Humana

Abstract

A colchicina, um produto natural da

Colchicum autumnae

actualmente utilizado para tratamento de gota, é um composto tubulina segmentação que inibe a formação de microtúbulos alvejando células de divisão rápida. Este estabelecimento de metas de tubulina tem investigadores da ligação para investigar o potencial de colchicina e análogos como possíveis terapias contra o câncer. Um grande estudo realizado em um análogo da allocolchicine, ZD 6126, foi interrompido em fase 2 ensaios clínicos devido à toxicidade cardio graves associados ao tratamento. Este estudo envolve o desenvolvimento e teste de novos análogos allocolchicine que possuem propriedades anti-câncer não-tóxicos. Atualmente, temos sintetizados e avaliados as atividades anti-câncer de dois análogos; N-acetil-O-methylcolchinol (NSC 51046 ou NCME), que é estruturalmente semelhante a ZD 6126, e (

S

) -3,8,9,10-tetramethoxyallocolchicine (verde 1), que é um novo derivado de allocolchicine que é isomérica em que o anel a. NSC 51046 verificou-se ser não-selectivos uma vez que a apoptose induzida em ambos os BxPC-3 e PANC-1, células de cancro do pâncreas e em fibroblastos humanos normais. Curiosamente, verificou-se que um verde foi capaz de induzir modestamente autofagia pró-morte nestas células de cancro do pâncreas e E6-1 células de leucemia mas não em fibroblastos humanos normais. Ao contrário de colchicina e NSC 51046, Verde 1 não parece afectar a polimerização da tubulina indicando que tem um alvo molecular diferente. Verdes 1 aumentou espécies reativas de oxigênio também causou (ROS) de produção em mitocôndrias isoladas a partir de células de câncer de pâncreas. Além disso,

In vivo

estudos revelaram que Green 1 foi bem tolerado em ratinhos. Nossos resultados sugerem que uma pequena mudança na estrutura de colchicina aparentemente mudou o mecanismo de ação e levar a melhor selectividade. Isso pode levar a tratamentos mais seletivos na terapia do câncer

Citation:. Larocque K, Ovadje P, Djurdjevic S, Mehdi M, Verde J, Pandey S (2014) Novel Analogue de colchicina Induz Seletiva Pro-Death Autophagy e necrose em células cancerosas humanas. PLoS ONE 9 (1): e87064. doi: 10.1371 /journal.pone.0087064

editor: Aamir Ahmad, Faculdade de Medicina da Wayne State University, Estados Unidos da América

Recebido: 22 de Agosto de 2013; Aceito: 19 de dezembro de 2013; Publicação: 23 de janeiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Larocque et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O Windsor e Seeds4Hope Grant da Fundação Centro de Câncer do Condado de Essex e um programa de NSERC Descoberta Grant. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Dr. Siyaram Pandey é um membro do conselho editorial PLOS ONE. No entanto, isso não altera a adesão dos autores para todas as políticas PLoS ONE em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

No Canadá, estima-se que 187, 600 pessoas serão diagnosticadas com câncer e 75, 500 pessoas morrerão de câncer em 2013 [1]. Do grande número de diferentes tipos de cancro, o cancro do pâncreas é um dos mais mortal, como é muito agressivo, resistente ao tratamento, progride rapidamente e tem uma falta de sintomas claros; portanto, ele é associado com mau prognóstico e diagnóstico fase tardia [2], [3]. Os tratamentos atuais disponíveis para o câncer de pâncreas incluem cirurgia, radioterapia e várias quimioterapias, incluindo 5-fluorouracil e gencitabina [4]. Infelizmente, a eficácia destas opções de tratamento não é de longa duração e que estão associados com efeitos secundários adversos graves, devido à segmentação não-selectiva das células não cancerosas [5]. Embora muito progresso tem sido feito em muitos tipos de câncer, casos de cancro do pâncreas e mortes ainda estão em ascensão [6]. É de grande importância que uma alternativa seletiva, mais seguro e não tóxico para opções atuais de tratamento é desenvolvido para aqueles que sofrem com câncer no pâncreas. A leucemia é um outro tipo letal de câncer que ocorre quando as células-tronco do sangue na medula óssea se desenvolvem em células anormais. Estima-se a ser diagnosticada em 5.800 canadenses em 2013, matando 2.600. Embora as opções de tratamento estão disponíveis, existe ainda uma necessidade de desenvolver uma alternativa mais eficaz e mais seguro.

De particular importância para a sobrevivência das células de cancro é a sua capacidade de evitar a morte celular programada (PCD). Especificamente, as células cancerosas são capazes de contornar a apoptose, tipo PCD I, envolvido na regulação homeostática e desenvolvimento. Apoptose age para evitar que as células danificadas e mutantes de proliferar e acumulando [7]. Autophagy, PCD tipo II, que é um processo catabólico que envolve a quebra de componentes celulares danificados e podem também fornecer a energia durante períodos de stress, também tem sido implicada na sobrevivência de células cancerosas. Este processo de quebrar componentes celulares danificados fornece as células com materiais que podem ser utilizados para gerar energia até que o estressor é removido [8], [9]. Devido a este processo, autofagia foi considerado apenas como um mecanismo de pró-sobrevivência; Recentemente, no entanto, os investigadores descobriram que a exposição contínua a factores de stress pode conduzir a autofagia prolongada e, subsequentemente, a morte das células [10], [11]. Devido a este duplo objectivo, há uma questão de saber se é mais benéfico para inibir ou induzir a autofagia, a fim de causar a morte de células cancerígenas, e os investigadores estão actualmente a explorar ambas as vias. Por último, a necrose é uma forma de morte celular patológica que é provocada por exposição a infecção, toxinas, traumatismo ou [12], [13]. Recentemente, verificou-se que a necrose, como apoptose, também podem ser programados e sua indução pode ser uma outra estratégia na terapia do cancro [14], [15]. Com a investigação sobre a indução de morte celular, os pesquisadores estão cada vez mais centrada em encontrar compostos e produtos, com alvos específicos de cancro, que pode levar à indução de programas de morte celular em células de cancro selectivamente, sem a indução de morte celular em células não-cancerosas, assim ignorando algumas das toxicidades associadas com terapias atuais contra o câncer.

a colchicina é um composto natural que pode ser isolado a partir de qualquer

Colchicum autumnale

(açafrão prado) ou

Gloriosa superba

( lírio glória), sendo que ambos pertencem à família do lírio [16]. A colchicina não é familiar para o mundo da medicina, uma vez que tem sido utilizado no tratamento da gota e tem sido investigada em muitas outras condições, incluindo febre mediterrânica familiar [17], cirrose [18] e síndrome de Sweet [19]. Mais recentemente, allocolchicines (derivados de colchicina) e outros análogos mostraram alguns efeitos estimulantes nas células cancerosas. Isto é principalmente devido à capacidade de parar a allocolchicine mitose através da inibição da polimerização da tubulina em microtúbulos [16], o que dificulta o progresso das células através do ciclo celular e conduz à indução de apoptose. Esta inibição da formação de microtúbulos é especialmente útil na terapia do cancro, porque as células cancerosas proliferam rapidamente e de forma incontrolável. Um derivado allocolchicine, ZD 6126, que é uma pró-droga de N-acetilcolchinol, tinha alguns resultados excitantes, como era capaz de interromper o citoesqueleto das células endoteliais de tumores e causar a apoptose (Fig. 1) [20], [21]. ZD 6126 causava necrose de células tumorais in

In vivo

modelos do rato do pulmão humano (Calu-6), colo-rectal (LoVo e HT-29), da próstata (PC-3), do ovário (SKOV-3), e mama (MDA-MB-231) tumores [22]. Infelizmente, este composto foi interrompido na fase 2 ensaios clínicos como um resultado de doenças cardio-toxicidade associada em seres humanos [23]. Não é surpreendente que esta derivados e outros derivados são tóxicos e porque tubulina microtúbulos são essenciais para o ciclo celular, não só em células cancerosas, mas também em células não-cancerosas; por conseguinte, este objectivo não selectiva é uma das razões pelas quais as células não-cancerosas são sensíveis à apoptose induzida por agentes de tubulina de segmentação, que conduz a os efeitos secundários observados [24].

Aqui relatamos a atividade anticancerígena de derivados sintéticos da allocolchicine; N-acetil-O-methylcolchinol (NSC 51046 ou NCME), que é estruturalmente semelhante a ZD 6126, e (

S

) -3,8,9,10-tetramethoxyallocolchicine (verde 1), que é um novo derivado de allocolchicine que é isomérica em que o anel a (Fig. 1). Neste estudo, são descritos os mecanismos diferenciais de dois derivados allocolchicine contra a leucemia e células de cancro do pâncreas causadas por ligeiras alterações da sua estrutura química. NSC 51046 claramente a apoptose induzida por não-selectiva nas células do cancro do pâncreas (PANC-1 e BxPC-3) e fibroblastos fetais não cancerosos (NFF), enquanto Verde 1 causou autofagia pró-morte e necrose selectivamente em células de cancro do pâncreas (PANC-1 ) e leucemia aguda das células T (Jurkat E6-1 ou), embora tendo pouco efeito sobre fibroblastos humanos não cancerosos (NHF). Além disso, ao contrário de colchicina, ZD 6126 e NSC 51046, Verde 1 não parecem ter como alvo tubulina e tem um alvo molecular diferente. É muito interessante que uma pequena mudança na estrutura de allocolchicine mudou o mecanismo de acção e de conduzir a uma melhor selectividade do cancro. Estes resultados podem levar ao desenvolvimento de melhores quimioterápicos, mais selectivos para o tratamento do câncer.

Materiais e Métodos

Cultura de Células

As linhas de células cancerosas humanas que foram utilizados neste estudo foram carcinoma epitelial pancreática (PANC-1; Cat. No. CRL-1469), adenocarcinoma do pâncreas (BxPC-3; Cat. No. CRL-1687) e leucemia de células T aguda, clone E6-1 (Jurkat; TIB-152 ), os quais foram todos adquiridos a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). As linhas de células normais utilizados neste estudo foram fibroblastos humanos normais (NHF; Cat. No. AG09309) e fibroblastos fetais normais (NFF; Cat. No. AG0443), que foram ambos adquiridos pelo Instituto Coriell for Medical Research, Camden, NJ . células PANC-1 foram cultivadas em meio de Dulbecco modificado de Eagle (Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA), suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), (Gibco BRL, Mississauga, ON, Canadá) e 10 mg /ml de gentamicina ( Gibco BRL, Mississauga, ON, Canadá). células BxPC-3 e Jurkat foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Sigma-Aldrich, ON, Canadá), suplementado com 10% FBS (Gibco BRL, Mississauga, ON, Canadá) e 10 mg /ml de gentamicina (Gibco BRL, Mississauga, ON, Canadá). NHF e células NFF foram cultivadas em meio essencial mínimo com Sais Equilibrados de Earle (MEM /EBSS), (Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA) suplementado com FBS a 15% não-aminoácidos essenciais (Gibco BRL, Mississauga, ON, Canadá) , e 10 mg /ml de gentamicina (Gibco BRL, Mississauga, ON, Canadá). Todas as linhas celulares foram cultivadas e mantidas em uma Forma Scientific CO

2 incubadora equipado com um filtro HEPA (Forma Scientific Inc., Marietta, Ohio) a 37 ° C, 95% de humidade e 5% de CO

2.

celular Tratamento

Allocolchicine derivados, N-acetil-O-methylcolchinol (NSC 51046) e (

S

) -3,8,9,10-tetramethoxyallocolchicine (verde 1) foram usados ​​como os compostos chave para este estudo [25]. As células foram tratadas com concentrações crescentes e durações de NSC 51046 e Verde 1, reconstituídos em dimetilsulfóxido (Me

2SO). Antes do tratamento, os compostos concentrou-se Stock foram ainda diluídas em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Além allocolchicine derivados, colchicina (Sigma-Aldrich, ON, Canadá) foi usada para comparar os efeitos dos derivados allocolchicine para a eficácia mecanicista já conhecido de colchicina. O paclitaxel (Sigma-Aldrich, ON, Canadá) e paraquato (PQ), (Sigma-Aldrich, ON, Canadá) foram utilizados como controlos positivos em vários experimentos.

avaliação da eficácia de um verde e NSC 51046

WST-1 de ensaio.

Para medir a viabilidade das células, WST-1 de corante ([2- (4-iodofenol) -3- (4-nitrofenil) -5- (2,4- dissulf) -2

H

-tetrazolium, foi utilizado Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha). Este corante é reduzido a formazano na presença de enzimas metabólicas, os quais são indicativos da actividade metabólica activa em células viáveis. A quantidade de formazano pode ser medida através da absorvância a 450 nm. Igual número de células foram semeadas em placas de 96 poços (PANC-1:4,000 células /poço; NHFs: 4000 células /cavidade), com um volume total de 100 uL. Após fixação, as células foram tratadas com concentrações crescentes de um verde ou NSC 51046. No ponto de tempo desejado, o corante de WST-1 foram adicionados a cada poço e incubou-se durante 4 horas a 37 ° C. Usando um Wallac Victor

3 ™ 1420 Multilabel Counter (PerkinElmer, Woodbridge, ON, Canadá), valores de absorvância foram medidas a 450 nm. Os valores de absorvância de células tratadas foram expressos como uma percentagem dos valores de absorvância do controlo.

ensaio de exclusão de azul de tripano.

Para quantificar a percentagem de células mortas, azul de tripano de células corante impermeável incubou-se as células tratadas com [26]. Uma mistura 01:01 de suspensão de células e corante azul de tripano (Sigma-Aldrich, ON, Canadá) foi pipetado para um hemacitómetro (Hausser Scientific, Horsham, PA) e o número de células (células mortas coradas células azuis e viáveis ​​permanecem não coradas) foram quantificadas manualmente. O número de células mortas foi expressa como uma percentagem do número total de células. Os resultados foram analisados ​​utilizando GraphPad Prism 6.0 e relatado como a média ± SD de dois experimentos independentes.

Hoechst Coloração

Para visualizar a morfologia nuclear e a indução de apoptose, Hoechst 33342 dye (Molecular Probes, Eugene, OR, EUA) foi utilizado para corar os núcleos. A seguir ao tratamento com qualquer um ou verde NSC 51046, as células foram incubadas com 10 uM do corante Hoechst 33342 durante 10 minutos a 37 ° C. As imagens foram obtidas usando uma Leica DM IRB invertido microscópio de fluorescência (Wetzlar, Alemanha), aumento de 400X.

anexina V Ensaio de Ligação

A fim de determinar se NSC 51046 e colchicina foram induzir a apoptose, uma foi utilizada anexina V ensaio de ligação. Após o tratamento, as células PANC-1 foram recolhidos, lavados em PBS e ressuspensas em 50 uL de tampão de ligação a Anexina V (HEPES 10 mM, NaCl 140 mM, CaCl 2,5 mM

2, pH 7,4). As células foram então incubadas com Anexina V-488 AlexaFluor Conjugado (01:20) (Invitrogen, Canadá), 10 uM de corante Hoechst 33342 (Molecular Probes, Eugene, OR, EUA) e iodeto de 1 ug /mL de propídio (Sigma-Aldrich, EM , Canada) durante 15 minutos a 37 ° C. As imagens foram tiradas pelo aumento de 400X usando o microscópio Leica DMI6000 fluorescente (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha) |

MDC Ensaio

Para detectar a autofagia, monodansylcadaverine (MDC;. Sigma-Aldrich, ON, Canada ) foi usado. MDC é incorporada vacúolos autofágicos, produzindo uma mancha ponteada que é observável através de microscopia de fluorescência. As células foram cultivadas sobre lamelas e, após incubação durante a noite, foram tratados com diferentes doses de Verde 1. Após o tratamento, as células foram incubadas com uma concentração final de 0,1 mM MDC (diluído em PBS) durante 35 minutos a 37 ° C. Para nova confirmação da perda da integridade da membrana celular e a indução de morte celular, as células foram contra-coradas com a membrana celular corante nuclear impermeável, iodeto de propídio a 1 ug /ml (Sigma-Aldrich, ON, Canadá) para confirmar a indução da morte celular. As imagens foram obtidas usando uma Leica DM IRB invertido microscópio de fluorescência (Wetzlar, Alemanha), aumento de 400X.

Cellular Lysate Preparação

Após o tratamento com períodos de tempo 5? M verdes 1 para o vário, as células foram recolhidos, lavados em PBS e incubados em tampão de 0,1% de NP40 (Tris HCl 20 mM, NaCl 100 mM, EDTA 5 mM) durante 25 minutos em gelo (vórtex a cada 5 minutos, durante 15 segundos). A amostra é então centrifugada a 3000 rpm durante 5 minutos a 4 ° C. O sobrenadante (contendo o material celular lisada) é armazenada a -20 ° C até à sua utilização.

Western Blot

As amostras de proteína foram separadas utilizando SDS-PAGE. proteínas a electroforese foram então transferidas para uma membrana de nitrocelulose e bloqueadas com 5% w /v de leite em TBST (Tris-tamponada salina com Tween-20) solução. As membranas foram então sondadas com anticorpos primários em 2% w /v de leite TBST durante a noite a 4 ° C durante associada a microtúbulos cadeia leve protein1 3 (LC3) produzidos em coelho (1:500) (Novus Biologicals, Cat. No. NB100- 2220, Littleton, CO, EUA); β-Actina produzidos em ratinhos (1:1000) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Cat No. SC-81178, CA, EUA.); Beclin-1 produzidos em coelho (1:1000) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Cat. No. sc-11427, CA, EUA). Após a incubação, as membranas foram lavadas em TBST e incubaram-se um anti-ratinho (1:2000) ou um anti-anticorpo secundário de coelho (1:2000) de peroxidase de rábano conjugada (Abcam, Cat No. ab6728 . Ab6802, Cambridge, MA , EUA) em 2% w /v de leite TBST durante 1 hora a temperatura ambiente. Após lavagens em TBST, as bandas foram visualizadas com o reagente de quimioluminescência aumentada (Sigma-Aldrich, ON, Canadá) e densitometria foi realizada utilizando o software ImageJ.

Ensaio de polimerização de tubulina

Para observar o efeito de allocolchicine foi utilizado derivados de polimerização da tubulina, um kit de ensaio de polimerização de tubulina (Citoesqueleto Inc. Cat. No. BK006P). Uma placa de 96 poços foi pré-aquecido a 37 ° C durante 30 minutos antes de se iniciar o ensaio. Os poços de controlo recebeu tampão de tubulina geral (80 mM de PIPES pH 6,9, MgCl 2 mM de

2, EGTA 0,5 mM), e as outras cavidades receberam tampão e tubulina geral quer Verde 1, NSC 51046 ou colchicina (Sigma-Aldrich, ON, Canadá). Todos os poços (incluindo o controlo) foram então incubadas com 3 mg /mL de tubulina em tampão de polimerização de tubulina (80 mM de PIPES pH 6,9, MgCl 2 mM de

2, EGTA 0,5 mM, GTP 1 mM e 10,2% glicerol). O OD

340 foi medida a cada minuto, durante uma hora. curvas de polimerização foram gerados utilizando o GraphPad Prism 6.0. Os resultados são representativos de três experiências independentes.

Isolamento mitocondrial e medição de espécies reativas de oxigênio (ROS)

Produção

As mitocôndrias foram isoladas a partir de células não tratadas PANC-1 para investigar o efeito de Green 1 no ROS produção e a possibilidade de as mitocôndrias como alvo de verde 1. as células foram primeiro lavadas duas vezes em PBS frio, ressuspenderam-se em tampão hipotónico (1 mM de EDTA, 5 mM de Tris-HCl, manitol 210 mM, sacarose 70 mM, 10 ^ M Leu- pep, 10 uM Pep-a, 100 uM de PMSF), homogeneizou-se, em seguida, centrifugadas a 3000 rpm durante 5 minutos a 4 ° C para sedimentar a fracção nuclear. O sobrenadante foi centrifugado a 12000 rpm durante 15 minutos a 4 ° C. O sobrenadante citosólico foi eliminado e o sedimento (contendo mitocôndrias) foi ressuspenso em tampão de reacção frio e tratou-se com 250 uM paraquato (PQ) como um controlo positivo, de 2,5 uM ou 1 Verde 10 uM colchicina. Amplex Red (Molecular Probes, Eugene, OR), juntamente com peroxidase de rábano foi usado para medir a produção de ROS mitocondrial. As mitocôndrias que foram isolados como acima mencionado foram ressuspensos em tampão hipotónico frio e 20 ug de proteína foram adicionados a cada poço de uma placa preta de 96 poços opaca. A fluorescência foi medido (Ex. 560 nm e Em. 590 nm) a cada 5 minutos durante 5 horas utilizando um espectrofluorímetro (SpectraMax Gêmeos XS, Molecular Devices, Sunnyvale, CA). As leituras foram analisados ​​utilizando GraphPad Prism 6.0 e expressa como unidades de fluorescência relativas (RFU) por micrograma de proteína e representam dados obtidos a partir de três experimentos independentes.

In Vivo

Avaliação da (

S

) -3,8,9,10-tetramethoxyallocolchicine (verde 1)

Todos os procedimentos envolvendo animais foram realizados de acordo com o Conselho canadense para orientações animal Care e aprovado pela Universidade de animal Care de Windsor Comissão. ratinhos CD-1 nu /nu macho com seis semanas de idade foram obtidos a partir de Charles River Laboratories e alojados em condições laboratoriais constantes de uma luz de 12 horas ciclo /escuro, em conformidade com os protocolos descritos em animais da Universidade de Windsor Research Ethics Board AUPP #: 10-17. Após aclimatação, os ratos foram divididos em dois grupos principais, um grupo foi injectado subcutaneamente no lado direito e traseiras esquerda flancos com Me

2SO em PBS (10 uL em 200 uL de PBS), enquanto que o segundo grupo recebeu injecções subcutâneas de verde 1 (10 mg /kg /dia para um volume total de 10 uL verde 1/200 ul de PBS) três vezes por semana durante um período de um mês. Para avaliar a toxicidade enquanto que os ratinhos estavam vivos, os pesos corporais foram medidos três vezes por semana durante a duração do estudo. Após o período de estudo, os animais foram sacrificados e os seus órgãos e tecidos (fígado, rins e coração) foram obtidos e armazenados em formol a 10% para análise imuno-histoquímica e toxicológico

Hematoxilina Eosina (H E) Coloração

órgãos dos ratos foram fixados em formol a 10%, após o que foram criosseccionada em 10 mm seções e colocado em um SuperFrost /Plus lâminas de microscópio (Fisherbrand, Fisher Scientific). Seções de órgãos foram coradas de acordo com um H padronizado E protocolo [27].

Análise Estatística

Os resultados são expressos como média (SD). A análise estatística foi realizada utilizando um teste ANOVA de 2 vias com o software GraphPad Prism 6.0.

Resultados

efeito dos derivados Allocolchicine sobre a viabilidade das células cancerosas

Para efeitos de neste estudo, a viabilidade das células de cancro do pâncreas (PANC-1) foi medido, após o tratamento com um ou verde NSC 51046, utilizando o ensaio de viabilidade celular WST-1. Após uma incubação de 4 horas com o corante de WST-1, a absorvância foi lida a 450 nm. Em paralelo, não cancerosas fibroblastos humanos normais (NHFs) foram utilizados como a contraparte celular normal neste estudo para determinar a selectividade dos compostos para as células cancerosas. Os nossos resultados mostram que tanto NSC 51046 e verde 1 foram capazes de reduzir a viabilidade das células PANC-1. No entanto, observou-se que um verde era selectiva para células cancerosas, como na viabilidade das células PANC-1 foi modestamente reduzidos enquanto a viabilidade de NHFs permaneceram inalterados. Por outro lado, o tratamento com NSC 51046 levou à redução da viabilidade de células tanto de cancro e não cancerosos (Fig. 2A). Além disso, um tratamento verde diminuiu a proliferação de células de leucemia de células T humanas e diminuição da integridade da membrana celular, tal como evidenciado pelo aumento de células positivas para o azul de tripano observados a seguir ao tratamento (Fig. 2B). Colectivamente, estes resultados indicam que Green 1 é selectivo para células de cancro.

(A), células de cancro pancreático (PANC-1) e fibroblastos humanos normais (NHFs) foram tratados com concentrações crescentes de um verde e NSC 51046 e após o tratamento nos pontos de tempo indicados, as células foram incubadas com corante de viabilidade de células WST-1 durante 4 horas. A absorvância foi lida a 450 nm e os resultados foram expressos como uma percentagem do controlo. Os valores são expressos como média ± SD de quadruplicado; (I) PANC-1 tratados com NSC 51046 (Interação entre cada concentração: **** p 0,0001; controle versus factor de coluna: **** p 0,0001); (Ii) NHF tratados com NSC 51046 (Interação entre cada concentração: **** p 0,0001; controle versus factor de coluna: **** p 0,0001); (Iii) PANC-1 tratados com verde 1 (Interação entre cada concentração: p = 0,9955; controle versus factor de coluna: **** p 0,0001); (Iv) NHF tratado com verde 1 (interacção entre cada concentração: p = 0,3642; controle versus factor de coluna: * p = 0,0370) (B) após o tratamento de células de leucemia de células T aguda humana (Jurkat) com Verde 1, um azul de tripano excluindo o ensaio foi realizado. As células foram coradas com a membrana celular de tripano de corante azul impermeável e o número de células positivas para o azul de tripano foram obtidos utilizando um hemocitómetro. Os resultados são expressos como percentagem de células positivas para o azul de tripano, indicando células mortas com membranas celulares não intacta. Os valores são expressos como média ± SD de dois experimentos independentes.

modos distintos de Indução Cell Death por derivados Allocolchicine

Para investigar o papel dos derivados allocolchicine na indução de morte celular em células cancerosas , os núcleos das células foram coradas com 10 | iM de corante Hoechst 33342 durante 10 minutos após o tratamento com qualquer um ou verde NSC 51046 para 48 ou 96 horas. Nas imagens resultantes (Fig. 3A), observou-se que o NSC 51046 tratamento conduziu a núcleos que exibiam morfologia apoptótica, incluindo a formação de bolhas de células, encolhimento e núcleos condensados ​​para ambos os tipos de células do cancro do pâncreas e os fibroblastos fetais normais não cancerosas (NFFs) , correspondendo aos dados de viabilidade. No entanto, o cancro e as células não-cancerosas tratadas com Verde 1 não apresentou esta morfologia apoptótica, o que sugere que um verde não induz a apoptose em células de cancro pancreático. A indução de apoptose pela NSC 51046 foi confirmada utilizando um ensaio de ligação de anexina V. Anexina V liga-se a fosfatidilserina exteriorizada, que é um marcador de apoptose precoce [28]. Nas imagens resultantes (Fig. 3B), verificou-se que o tratamento com ambas as doses de NSC 51046 chumbo para a externalização de fosfatidilserina, como mostrado pela coloração fluorescente verde. Além disso, observou-se também que o tratamento com colchicina induzida morte celular por apoptose, uma vez que levou a fragmentação nuclear, externalização de fosfatidilserina e morte celular. A falta de morfologia apoptótica e a redução da viabilidade das células de cancro do pâncreas tratados com Verde 1 levou-nos a investigar outros modos de morte celular. Após o tratamento, as células foram então incubadas com monodansylcadaverine (MDC) para determinar se houve indução autophagic. Observou-se a indução de autofagia em 48 horas em todas as células cancerígenas testadas, comparáveis ​​à indução autophagic por nosso controlo positivo para autofagia pró-sobrevivência, Tamoxifeno [10] (Fig. 4A). Além disso, a coloração com iodeto de propídio (PI) revelou que, ao contrário de Tamoxifeno, 1 células cancerosas tratadas verdes foram positivos para iodeto de propídio e exibiu uma forma pró-morte de autofagia (Fig. 4A). Esta actividade de verde 1 foi específica para as células cancerosas, como NHFs tratados com um verde não coraram positivo para a presença de vacúolos autofágicos com MDC ou morte celular necrótica com PI, confirmando a selectividade de um verde para células cancerosas. A fim de confirmar a indução de autofagia causada por Green 1, beclin-1 expressão e conversão LC3-I lc3-II foram avaliadas por análises de Western blot em células PANC-1 tratadas com 5,0 uM Verde 1 para vários intervalos de tempo (Fig. 4B). β-actina foi medida como um controlo de carga interna. A densitometria foi executada e amostras tratadas durante 3 horas e 6 foram comparados com o controlo precoce, ao passo que a amostra tratada durante 48 horas foi comparada com o controle de 48 horas. Os gráficos resultantes mostram que um tratamento verde causou um aumento nos níveis de beclin-1 em todos os pontos de tempo a seguir ao tratamento. níveis LC3-II foram moderadamente aumentada às 6 horas após o tratamento com verde 1.

A seguir ao tratamento com 1 células cancerosas verdes (A) pancreáticos (BxPC-3 e PANC-1) e humana normal e fibroblastos fetais ( NHFs e NFFs) foram incubadas com corante Hoechst 33342 para caracterizar a morfologia nuclear e detectar a indução de apoptose. Brilhantemente manchado, núcleos condensados ​​acompanhados de corpos apoptóticos são indicativas de apoptose. células (B) PANC-1 foram incubadas com Anexina V corante para verificar a indução da apoptose causada por NSC 51046. As células foram contrastadas com corante Hoechst 33342 e iodeto de propídio (PI) para visualizar a morfologia nuclear e da morte celular. As imagens mostradas são representativos de duas experiências independentes em 48 horas após o tratamento com NSC 51046 e colchicina.

(A) células de cancro do pâncreas, células humanas de leucemia (Jurkat) e NHFs foram incubadas com Monodansylcadaverine (MDC) para corar vacúolos autofágicos e iodeto de propídio (PI) para a morte celular para determinar se a indução autophagic levou à morte celular. , Coloração pontilhada brilhante é indicativo de autofagia, como pode ser visto no nosso controlo positivo (células tratadas com tamoxifeno). As imagens foram tiradas com aumento de 400x num microscópio de fluorescência. analisa (B) Western Blot de beclin-1 e expressão LC3 conversão foram conduzidos em células PANC-1 tratadas com 5,0 uM verdes 1 em vários pontos de tempo. β-actina foi medida como um controlo interno. As amostras tratadas durante 3 horas e 6 foram comparados com o controlo precoce, ao passo que a amostra tratada durante 48 horas foi comparada com o controle de 48 horas. Os resultados são expressos como média ± DP de duas experiências independentes para ambos os Western blots.

alvos intracelulares de verde 1 |

A colchicina e alguns dos seus derivados são conhecidas por induzir a apoptose em células cancerosas através da inibição da polimerização da tubulina e conduzindo a danos no ADN, que actua como um sinal para o início do processo de apoptose [29]. Ao observar os efeitos diferenciais de Green 1 e NSC 51046 na indução de morte celular, quisemos investigar mais os potenciais alvos intracelulares de Green 1, em comparação com NSC 51046 e colchicina. Em particular, foram avaliados os efeitos de colchicina e seus derivados sobre a polimerização da tubulina. Verde 1, NSC 51046 ou colchicina foram incubadas com tubulina purificada de cérebro porcino. O OD

340 foi medida a cada minuto durante uma hora e o gráfico resultante é apresentado na Figura 5A. Os nossos resultados indicam que o NSC 51046 induziu a inibição da tubulina ligeira com a dose mais baixa, o que corresponde a estudos anteriores [31], [32]; No entanto, observou-se que uma maior dose de NSC 51046 causado polimerização da tubulina rápida, que foi inesperado. Como esperado, a colchicina inibe a polimerização da tubulina. O tratamento com um verde em doses superiores levou a um pequeno aumento na polimerização da tubulina, enquanto que a dose mais baixa Verde 1 permaneceu relativamente perto da amostra de controlo (Fig. 5A). Isto confirma que Green 1 e NSC 51046 têm mecanismos bioquímicos distintos, como NSC 51046 alvos de polimerização de tubulina, em muito maior grau do que em verde 1. Estes resultados sugerem que um simples mudança nas estruturas destes análogos allocolchicine levou a muito diferentes actividades biológicas em células normais e cancerosas. derivados de colchicina

(a) (1 verdes e NSC 51046) foram incubadas com a tubulina porcino por uma hora numa placa de 96 poços. A absorvância (DO

340 nm) foi obtido a cada minuto durante a incubação de uma hora. A colchicina foi utilizado para comparação com os derivados. (B) mitocôndrias isoladas a partir de células PANC-1 foram tratados com um verde e a produção de ROS foi medida usando substrato Vermelho Amplex na presença de peroxidase de rábano (HRP). Os resultados foram comparados para controlar as mitocôndrias não tratadas, tratadas com colquicina mitocôndrias e controlo positivo, paraquato (PQ). As leituras de fluorescência foram tomadas em intervalos de 5 min durante 4 horas à Ex. 560 nm e Em.590 nm e expressa como unidades de fluorescência relativas (RFU).