Abstract

Fundo

O câncer de pâncreas é uma doença muito agressiva com prognóstico sombrio; peculiar é o microambiente do tumor caracterizado por uma extensa estroma fibroso, o que favorece a progressão rápida do tumor. Nós anteriormente relatado que os pacientes com cancro pancreático, tem uma inclinação de Th2 selectiva do antigénio anti-carcinoembrionário (CEA) CD4

+ imunidade de células T, que se correlaciona com a presença predominante de uma GATA-3

+ infiltrado linfóide do tumor. Isto tem efeitos negativos em ambos imunidade anti-tumoral eficaz e mais favorecendo fibrinogênese. Objetivo deste estudo foi avaliar se a polarização Th2 da CEA específicos de CD4

+ T células de pacientes com câncer pancreático é estável ou pode ser revertida por imunomoduladores citocinas.

Metodologia /Principais Achados

o primeiro avaliou a influência da IL-12 e IL-27, como agentes únicos ou em associação, na polarização da

+ clones de células T CD4 Th2 específicas do CEA a partir de um paciente com câncer de pâncreas. Descobrimos que apenas a combinação de IL-12 e IL-27 modificado da polarização de efectores Th2 por tanto a redução de IL-5, GM-CSF e IL-13 e a indução da produção de IFN-γ, que durou após remoção de citocinas. Em segundo lugar, foi avaliado o efeito do tratamento combinado na CEA policlonal específico para CD4

+ células T em ensaios de re-estimulação de curto tempo. De acordo com os dados obtidos com os clones, verificou-se que o tratamento combinado funcionalmente modulada a polarização Th2 do CEA-específica CD4

+ T células e reforçada de pré-existente imunidade tipo Th1.

Conclusões /Significado

em conjunto, nossos resultados demonstram que as células antígeno tumoral específico Th2 CD4

+ T em câncer de pâncreas são dotados de plasticidade funcional. . Assim, as citocinas loco-regionais de entrega ou terapia-alvo com base em anticorpos ou moléculas de ligação dirigidas para o estroma tumoral pode melhorar a imunidade anti-tumoral e melhorar fibrose, sem toxicidade sistémica

citação: Tassi E, Braga H, R Longhi , Gavazzi F, Parmiani L, Di Carlo V, et al. (2009) O papel não redundante para a IL-12 e IL-27 na modulação Th2 Polarização da Carcinoembrionário antígeno específico células T CD4 de pâncreas pacientes com câncer. PLoS ONE 4 (10): e7234. doi: 10.1371 /journal.pone.0007234

editor: Derya Unutmaz, Faculdade de Medicina da Universidade de Nova Iorque, Estados Unidos da América

Recebido: 17 de julho de 2009; Aceito: 9 de setembro de 2009; Publicação: 02 de outubro de 2009

Direitos de autor: © 2009 Tassi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pela Comunidade Europeia (DC-THERA), o Ministério da Saúde italiano, o Ministério da Universidade italiana e da Investigação Científica e da Fundação rico (Projeto de Pesquisa do Câncer LDP Pâncreas). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O câncer de pâncreas (PC) é uma doença muito agressiva com prognóstico sombrio [1]. Peculiar é o microambiente do tumor, o qual consiste em fibroblastos, as células estreladas pancreáticas, células endoteliais, células do sistema imunológico e endócrino e espalhando perineural e acredita-se desempenhar um papel activo na progressão da doença e agressividade [2].

Recentemente [3], foi investigada a qualidade do anti-tumor respostas

+ de células CD4 T em pacientes de PC submetidos a ressecção cirúrgica, comparando-se o anti-carcinoembrionário (CEA) e anti-viral CD4

imunidade celular + T. Descobrimos que a imunidade celular anti-CEA CD4

+ T estava presente em um número significativamente menor de pacientes de PC em comparação com dadores normais. Mais importante ainda, enquanto que CD4

+ células T a partir de dadores normais produzido principalmente granulócitos factor de estimulação de colónias de macrófagos (GM-CSF) e o pró-inflamatória (

ie

, Th1) citoquinas interferão-γ (IFN-γ ), as células CD4

+ T dos pacientes produzidos principalmente interleucina (IL) -5 e IL-13, que demonstram uma inclinação no sentido de um anti-inflamatório (

ou seja

, Th2) tipo. Pelo contrário, a extensão da anti-viral CD4

+ imunidade de células T foi comparável entre os dois grupos e mostrou um tipo Th1. De acordo com a Th2 distorcer observado na circulação CEA CD4 + específico células

T, análise imuno-histoquímica de linfócitos infiltram no tumor mostrou um número significativamente maior de GATA-3

+ (Th2) em comparação com T-bet

+ (Th1), as células linfóides, suportando um Th2 também inclinar no local do tumor.

tem sido demonstrado que a fibrose, que é uma característica marcante em PC, está fortemente ligada ao desenvolvimento de respostas de Th2 através da activação por citocinas Th2 da síntese de colagénio por fibroblastos e concomitante redução da degradação do colagénio na ausência de citocinas Th1 [4]. Portanto, a presença de GATA-3

+ células linfóides, que observamos [3] no microambiente do tumor do pâncreas, pode ainda contribuir para a fibrose e tratamentos locais destinados a reduzir a presença de citocinas Th2 pode ser benéfica.

Entre os vários fatores que promovem CD4

+ T células polarização, citocinas têm um papel determinante [5]. IL-12, um produto de fagócitos e as células dendriticas em resposta à estimulação microbiana, tem um papel importante na promoção da polarização Th1 e na melhoria CD4

+ T proliferação das células [6]. Além disso, a IL-12 tem sido mostrado induzir reversão de Th2 polarização em células Th2 alérgeno-específicos humanos [7], [8] e, em sinergia com IL-18, para estimular a produção de IFN-γ de células mononucleares de sangue periférico (PBMC ) de pacientes com hanseníase virchowiana [9]. IL-27, um membro recentemente identificado da família da IL-12 [10], também estimula a proliferação e sinergiza com IL-12 no desencadear a produção de IFN-γ de ingénuo células CD4

+ T [10], [11]. Mais recentemente, demonstrou-se [12] que a IL-27 inibe a polarização de Th2 CD4 murino naïve

+ células T e suprime a produção de citocinas de Th2 a partir de

In vitro

células Th2 polarizadas.

no presente estudo, investigamos a possibilidade de reverter a polarização Th2 de

bona fide in vivo

ferrado CEA específicos de CD4

+ T células de pacientes PC usando IL-12 e IL-27 como imunomodulador agentes. Descobrimos que a presença de IL-27 sozinha foi suficiente para inibir a IL-5 e a secreção de IL-13, enquanto a IL-12 estimulou fortemente a produção de IFN-γ com efeitos menores na secreção de citocinas Th2; a combinação das duas citocinas induzida uma modulação funcional da polarização Th2.

Materiais e Métodos

Sujeitos e linhas celulares

de PBMC foram obtidas de dois pacientes PC (pt # 15 e pt # 43) e um dador saudável (ND # 11) de uma coorte de indivíduos em que previamente detectado anti-CEA células CD4

+ T [3]. Os pacientes foram tiradas antes da cirurgia e estadiamento da doença foi T3N1M0 em ambos os casos. O Comitê Institucional de Ética (Comitato Ético Fondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor, Istituto Scientifico Ospedale San Raffaele) aprovou o protocolo do estudo e consentimento informado por escrito foi obtido de todos os doadores antes de coleta de sangue. linhagens de células linfoblastóides transformadas com EBV (LCL) utilizadas e sua antígeno leucocitário humano (HLA) -DR tipo foram: SKP-LCL (β1 * 0405, * 1401; β3 * 02), estabelecidos em nosso laboratório de um doador saudável; BM21 (β1 * 1101; β3 * 0202) e Pitout (β1 * 0701; β4 * 0101), gentilmente cedido por K. Fleischhauer (Instituto Científico San Raffaele, de Milão). LCL foram cultivadas em meio RPMI 1640 (BioWhittaker) contendo 2 mM de L-glutamina, 100 unidades /ml de penicilina, 50 mg /ml de estreptomicina (BioWhittaker), e FCS a 10% (BioWhittaker).

Síntese de péptidos CEA

CEA

99-111, CEA

117-129, CEA

177-189 /355-367, CEA

425-437, CEA

568-582, e CEA

666-678 sequências foram sintetizados pelo método de fase sólida passo a passo tal como anteriormente descrito [13]; os péptidos foram liofilizadas, reconstituídas em DMSO (Sigma-Aldrich) a 10 mg /ml e diluiu-se em meio RPMI 1640, conforme necessário.

In vitro

propagação de células T CD4 +>

Polyclonal CEA

177-189 /355-367 específica CD4

+ células T de pt # 15, obtidos após 13 dias de cultura de curto prazo com o peptídeo específico e autólogos CD4

+ -depleted PBMC como células apresentadoras de antigénio (APC), foram clonadas por diluição limitante como descrito em [14]. Os clones foram cultivados em X-Vivo 15 (BioWhittaker) suplementado com 5% de soro inactivado por calor humano reunido (BioWhittaker), penicilina (100 U /ml; BioWhittaker), estreptomicina (50 mg /ml; BioWhittaker), e IL-2 (250 UI /ml; Proleukine, Novartis). Os clones foram re-estimulados a cada 15-21 dias com fito-hemaglutinina (PHA) (0,5 ug /ml; Sigma-Aldrich) e irradiada de PBMC alogénico

CD4

+ ensaio de estimulação clones de células T

CD4

+ células T (10

4 /poço) foram cultivadas em triplicado em 96-U placas de fundo na presença de LCL irradiado (5 × 10

4 /poço), ou irradiadas autólogo ou HLA-DRβ3 * 02 combinado PBMC (10

5 /poço) como APC pulsada com o CEA

177-189 /355-367 péptido (10 ug /ml), ou a proteína de ACE purificado (30 ug /ml, BiosPacific), ou IgG humano normal (30 ug /ml, Venimmun N, Aventis Behring), como controlo negativo. Em experiências de inibição, foram utilizados os seguintes anticorpos monoclonais (mAbs) (Beckton Dickinson): anti-HLA-DR (100 ng /ml), anti-HLA-DP (3 ug /ml) e anti-HLA-DQ (125 ng /ml). Em experiências de titulação de péptidos, foram adicionadas as seguintes concentrações de peptídeo: 20-10-5-1-0,5-0,1-0,05-0,01 e 0005 ug /ml. Nas experiências com citoquinas imunomoduladoras, IL-12 recombinante humana e /ou IL-27 (R D Systems, Inc.) foram adicionadas nas seguintes concentrações: IL-12, como agente único (5-20 ng /ml); IL-27, como agente único (0,01-1-10-100 ng /ml); combinada de IL-12 e tratamento com IL-27 (5 ng /ml + 100 ng /ml, respectivamente). Após 48 h, o sobrenadante de cada poço foi removido e agrupado para efeitos de citocinas ‘de detecção por ELISA, de acordo com as instruções dos fabricantes: GM-CSF (limiar de sensibilidade: 31,25 pg /mL) e factor de crescimento transformante -β1 (TGF) ( limiar de sensibilidade: 62,5 pg /ml) (Biosource International, Inc.); IFN-γ, IL-5 e IL-13 (limiar de sensibilidade: 15,6 pg /ml) (Mabtech) e IL-17 (eBioscience) (limiar de sensibilidade: 7,8 pg /ml). IFN-γ, factor de necrose tumoral (TNF) -α, IL-10, IL-4, IL-5 e a libertação de IL-2 foi também determinada usando a matriz de citometria de grânulos (CBA) Human Th1-Th2 Kit (limiar de sensibilidade :. 20 pg /ml), (Becton Dickinson), seguindo as instruções do fabricante

Curto prazo cultura e liberação de citocinas ensaio

purificada CD4

+ células T foram estimuladas uma vez

in vitro na presença dos péptidos de CEA tal como previamente descrito [3]. + células T Resumidamente, CD4

(3 × 10

4 /poço), purificado a partir de total de PBMC por esférulas magnéticas (Miltenyi Biotec), foram plaqueadas em placas de 96 poços em cinco réplicas para cada condição e cultivadas em X -VIVO 15 suplementado com penicilina (100 U /ml), estreptomicina (50 mg /ml) e 3% de soro inactivado por calor humano reunido (meio de cultura de tecidos, o TCM), na presença de irradiado CD4

+ – PBMC esgotadas como APC, a um CD4

+: relação APC de 01:03. Os estímulos foram: PHA (10 ug /ml; Sigma-Aldrich), como controlo positivo; CD4

+ células T na presença de APC apenas, como de linha de base (em branco); e cada péptido único (10 ug /ml). IL-12 recombinante humana (5 ng /ml) e IL-27 (100 ng /ml) foram adicionados quando indicado. No dia 7, a meio de cada poço meio foi removido e substituído com o TCM fresco contendo IL-2 (25 UI /ml), e IL-12 e IL-27, onde indicado, sem qualquer outra estimulação com antigénio. No dia 14, o sobrenadante foi recolhido para o IFN-γ, IL-5, IL-13 e libertação de GM-CSF por ELISA, como descrito acima.

A citometria de fluxo

citofluorim�rica análises foram realizadas em um FACSCalibur e analisados ​​usando o software FlowJo (Árvore Star, Inc.). Foram utilizados os anticorpos seguintes: anti-CD3-APC, o anti-CD4-PerCP, anti-R4CC-PE, anti-CCR5-FITC (Pharmingen) e anti-CRTH2-PE (Miltenyi Biotec). TCRVβ expressão foi determinada com o kit IO Beta Test Mark (Immunotech), seguindo as instruções do fabricante.

Resultados

Caracterização da CEA

177-189 /355-367 específicas Th2-citocinas produzindo

+ clones de células T CD4

Nós relatado anteriormente que pacientes de PC têm um Th2 inclinar em anti-CEA CD4 imunidade

+ células T, mantendo um repertório intacta de células Th1 anti-virais [3 ]. Para caracterizar melhor a característica desta resposta anti-CEA que clonado, limitando CEA diluição

177-189 /355-367 policlonal específico CD4

+ T células de pt # 15, obtido após um

in vitro

de curto prazo re-estimulação das células T CD4

+ T células com APC autólogas pulsadas com o peptídeo relevante; um ensaio que anteriormente mostrou não favorecer

in vitro

priming [15]. células policlonal produzido altos níveis de IL-5 e muito pouco do GM-CSF, mas não IFN-γ [3], sugerindo a presença de

in vivo

preparado CD4

+ células T com características Th2. Dois clones foram obtidos, que expressou o mesmo receptor de células T cadeia (TCR) Vp,

ie of the Vβ17 (Fig. 1E), e, portanto, usamos-los indiferentemente nos seguintes experimentos sendo

bona fide

o mesmo clone.

Perfil de citocinas secretadas (a)

. CD4

+ células T foram cultivadas com APC irradiadas, na presença ou na ausência do péptido relevante num ensaio de estimulação de 2 dias e a concentração das citocinas indicadas nos sobrenadantes foi determinado quer pela CBA (painel superior) ou ELISA (painel inferior). Os dados são representativos de pelo menos seis experimentos; para ensaios de ELISA, os dados são meios de determinação em duplicado ± SD.

restrição de HLA (B)

. CD4

+ células T foram cultivadas com PBMC autólogas irradiadas ou HLA-DR combinados LCL, tal como indicado, na presença ou na ausência do péptido relevante (10 ug /ml) e na ausência ou na presença de anti-HLA -DR, anti-HLA-DP e HLA-DQ mAbs anti: depois de 2 dias de IL-5 foi testada. Painel superior:% de inibição foi calculada com base na secreção de IL-5 por células T CD4

+ células T na presença do péptido relevante (2 ng /ml mais de 0 ng /mL de nível de fundo). Os dados são representativos de dois (painel superior) e quatro (painel inferior) e as experiências são meios de determinação em duplicado ± DP. As respostas significativamente mais elevadas que os espaços em branco (

ie

, os níveis basais de secreção de citocinas a partir de células CD4

+ células T na presença de apenas LCL) são indicadas como: ***, p 0,001 (determinada pela não pareado, unilateral teste t de Student).

As curvas de dose-resposta (C)

. As células T CD4

+ T foram cultivadas com doses tituladas de o péptido relevante na presença de APC irradiados num ensaio de estimulação de 2 dias e testado quanto a IL-5 e IL-13 de libertação. Os dados são meios de determinação em duplicado ± SD.

O reconhecimento da

proteína nativa (D). CD4

+ T células foram cultivadas na presença de PBMC irradiado, como APC, pulsadas ou com o péptido relevante (10 ug /ml) como controlo positivo, ou a proteína de ACE purificado (30 ng /ml) ou IgG humano ( 30 ug /ml) como controlo negativo, em um ensaio de estimulação de 2 dias e testados quanto à libertação de IL-13. Os dados são meios de determinação em duplicado ± SD. As respostas significativamente mais elevadas do que os espaços em branco (

i.e.

, os níveis basais de secreção de citocinas a partir de células CD4 +

T na presença de apenas PBMC.) Estão indicadas como: **, 0,001 p 0,05; ***, P 0,001 (determinado por desemparelhado, de uma cauda teste t de Student).

expressão TCRVβ (E)

. O teste foi realizado com o kit de teste de IO Beta Mark. Quadrantes foram definidos com base na coloração de controlo de isotipo.

A expressão de superfície de Th2 (CRTH2 e CCR4) e Th1 (CCR5) marcadores (F)

. histogramas cheios representam controlos isotípicos; amostras histogramas abertas coradas com os marcadores indicados.

A caracterização do CEA

177-189 /355-367 específica CD4

+ clones T é mostrada na Figura 1. CD4

+ clones de células T produzidas, principalmente, IL-5, IL-13 e GM-CSF, enquanto que libertado baixa quantidade de IL-4 e IFN-γ e sem IL-2, TNF-α, TGF-β1, IL-10 ou IL-17 (Fig. 1A). Embora as células produzem pouca quantidade de IL-4, este padrão de secreção de citoquinas é consistente com uma polarização Th2.

Para identificar o elemento de restrição testadas primeiro o reconhecimento por células T CD4

+ células T do péptido carregado autólogo APC na ausência ou na presença de anti-HLA-DR, anti-HLA-DP e anti-HLA-DQ mAbs. Como mostrado na Fig. 1B (painel superior), a adição do mAb anti-DR inibida (65,5%) de IL-5 a produção por células T CD4 +

células T, demonstrando que uma molécula HLA-DR apresentou o péptido. Para identificar o alelo que apresenta HLA-DR, as células foram então estimuladas com o péptido relevante na presença de LCL que expressam diferentes combinações de HLA-DRβ1, p3 e p4 alelos expressos pelo paciente (indicado na Fig. 1B) e testados para IL-5 release. Como mostrado na Fig. + células T 1B (painel inferior), CD4

reconhecido o péptido em associação com HLA-DRβ3 * 02, que é o alelo partilhado entre o paciente e os dois apresentando LCL (BM21 e SKP).

Nós também realizada curva de titulação de péptidos em que as células T CD4

+ T foram desafiados com o aumento da concentração do péptido relevante (Fig. 1C). Os experimentos indicaram a expressão pelo clone de um TCR muito baixa afinidade.

Nós já mostrou que sequência CEA repetido nas posições 177-189 e 355-367 contém um

in vitro

epitopo naturalmente processados apresentado em associação com diversos alelos HLA-DR [16]. Para confirmar estes dados, os clones de células T CD4

+ T foram estimulados com a proteína de CEA ou IgG humano normal, como controlo negativo, e ensaiado para IL-13 de libertação. Como mostrado na Fig. 1D, CD4

+ células T especificamente produzida IL-13 na presença do péptido e, o mais importante, na presença de CEA mas não da proteína de controlo (

ie

, IgG humana), demonstrando que, embora CEA

177-189 /355-367 específica CD4

+ clones de células T levar um TCR baixa afinidade eles reconhecem o epitopo nativo.

Finalmente, para verificar se o perfil Th2 citocina correlacionados com os marcadores fenotípicos de células Th1 e Th2, os clones foram testados para a expressão de CCR5, que é preferencialmente expressa por células Th1 [17] e do CRTH2 e CCR4, cuja expressão caracteriza células Th2 [17], [18]. Como esperado a partir do perfil de citocinas, células CD4

+ T expressa na sua superfície tanto CRTH2 e CCR4 enquanto expressão de CCR5 foi ausente (Fig. 1F).

combinada de IL-27 e IL-12 inibe a secreção de tratamento de citocinas Th2 e estimula a produção de IFN-γ por

+ células T CD4 específicas CEA

Estamos próximos testaram a possibilidade de modular a polarização do CEA

177-189 /355-367 específica Th2 células por as citoquinas imunomoduladoras IL-27 e IL-12.

Para este objectivo foi avaliada em primeiro lugar o efeito de concentrações crescentes de IL-27 ou IL-12, como agentes isolados, na produção por células T CD4

+ células T de citoquinas Th1 e Th2, na presença do péptido relevante. A adição de IL-27 diminuiu em uma dose-dependente forma de IL-5 e IL-13, enquanto que não se observou qualquer efeito para a IL-4 e IFN-γ (Fig. 2A). A adição de IL-12 atingiram já o seu efeito plateau com a dose de 5 ng /ml (Fig. 2B): IL-5 a produção diminuiu também na presença de IL-12, enquanto, na diferença com IL-27, o efeito sobre IL-13 foi marginal como na produção de IL-4. Importante, e a diferença com a IL-27, a produção de IFN-γ foi fortemente aumentado (Fig. 2B). Estes dados demonstram que ambas as citocinas afectam a função efectora do CEA específicos de CD4

clones de células T + mas não de IL-27 ou IL-12, como agentes isolados, foram óptima na modulação da sua polarização Th.

(a).

+ T foram cultivadas com o péptido relevante e irradiada LCL como APC na presença de concentrações crescentes de IL-27 (0-0,1-1-10- 100 ng /ml); depois de 2 dias, a libertação de citoquinas foi avaliada pela CBA (IL-5 a IL-4 e IFN-γ) ou ELISA (IL-13). Os dados para IL-13 são meios de determinação em duplicado ± SD.

(B).

CD4

+ T células foram cultivadas e testados, como descrito acima, na presença de concentrações crescentes de IL-12 (0-5-20 ng /ml). O nível basal de secreção de citoquinas de células T CD4

+ células T na presença de LCL só foi subtraído dos valores de amostra e foi compreendida entre 0 e 0,018 ng /ml. Os dados são representativos de pelo menos três experiências.

Em segundo lugar, foi avaliado o efeito do tratamento combinado com as duas citocinas (Fig. 3). Quando utilizada a 5 ng /ml, IL-12, como um agente único, induzida% de inibição de IL-5 61 e não teve nenhum efeito na produção de IL-13 e GM-CSF, enquanto que a produção de IFN-γ teve um aumento de quase 10 vezes . IL-27 sozinha tratamento à concentração mais elevada mostrou 78%, 30% e% de inibição de IL-5, IL-13 e GM-CSF, respectivamente 53; enquanto apenas um aumento de 1,4 vezes na produção de IFN-γ. Quando utilizado em combinação com os melhores concentrações, foi observado um efeito sinérgico na inibição de IL-5 (91%) e IL-13 (48%), enquanto que, como esperado a partir dos resultados dos agentes individuais, a secreção de GM-CSF não foi ainda inibida e a produção de IFN-γ não foi ainda aumentada.

CD4

+ células T foram cultivadas com o péptido relevante na ausência (basal) ou na presença de IL-12 (5 ng /mL), como agente único; ou IL-27 (100 ng /mL), como agente único; ou combinado de IL-12 e IL-27 num ensaio de estimulação de 2 dias e, em seguida, testados quanto à libertação de citocina por CBA (IL-5 e IFN-γ) ou ELISA (IL-13 e GM-CSF). Os dados para a IL-13 e GM-CSF são meios de determinação em duplicado ± DP. O nível basal de secreção de citoquinas de células T CD4

+ células T na presença de LCL só foi subtraído dos valores de amostra e foi compreendida entre 0 e 0,006 ng /ml. Os dados são representativos de cinco experiências.

A modulação de polarização Th2 por IL-12 e IL-27 após a remoção dura citocinas

Para verificar se a modulação de polarização Th2 obtido pela tratamento combinado com IL-12 e IL-27 era estável, que desenvolveu um experimento em que a CEA específicos de CD4

+ células T foram estimuladas em primeiro lugar com o péptido relevante na ausência ou na presença de IL-12 e IL- 27 (5 e 100 ng /ml, respectivamente). Em segundo lugar, as células estimuladas na ausência de citocinas foram mantidas em cultura durante 14 dias em TCM mais IL-2 e utilizados como controlos. As células tratadas com as citocinas foram divididas em duas alíquotas e cultivadas sob condições diferentes para os 14 dias seguintes: em uma condição de as citocinas foram removidos após 2 dias e as células cultivadas como os controlos em TCM mais IL-2, nas outras citocinas Condições foram mantidas em cultura de todo o tempo e substituídas a cada dois a três dias. No dia 14, as células de cada uma das três condições foram testadas num ensaio de estimulação de 2 dias com o ptido relevante e libertação de citoquinas testadas. Os resultados obtidos são apresentados na Figura 4. As células de controlo confirmaram a produção de IL-5, IL-13 e sem IFN-γ, enquanto que as células mantidas em cultura contínua com as citocinas confirmados 98% e 74% de inibição de IL-5 e IL- 13 produção, respectivamente, e um aumento de 11 vezes para o IFN-γ. Importante, as células em que as citocinas foram removidos após 2 dias de cultura ainda mostrou 70% de inibição e 47% nos níveis de IL-5 e IL-13 da produção, respectivamente, e um aumento de 5 vezes na libertação de IFN-γ.

(A)

. CD4

+ células T foram cultivadas com o péptido em causa e para a esquerda não tratada (péptido) ou tratados durante 2 dias com o combinado de IL-12 (5 ng /ml) e IL-27 (100 ng /ml) e, em seguida, lavou-se e deixados sem tratamento (IL-12 + IL-27 (2-dias)) ou tratadas continuamente com IL-12 e IL-27 nas mesmas doses durante 2 semanas (IL-12 + IL-27 (14 dias)). No dia 14, as células foram testadas na presença ou na ausência do péptido relevante e a IL-5 específica, a IL-13 e IFN-γ libertação no sobrenadante testado por ELISA. Os dados são meios de determinação em duplicado ± SD. O nível basal de secreção de citocinas de células CD4 +

T na presença de LCL só foi subtraído dos valores de amostra e foi como se segue: IL-5 (0,093 ± 0,006 ng /mL), IL-13 (0,468 ± 0,028 ng /ml) e IFN-γ (0 ng /mL). Os dados são representativos de quatro experiências. (

B

). A expressão de superfície de CRTH2, CCR4 CCR5 por CD4

células + T após o tratamento com combinada IL-12 + IL-27. A análise foi realizada sobre as células tratadas durante 2 dias e, em seguida, deixada sem tratamento durante mais uma semana. histogramas cheios representam controlos isotípicos; histogramas amostras abertas coradas com os marcadores indicados.

Para verificar se o tratamento combinado também influenciado o fenótipo da superfície de Th2, CD4

+ células T, que tinham sido re-estimuladas na presença do citocinas durante 2 dias e, em seguida, cultivadas durante mais sete dias na ausência de citoquinas, foram testadas para a expressão de CRTH2, CCR4 e CCR5. Como mostrado na Figura 4B, as células, enquanto se mantém o CRTH2 e CCR4 como na ausência do tratamento (Fig. 1F), adquirida a expressão de CCR5.

Colectivamente, estes resultados mostram que a modulação de polarização do CEA Th2

+ clones de células T CD4 espec�icos obtidos com o tratamento combinado é duradouro, embora com reduzida eficiência, mesmo depois da remoção de citocinas e está associada com características funcionais e fenotípicas de Th0 ou ambas as células Th1 e Th2.

IL-12 e IL-27 aumenta a combinação de Th1 e Th2 modula polarização da espontânea anti-CEA CD4

+ respostas de células T

Para verificar o efeito do tratamento com IL-12 e IL-27 combinado com a polarização de

+ células específicas-CEA T CD4 em um ambiente mais fisiológico ea nível policlonal, CD4

+ T células de paciente (PT # 43) e dador normal (ND # 11) foram testados em um 14-dias

in vitro

ensaio de re-estimulação para o reconhecimento dos péptidos relevantes, na ausência ou na presença das duas citoquinas imunomoduladoras (Figura 5). Como relatado anteriormente em [3], na ausência das citoquinas imunomoduladoras CD4

+ T células de PT # 43 produziu IL-5 na presença de CEA

425-437; IL-13 na presença de CEA

568-582; GM-CSF na presença de CEA

568-582 e IFN-γ na presença de CEA

568-582 e, embora a um nível muito mais baixo, mas significativo, de CEA

177-189 /355 -367 (painel Fig. 5,

esquerdo

s, barras cinza

). A combinação de IL-12 e IL-27 quase aboliu IL-5 (99% de inibição) e IL-13 (76% de inibição), enquanto induzida

de novo

IFN-γ secreção na presença de CEA

425-437, melhorada (um aumento de 9 vezes) a produção de IFN-γ na presença de CEA

177-189 /355-367 e confirmou IFN-γ enquanto fortemente reduzida de IL-13 (98% de inibição) e GM- CSF (80% de inibição) de produção na presença de CEA

568-582 (painel Fig. 5,

esquerdo

s, barras pretas

). Como relatado anteriormente [3], na ausência das citoquinas imunomoduladoras CD4

+ T células de ND # 11 mostraram proliferação significativa [3] e muito pouca quantidade de secreção de IFN-γ na presença de CEA

99- 111, enquanto que qualquer produção significativa de IL-5 e GM-CSF foi observada na presença de qualquer péptido (Fig. 5,

painel da direita

s, barras cinzentas

). a libertação de IL-13 não foi testado. tratamento de citocinas fortemente aumentada (aumento de 23 vezes) a libertação de IFN-γ contra CEA

99-111, enquanto que, como esperado, nenhum efeito na produção de IL-5 e GM-CSF foi observada (Fig. 5,

direita painel

s, barras pretas

). Em ambos os casos, as duas citocinas induzida modulação de Th2 ou de amplificação de respostas Th1 que já estavam presentes, embora com um nível muito baixo, na ausência da combinação de citoquinas, enquanto não houve evidência de

de Novo-

o reconhecimento específico de péptidos de CEA.

CD4

+ T PT células de # 43 e # 11 ND foram cultivadas em cinco repetições, como descrito em Materiais e Métodos, com os péptidos de CEA que respondem, na ausência ( barras cinzentas) ou na presença (barras a preto) do tratamento combinado com IL-12 (5 ng /ml) mais IL-27 (100 ng /ml). Após 14 dias, IL-5, IL-13, GM-CSF e a libertação de IFN-γ foi testado por ELISA. Os dados reportados são meios de determinação em duplicado ± SD. As linhas tracejadas identificar o nível basal de secreção de citoquinas na presença de apenas APC. n.d. = Não determinado.

Em conjunto, estes resultados sugerem que a IL-12 e IL-27 promovem modulação funcional do tipo Th2 e amplificação do tipo Th1 respostas pré-existentes anti-CEA.

Discussão

no presente estudo, relatamos que a associação das citocinas imunomoduladoras IL-12 e IL-27 é capaz de modular a polarização funcional do anti-CEA Th2 CD4

células T + a partir de pacientes de PC e para melhorar + células pré-existente do tipo Th1 CD4 anti-CEA

T.

mostram que o tratamento com a IL-27 como um único agente inibido tanto a IL-5 e IL-13 liberação por células Th2 específicos de CEA. Isto confirma no sistema humano um relatório anterior que indicava IL-27 como capaz de suprimir Th2 na produção a partir de

in vitro

rato polarizada células Th2 [12]; mas, na diferença com este relatório, em nosso sistema em que lidamos com

bona fide in vivo

polarizada CD4

+ células T IL-27 não teve efeito sobre a secreção de IFN-γ. Importante, que também revelou uma nova função para a IL-27 que é a inibição da produção de GM-CSF. Quando a IL-12 foi usado como um agente único, é aumentada fortemente a produção de IFN-γ, enquanto teve apenas um efeito marginal na supressão da libertação de citoquinas de Th2, e de IL-13 em particular, e nenhum efeito sobre a GM-CSF. Esta é também a diferença com relatórios anteriores [7], [8], em que a IL-12 foi mostrado para reverter polarização de células Th2 específicas de alérgenos humano através da indução de IFN-γ e a inibição da produção de IL-4. Com efeito, no caso de os clones de IL-4, no entanto, que não foi produzido em quantidades elevadas, não foi inibida nem pela IL-27, nem IL-12. A única citoquina Th2 afectados por IL-12 foi de IL-5; Esta função também foi anteriormente relatado por clones de células T obtidos a partir do lavado broncoalveolar de pacientes com asma [19].

Colectivamente, que mostram que no nosso sistema de IL-12 e IL-27 têm papéis não redundantes na modulação da polarização de estabelecida CEA-específica de Th2 CD4

células + T e que a modulação da polarização funcional e fenotípica Th2 de anti-tumorais CD4

efectores + em um tipo Th0 foi obtido apenas na presença do tratamento sinérgico combinado com as duas citocinas. A modulação da produção das citocinas foi, pelo menos no caso dos clones, na maior parte funcional com a indução de um fenótipo peculiar onde R4CC, CRTH2 e expressão de CCR5 coexistiram (

ie

, não típico de Th1 ou seja células Th0). As experiências preliminares (dados não apresentados), no qual se avaliou a produção das citoquinas ao nível de células individuais por coloração intracelular, indicaram que:

i

) de IL-27 por si só não afectou a percentagem de IL-5 e IL-