para Ad5T /41sSK-IJ-YSA em três de quatro biópsias, que estava em contraste com os resultados em culturas de monocamada. Finalmente, a transdução de melanoma vivendo fatias de tecido por Ad5KO1-HI-YSA foi fortemente aumentou em comparação com Ad5KO1 em 4 de 4 biópsias (2,1 vezes para 17,1 vezes, significativas em 2 biópsias). Estes resultados confirmam re-alvo transdução de adenovírus mediada pelo peptídeo YSA inserido para Ad5T /41sSK-IJ-YSA e Ad5KO1-HI-YSA também no material da biópsia do tumor clinicamente relevante.

(A-E) fatias de tecido vivo de metástases de melanoma a partir de 5 diferentes pacientes foram transduzidas com 10

10 vp /fatia de vírus modificado de fibra, Luc repórter alvo-EphA2 /GFP e controle genomically. O número de fatias transduzidas por vírus era dependente do tamanho da biópsia e foi n = 4 (A, B), n = 3 (C), n = 2 (D) e n = 5 (E). Expressão do gene repórter da luciferase foi quantificada 3 dias pós-transdução. Colunas (A-E) e barras de erro (A, B, C, E) mostram valores médios e desvios-padrão, respectivamente. RLU, unidades de luminescência relativa. *

/# p 0,05 em relação T5 /41sSK (*) ou 5KO1 (

#)

Discussão

Neste estudo nós estabelecemos célula tipo específico. entrada de célula anúncio pela inserção ligando peptídico funcional em um andaime de fibra quimérico alvejado-de contendo o eixo curto HAdV-41 fibra e botão (Ad5T /41sSK). Além disso, descrevem vectores Ad-entrada voltado para o EphA2 pan-cancro superfície marcador altamente relevante por inserção genómica do gene que codifica a fibra quimérico ou um carro-ablated ligação HAdV-5 com fibra ligando peptídico YSA. Transdução de células EphA2-positivos

In vitro

foi dramaticamente aumentada por inserção ligando peptídico para ambos os formatos de fibra (até 236 vezes), sublinhando a potência do péptido YSA para re-direccionamento de ligação celular e a entrada viral . Nós previamente identificado o EG, HI e IJ laçadas de Ad5T /41sSK como locais para inserção funcional do péptido RGD4C, que se liga a amplamente expressa as integrinas [14]. Aqui nós confirmaram a viabilidade desses locais de inserção utilizando o peptídeo YSA de ligação EphA2. Em contraste com o péptido RGD, que mostrou uma actividade superior no circuito HI, foi observada uma actividade semelhante em cada uma das três alças para o péptido YSA (Fig. 2), revelando que os locais de inserção afectar as interacções receptor-péptido diferente dependente do peptídeo . Com o péptido YSA, conseguimos demonstrar pela primeira vez que a fibra Ad5T /41sSK quimérico facilita a transdução de células de anúncios específicos do tipo utilizando um painel de células EphA2-positiva e negativa EphA2-(Figs. 2 e 5). Péptido competição e estudos de expressão do receptor recombinante provam claramente que a transdução é-péptido específico e mediada por o EphA2 (Figs. 3 e 6). Estes resultados estabelecem uma base racional para estudos futuros que deve explorar eventuais novos peptídeos ligantes são funcionais no andaime de fibra Ad5T /41sSK, permitindo a entrada do vírus alvo através de outros marcadores de superfície.

Nós demonstramos que a introdução das fibras modificadas em do genoma do vírus, substituindo assim a fibra nativa, é viável (Fig. 5), além de pseudotipagem através do protocolo de transfecção de dois passos /superinfecção, como também utilizado no nosso estudo anterior ([14], as Figs. 2-4). Observamos trimerização fibra eficiente, a produção de vírus e incorporação de fibras em partículas de vírus para os vírus genomically modificados com fibras T5 /41sSK (e fibras KO1, veja abaixo).