Abstract

Fundo

Não muscular câncer de bexiga invasivo (NMIBC ) tem a mais elevada taxa de recorrência de qualquer malignidade e tantos como 70% dos pacientes experimentam recaída. metilação anormal do DNA está presente em todos os tumores da bexiga e pode ser detectada em amostras de urina. Estudos anteriores identificaram marcadores de metilação do DNA que apresentaram valor de diagnóstico significativo. Nós avaliamos a importância dos biomarcadores para detecção precoce de recorrência do tumor na urina.

Metodologia /Principais Achados

Os níveis de metilação de

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em amostras de urina foram medidos por PCR em tempo real (MethyLight). Foram analisados ​​390 sedimentos de urina de 184 pacientes diagnosticados com NMIBC. De urina de 35 indivíduos de controlo da mesma idade foi utilizado para determinar os níveis de linha de base de metilação. Recorrência foi diagnosticada por cistoscopia e verificado por histologia. Inicialmente, foram comparados urina de pacientes com cancro da bexiga e indivíduos saudáveis ​​e detectado hipermetilação significativa de todos os seis marcadores (P 0,0001) atingir a sensibilidade na gama de 82% -89% e especificidade na gama de 94% -100%. A seguir, validou a hipermetilação urinária para uso em vigilância recorrência e encontraram sensibilidade de 88-94% e especificidades de 43-67%.

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foram mais frequentemente metilado na urina de pacientes com tumores de grau superior (P≤0.08). Univariada Cox análise de regressão mostrou que cinco marcadores foram significativamente associados com a recorrência da doença;

HOXA9

(HR = 7,8, P = 0,006),

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(HR = 8,5, P = 0,001),

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(HR = 12,0, P = 0,015) ,

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(HR = 8,0, P = 0,001), e

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(HR = 13,9, P 0,001). Curiosamente, para um grupo de pacientes (n = 15) verificou-se que a hipermetilação foi consistentemente presente nas amostras de urina apesar da falta de recorrência dos tumores, indicando a presença de um defeito do campo.

Conclusão /Significado

níveis de metilação do

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em amostras de urina são promissores biomarcadores de diagnóstico para a vigilância recorrência do câncer de bexiga

Citation:. Reinert T, Borre M, Christiansen a, Hermann GG, Ørntoft TF, Dyrskjøt L (2012) diagnóstico de cancro de bexiga recorrência com base em níveis urinários de

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hipermetilação. PLoS ONE 7 (10): e46297. doi: 10.1371 /journal.pone.0046297

editor: Brock C. Christensen, Geisel School of Medicine, em Dartmouth, Estados Unidos da América

Recebido: 07 de junho de 2012; Aceito: 29 de agosto de 2012; Publicação: 03 de outubro de 2012

Direitos de autor: © Reinert et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo John e Birthe Meyer Foundation, o Conselho Dinamarquês para Pesquisa Independente, a Fundação Lundbeck, o Nordisk Foundation NOVO, uma subvenção da UE para UROMOL Consórcio não. 201.663, a Sociedade Dinamarquesa do Câncer, da Universidade de Aarhus, e do Ministério do Interior e da Saúde dinamarquês. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Cancro da bexiga urinária é a quinta neoplasia mais comum nos países industrializados. Em aproximadamente 75% de todos os casos, os pacientes apresentarão com fase Ta ou T1 não-muscular cancro da bexiga invasivo (NMIBC), enquanto que os restantes 25% dos tumores será músculo fase invasiva (T2-4 cancros CINM) [1] . Cerca de 60% -70% dos pacientes com recidiva de experiência NMIBC dentro de 3 anos após a ressecção [2], [3] e os pacientes podem desenvolver tumores recorrentes anualmente para muitos anos sem progressão da doença. No entanto, até 25% evoluirão para doença invasiva do músculo [4]. A alta taxa de recorrência e o risco de progressão solicitará a necessidade de vigilância freqüente e longo prazo, tornando o cancro da bexiga o câncer mais caro para o tratamento [5], [6]. Após a ressecção do tumor primário, os pacientes são frequentemente monitorados por cistoscopia e citologia. As biópsias tomadas durante cistoscopia são o padrão ouro para o diagnóstico de tumores de bexiga. A sensibilidade da cistoscopia para NMIBC está perto de 80% para cistoscopia luz branca, e 96% quando se utiliza o, cistoscopia guiada por fluorescência usando hexaminolevulinate mais caro (HAL). Para a detecção de displasia e carcinoma in situ (CIS), à sensibilidade de cistoscopia luz branca diminui para 48% e 68%, respectivamente; Considerando que a sensibilidade de cistoscopia usando HAL para estas lesões permanece na gama de 93% -95% [7] – [9]. Citologia é muitas vezes utilizado em combinação com cistoscopia, devido a uma alta especificidade de 99% (0,83-0,997; IC de 95%), mas com uma baixa sensibilidade de 34% (0,20-0,53; IC de 95%). A sensibilidade da citologia aumenta para tumores de fase alta e de alto grau, especialmente para tumores primários [10]. Foi proposto que um defeito no campo da bexiga pode estar causando a alta frequência de recorrências tumorais em doentes com cancro da bexiga [11]. Várias alterações moleculares têm sido mostrados para estar presente em áreas com aparência normal do urotélio em pacientes com cancro da bexiga [12], [13], e, recentemente, um defeito de campo epigenética foi descrito [14].

é a epigenética estudo da mitoticamente e /ou meioticamente mudanças hereditárias na expressão gênica que não podem ser explicadas por alterações na sequência de ADN [15]. metilação de ADN é um mecanismo epigenético bem estudado envolvido em processos normais tais como o desenvolvimento, impressão genómica, e X-chromosome inactivação [16] – [18]. Alterações na metilação do ADN têm sido associados com desordens patológicas diversas humanos, incluindo o cancro [19], e a inactivação da transcrição por hipermetilação aberrante é um mecanismo bem estabelecido para silenciamento de genes em cancros da bexiga [20] – [23]. Identificação de marcadores de metilação do DNA para detecção de cancro da bexiga está em curso há alguns anos. Vários estudos têm relatado altas sensibilidade e especificidade para estes marcadores, tornando-os potencialmente úteis como marcadores de diagnóstico para câncer de bexiga [24] – [31]. Em um estudo anterior que identificou uma série de marcadores de metilação do DNA (

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), que mostrou potencial diagnóstico valor em amostras de urina de pacientes BC [26].

Temos agora validou o valor diagnóstico e prognóstico destes biomarcadores em conjunto com anteriormente relatados

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[25] e

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[30] em amostras de urina. Inicialmente, para validar o significado dos marcadores de metilação seleccionados, e para determinar os valores de corte de marcador, comparou-se a primeira amostra de urina a partir de cada paciente com NMIBC a amostras de urina de indivíduos saudáveis. A seguir, avaliamos o valor diagnóstico e prognóstico dos marcadores para a detecção precoce de recorrência do tumor usando amostras de urina obtidas em posteriores visitas de acompanhamento.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes e protocolos de pesquisa foram aprovados pelos Comitês Região Dinamarca Central sobre Ética Biomédica Research.

paciente material

Um total de 652 amostras de urina foram coletadas anuladas no Departamento de Urologia do Hospital Universitário Aarhus a partir de 390 doentes com cancro da bexiga e 47 indivíduos com hiperplasia prostática ou da bexiga pedras benignos, mas sem história de cancro da bexiga (indivíduos de controle). Destes foram excluídos 227 amostras, porque a quantidade de ADN foi abaixo do nosso limite (Suppl. Tabela 1), que deixou 425 amostras (390 amostras de 184 pacientes aC e 35 de indivíduos controle) (Tabela 1 e Suppl. Figura 1). Dez a cinquenta mL de urina foram coletadas em visitas regulares de acompanhamento. As amostras de urina foram coletadas imediatamente antes cistoscopia; As células foram sedimentadas por centrifugação, e congelados a -80 ° C. Os tumores foram classificados de acordo com o sistema TNM [32] e classificados de acordo com Bergkvist [33]. Quinze dos indivíduos controle foram stix positivo para nitrito na urina indicando infecção bacteriana. o tratamento do paciente e acompanhamento foram realizados de acordo com as diretrizes da Associação Europeia de Urologia [34].

Extração de DNA e bissulfito Modificação

O DNA foi extraído com o vírus QIAsymphony /bactérias kit Midi (96) (Qiagen), utilizando o instrumento QIAsymphony® SP e empregando o protocolo Complex800_V5_DSP. Quinhentos ng de DNA foi modificado com bissulfito utilizando EZ-96 ADN D5004 metilação (Zymo Research) de acordo com as recomendações do fabricante e eluo em 60 ul de tampão de eluição e armazenado a -20 ° C até à sua utilização.

Real- A reacção de metilação específica quantitativa tempo-em Cadeia da polimerase (methyLight)

análise de metilação foi realizada utilizando methyLight [35]. Os iniciadores e sondas para os seis genes de interesse foram concebidos para incluir oito a dez dinucleótidos CpG (Supl. Tabela 2). Para a normalização das matérias à entrada DNA, usamos a repetição elemento de sequência ALU-C4 [36]. qPCR amplificações foram realizadas com o TaqMan Universal PCR master mix n AmpErase (Applied Biosystems) de acordo com as instruções do fabricante em duplicado usando 2 ul (5 ng) de ADN modificado com bissulfito num volume final de 5 ul em placas de 384 poços sobre um ABI 7900 HT rápido Tempo real PCR System (Applied Biosystems). Se duplicatas foram inconsistentes, uma réplica sendo positivo para a metilação e um negativo para metilação, a análise foi repetida. A amostra foi excluído em relação a esse marcador específico, se foi obtido um resultado inconsistente. protocolos de amplificação listados na Suppl. Tabela 2. Dados de amplificação foram analisados ​​por sistema de detecção de sequência (SDS 2.4, Applied Biosystems). Cada placa inclui uma diluição em série (25-0.04ng) de ADN totalmente metilado: CpGenome ™ Universal Methylated DNA) (Millipore) com o gene de interesse e ALU-C4, não há vários controles do molde poços (NTC), 5 nanogramas de um metilado amostra de controlo [CpGenome ™ Universal metilado DNA (Millipore)], e a amostra não metilado que consiste em DNA todo o genoma amplificado a partir de DNA de sangue periférico. A percentagem de referência metilado (PMR) foi calculada para cada amostra de acordo com a equação: 100 x [(valor de cópias do gene-X) da amostra /amostra (ALU-C4 valor cópia)] /[(valor de cópias do gene X) Universal Methylated DNA /(valor ALU-C4copy) Universal metilado DNA].

Análise estatística

Stata 11 (StataCorp, Texas, EUA) foi utilizado para todos os cálculos estatísticos. Bicaudais testes foram considerados estatisticamente significativos se P 0,05. diferenças de metilação foram avaliadas por teste não paramétrico de Wilcoxon-Mann-Whitney. O teste exato de Fisher foi utilizado para analisar variáveis ​​dicotômicas. Os US $ exata x ^ 2 $ teste foi utilizado para analisar as associações entre os parâmetros clínico-patológico com duas ou mais categorias. Correlações dos níveis de metilação dos marcadores foram calculados com coeficientes de correlação de Spearman. Uma curva ROC foi feita para cada marcador e combinações de marcadores através da representação gráfica da sensibilidade contra (1-especificidade) e a área sob a curva (AUC) foi calculada. testes de log-rank foram aplicados para avaliar a igualdade de sobrevivência e parcelas de sobrevivência de Kaplan-Meier foram usados ​​para visualização. A análise de regressão univariada de Cox foi utilizado para analisar as associações de idade, sexo, estágio, grau, multiplicidade e CIS com sobrevida livre de recidiva

Resultados

A nossa análise foi dividida em duas partes:. 1 ) para estabelecer o nível de corte dos marcadores de metilação e demonstrar a importância dos marcadores selecionados analisamos a primeira amostra de urina de cada paciente e comparadas para controlar amostras de urina de indivíduos saudáveis; 2) usando os níveis de marcador de corte determinados nós então validou o valor diagnóstico e prognóstico dos marcadores de metilação em amostras de urina recolhidas durante a fiscalização do paciente.

Estabelecimento de testar os níveis de corte e validação inicial de Marcador Significado

Inicialmente, definiram-se os níveis de corte por o nível de metilação média de cada marcador 2x + desvio padrão do nível de metilação em amostras de urina a partir de 35 indivíduos de controlo (apenas amostras com valores acima de zero de metilação foram incluídas). níveis de corte (valores da RMP – ver materiais e métodos) utilizados para dicotomizar os marcadores de metilação foram:

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= 0,348,

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= 0,077,

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= 0,371 ,

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= 0,405,

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0.368 e

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= 1,51. Outros níveis de corte (média + 1xSD e + 3xSD) com base em níveis de metilação em amostras de urina de controlo foram inicialmente considerado (resultados não mostrados). Para validar a relevância dos marcadores para diagnóstico de câncer de bexiga Nós comparamos a primeira amostra de urina de 184 pacientes diagnosticados com NMIB de amostras de urina de 35 indivíduos de controle (Tabela 1). Todos os seis marcadores eram altamente significativamente hiper-metilado na urina a partir de pacientes com NMIBC em comparação com a urina de indivíduos saudáveis ​​(Mann-Whitney, P 0,0001) (Tabela 2). Melhores sensibilidades dos marcadores foram observados quando se analisa amostras de urina de pacientes com um tumor incidente em comparação com a urina de pacientes com um tumor recorrente (Supl. Tabela 3). Não houve associação entre os marcadores individuais e estágio do tumor, mas

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,

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eram mais metilado no grau lesões III em comparação com grau I lesões (teste exato de Fisher, P≤0.048) (Suppl. Tabela 4).

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e

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eram menos metilado em tumores com um tamanho inferior a 3 cm. (Teste exato de Fisher, P≤0.047) (Suppl. Tabela 4).

Detecção de recorrências por metilação Marcadores

Nós validada a utilidade clínica dos marcadores de vigilância câncer de bexiga. Estratificamos nossa análise para incluir apenas os doentes que apresentaram inicialmente hipermetilação de um ou mais marcadores de metilação. Dependendo do marcador estudado, 11-18% dos doentes não apresentaram metilação no primeiro tumor e, portanto, não foi incluído. Isto restringiu a análise de 158 pacientes e 206 amostras de urina de as visitas de acompanhamento; 139 amostras de urina foram obtidas de pacientes com um tumor da bexiga recorrente e 67 amostras de urina foram obtidas de pacientes com nenhuma recorrência do tumor (Tabela 1). Empregando os pontos de corte determinados inicialmente usando a urina de indivíduos saudáveis; obteve-se sensibilidades na gama de 87% a 94%, e as especificidades na gama de 28% a 47% (Tabela 3). Em comparação, a sensibilidade da citologia foi de 77% e a especificidade de 60%. Nós observadas associações significativas entre os níveis de metilação e variáveis ​​clínico-patológicas para este grupo de pacientes com tumores recorrentes (Suppl. Tabela 5).

Os testes moleculares podem ter uma sensibilidade maior em relação ao cistoscopia padrão-ouro. Para abordar esta que, por conseguinte, utilizado cistoscopia resultados a partir de um período de 12 meses após a urina foi amostrada. Encontramos muitas das amostras anteriormente classificados como falsos positivos para ser verdadeiros positivos; eles simplesmente tinham um prazo de execução positiva em comparação com cistoscopia. A sensibilidade obtido variou de 88% a 94%, a especificidade e variou de 43% a 67% (Tabela 4). Incluindo tumores diagnosticados durante um período de acompanhamento de 12 meses e combinando dois marcadores com a exigência de que ambos os marcadores foram positivos para um teste positivo resultado a diminuição da sensibilidade (intervalo: 86-93%), enquanto a especificidade aumentada (intervalo: 50-73 %). Se apenas um dos dois marcadores devem ser positivo, o aumento da sensibilidade (intervalo: 92-98%), enquanto que a especificidade diminuída (intervalo: 29-60%) (.. Suppl Tabela 6 e Tabela 7 Supl, respectivamente). No geral, combinações de marcadores não melhorou a sensibilidade e especificidade dos testes.

valor prognóstico da metilação marcadores preditores Mais tarde Recorrências

Para abordar o valor prognóstico dos marcadores de metilação nós analisou as amostras de urina de pacientes com visitas onde há tumores foram diagnosticados usando cistoscopia. Para todos os marcadores descobrimos que um marcador positivo em uma visita tumor negativo foi significativamente associada com recorrência do tumor depois, durante 24 e 60 meses os períodos de acompanhamento (teste log-rank, P≤0.04) (Figura 1 e Suppl. Figura 3). Foram observadas as diferenças mais significativas na de 24 meses prazo para

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e

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(Log-Rank teste, P 0,0001), onde apenas 12% (3/25) e 8% (2/26) sem metilação experimentou uma reincidência no prazo de 2 anos, respectivamente. Para as amostras de metilação positivo o percentual de pacientes com recidiva mais tarde foi de 68% (21/31) para o

POU4F2

e 63% (20/32) para o

ZNF154

. Univariada Cox análise de regressão mostrou que

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(HR (95% CI) = 7,8 (1.8-33.7)),

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(HR (95% CI) = 8,5 (2,5-28,5) ),

TWIST1

(HR (95% CI) = 12,0 (1.6-88.6)),

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(HR (95% CI) = 8,0 (2.4-26.8)), e

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(HR (IC 95%) = 13,9 (3.3-59.7)) foram significativamente associados com a sobrevida livre de recorrência. Idade, sexo, fase anterior, grau anterior, multiplicidade anterior, e CIS anteriores não foram significativamente associados com sobrevida livre de recidiva (P 0,05). Por conseguinte, a presença de uma metilação de ADN alterada na urina parece estar fortemente relacionada com o prognóstico.

metilação de DNA está associada com recorrência do tumor subsequente dentro de 24 meses para os pacientes sem tumor, mas com as amostras de urina de metilação-positiva. Kaplan-Meier de sobrevida livre de recidiva em função dos níveis de metilação dicotomizados para

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(P = 0,0397) (A),

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(P = 0,0009) (B),

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(P 0,0001) (C),

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(P = 0,0017) (D),

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(P = 0,0001) (e), e

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(P 0,0001). (F)

identificação de pacientes com uma possível epigenética campo Defeito

Se a metilação dos biomarcadores limitou-se a células malignas, que só deve detectar os marcadores na urina quando um tumor estava presente, ou que ocorrem dentro de um futuro previsível, dependendo da taxa de crescimento do tumor. No entanto, os nossos resultados mostraram que mesmo os elevados níveis urinários de metilação pode estar presente em visitas sem recorrências (Supl Figura 2, os doentes C e D;. Suppl. Figura 3). Poderíamos identificar um grupo de 15 pacientes (31%) em que a metilação estava presente na urina na primeira visita e continuou a estar presente nas amostras de urina recolhidas em posteriores visitas de acompanhamento, embora nenhum tumor ocorreu. Como exemplo, um paciente metilação-positivos com a mais prolongada follow-up foi diagnosticado com CIS após 118 meses, mas não tinha lesões no meio. Os 15 pacientes com um defeito no campo, mas sem recorrência, tem um número significativamente menor de tumores em visitas anteriores (p = 0,02) em comparação com pacientes com recorrência da doença.

Modificado de Hermann GG et al. (https://skejby.net/Webudgaven/DaBlaCa2010.htm.).

Discussão

Neste estudo foi realizada uma validação independente de

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metilação para o diagnóstico urinária na vigilância câncer de bexiga. Obtivemos sensibilidades na faixa de 87% -93% e especificidades na faixa de 28% -47%. Quando incluindo tumores ressecados em um período de acompanhamento de 12 meses, obtivemos sensibilidade na faixa de 88% -94% e especificidades na faixa de 43% -67%. A análise de regressão univariada de Cox mostrou que os marcadores de metilação previu recorrências futuras com razões de risco no intervalo 7,8-13,9 (P≤0.015). etapa anterior, série, multiplicidade e CIS não foram significativamente associados com a recorrência do tumor. Curiosamente, também observamos que alguns pacientes com câncer de bexiga sem recidiva ainda manteve metilação urinária aberrante que os distinguia dos indivíduos controle. Nós acreditamos que isso pode ser causado por uma alteração epigenética geral bexiga mucosa.

Os controles utilizados neste estudo eram de pacientes com hiperplasia prostática benigna (BPH) ou pedras na bexiga e 43% dos controles foram nitrito positivo, indicando infecções da bexiga. Algumas das células na urina dos controlos podem ser provenientes do hiperplasia, ou podem ser células bacterianas ou imunológicos. amostras de controlo semelhantes foram aplicados quando os marcadores foram inicialmente investigadas como marcadores de cancro da bexiga, o que sugere que a frequência de metilação dos marcadores seleccionados é baixa nestes tipos de células [25], [26], [30]. Células da próstata ou a partir de uma infecção da bexiga ainda pode influenciar os resultados obtidos por diluição das células tumorais. Isso poderia levar a resultados falsos negativos. As infecções bacterianas são muito menos comuns e em nossas infecções do estudo não foram significativamente associados com o marcador de metilação, o que indica que as infecções não influenciou a sensibilidade marcador (Suppl. Tabela 4).

É de salientar que apenas 9% da recorrências são grau I. Portanto, as sensibilidades calculados dos marcadores pode ser maior em comparação com sensibilidades que seriam obtidos a partir de uma série consecutiva de pacientes de baixo risco, com um número muito maior de tumores de grau I

um dos. principais desafios usando marcadores urinários está recebendo células tumorais suficientes, e enquanto MethyLight é um método muito sensível, ainda tínhamos que exclui 227 (35%) amostras do estudo devido a quantidades insuficientes de DNA. Observou-se que, se incluiu amostras com menos de 5 ng de DNA como molde na análise, a sensibilidade diminuiu, e para pacientes sob vigilância a especificidade aumentada. Com a exclusão de pacientes com base na quantidade de ADN extraído das amostras de urina vertida, que mantêm a integridade do ensaio MethyLight no custo da introdução de um viés em que especialmente pacientes com tumores fase grau ta I são excluídos, como as lesões de grau I esfoliar a menor número de células [37] (teste exacto de Fisher, P 0,05) (Suppl. A Tabela 1). Recentemente, um estudo realizado por Zuiverloon et al. relataram um aumento na sensibilidade do

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mutação como um marcador para a recorrência do tumor de 75% a 100%, quando foi aumentado o volume de urina utilizado para o ensaio [38]. Ao aumentar o volume de urina colhida a partir das correntes de 10 a 50 mL, menos amostras terá que ser excluídos [39], [40]. Outras possibilidades para melhorar o ensaio para a detecção de metilação podem incluir análise de duas ou mais amostras separadamente ou usar outra tecnologia que Methylight (por exemplo Nested PCR).

O teste de marcador de metilação podem ser complementados por

FGFR3

análise de mutação.

FGFR3

mutações estão presentes em cerca de 70% -80% de baixo grau NMIBC, e mutações no

gene FGFR3

foram mostrados para ser detectável no DNA a partir de urina vertida [41], [42]. Semelhante à análise de metilação, o

FGFR3

análise baseia-se em DNA e a visita primária pode ser utilizada para estratificar para a presença da mutação. Estudos recentes com

FGFR3

mutações sozinho para detectar recorrências NMIBC relatam uma sensibilidade de 58% para as recorrências concomitantes. A sensibilidade aumentada quando 12 meses de follow-up foram incluídos [43]. A combinação de

FGFR3

mutações e marcadores de metilação foi testado pelo Serizawa et al., E observaram um aumento na sensibilidade de DNA a partir de urina anulada quando se combina marcadores de metilação e

FGFR3

mutações [44 ]. Vale ressaltar que eles observaram uma correlação inversa entre a hipermetilação e

FGFR3

mutações.

O fato de que nós encontramos nenhuma associação entre metilação e variáveis ​​clínico-patológicas com a utilização apenas de urina de pacientes com tumores recorrentes é intrigante , mas pode ser que a sensibilidade inferior observada em tumores de baixo grau não é causado apenas por poucas células tumorais esfoliadas na urina, mas sim que a hipermetilação não está presente no tumor ou no urotélio circundante, e por estratificação para a metilação em uma visita anterior esses pacientes são excluídos. É possível que os pacientes com metilação não são para ser considerados como um grupo distinto de tumores da bexiga. Finalmente, a falta de associação entre as variáveis ​​de metilação e clínico-patológico também pode ser uma consequência do conjunto relativamente pequeno de dados.

Os marcadores de metilação têm valores de especificidade na faixa de 43% a 67%, o que é baixo considerando que todos eles têm entre 94% de especificidade tumor -100% quando comparados aos controles. Uma baixa especificidade equivalente foi observada em um estudo investigando os níveis de mRNA de hTERT, SENP1, PPP1CA e MCM5 na urina obtidas de pacientes durante a vigilância da doença [45]. Baixa especificidade também foi observado por Zuiverloon et ai. quando se estuda

FGFR3

mutações para detectar recorrências de cancro da bexiga [38]. Além disso, a baixa especificidade dos marcadores de metilação foi previamente relatado em outros lugares por dois estudos destinados a detectar recorrências NMIBC [46], [47].

A metilação observada em amostras de urina de visitas cistoscopia-negativo pode ter várias fontes, ( i) um pequeno tumor não detectado por cistoscopia, (ii) células de tumor residuais no sítio da ressecção, ou (iii) pode ser um sintoma de células uroteliais epigeneticamente alterados presentes no urotélio circundante do tumor, ou em outros locais (defeito de campo ) que não tem nenhum fenótipo para distingui-las a partir de células uroteliais normais – uma methylator fenótipo urotelial epigenética [14]. Algumas das amostras de falso positivo com uma recorrência dentro de 12 meses após cistoscopia são muito provavelmente causada por tumores perdidas ou células de tumor residuais, mas para o resto das amostras falsas positivas esta explicação é improvável e os nossos resultados correspondem bem com a presença de uma bexiga defeito do campo. Dados recentes suportam a noção de que há uma hipermetilação do ADN defeito de campo em bexigas de pacientes com CM onde o tecido com aparência normal contém metilação do DNA generalizado [14]. Wolff e colegas sugerem que a metilação aberrante não é devido a expansão clonal, mas em vez é causada pela alteração epigenética generalizada no urotélio através da bexiga. Tem sido sugerido que este campo generalizado do urotélio aparência normal metilado aberrante pode ser a origem de a taxa de recorrência elevada no cancro da bexiga [14].

Com a descoberta de marcadores de metilação com sensibilidade muito elevada, a implementação de marcadores de metilação na vigilância de pacientes com baixo grau NMIBC parece provável. No momento do diagnóstico, o nível de metilação de cada marcador de metilação deve ser estabelecido antes do marcador pode ser aplicado para a vigilância. Antes da próxima visita de controle, o paciente pode fornecer uma amostra de urina para análise, e existem três resultados possíveis: i) se o teste for positivo, o paciente terá uma cistoscopia feito, e em 67 pacientes em cada 100 um tumor recorrente será encontrado, ao passo que os restantes 33 pacientes não terá uma recorrência do tumor. Isto não é um problema grave, já que os pacientes positivos falsos teria uma cistoscopia feito em qualquer dos casos; ii) um teste negativo vai permitir que os pacientes para ignorar a cistoscopia atual. Com o desempenho atual da análise, 94 de 100 pacientes BC com a recorrência do tumor são diagnosticados corretamente e seis pacientes são erroneamente diagnosticados como não ter uma recidiva tumoral. Esta quantidade de falsos negativos é comparável com cistoscopia HAL-guiado e melhor do que cistoscopia luz branca, em que 20 pacientes pode ser prevista para ser diagnosticados erradamente como não tendo uma recorrência do tumor [7] – [9]. No entanto, no presente estudo o

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marcador falhou para diagnosticar dois cancros da bexiga invasivo do músculo, que evoluíram a partir de dois tumores de grau III T1. Isto não seria aceitável num ambiente clínico, e indica que os pacientes com um elevado risco de progressão (por exemplo todos T1, grau III, tumores ou cis) tem que continuar com o regime de tratamento regular. Outra opção poderia ser a de usar um mais conservador de corte. Ao definir os valores de corte como a média mais 1x desvio padrão do nível de metilação, os tumores invasivos dois musculares não teria sido perdida; iii) uma amostra de urina com DNA insuficiente deverá conduzir a continuação do regime de tratamento inicial. Em todos os três casos, o paciente irá fornecer uma nova amostra de urina antes de a próxima visita de controlo que irá determinar se ou não o paciente deve ter uma cistoscopia realizada. Os marcadores de metilação podem também aumentar a taxa de detecção de lesões da CEI, como um teste positivo com uma cistoscopia negativo poderia então ser seguido por outro cistoscopia incluindo HAL.

Em conclusão, através da aplicação de uma metodologia muito sensíveis e semi-quantitativa para a detecção de recorrências de cancro da bexiga e estratificação em estado de metilação do tumor inicial, temos mostrado que o uso de um único marcador (

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), podemos detectar uma recorrência do tumor concomitante com uma sensibilidade de 94% e uma especificidade de 67 %. De acordo com as orientações da EAU sobre NMIBC, o regime de tratamento atual para os pacientes NMIBC de baixo risco é cistoscopia aos 3 e 12 meses seguintes TUR e, em seguida, a cada ano por mais 4 anos [48]. Este estudo sugere que os marcadores de metilação podem ser utilizados como marcadores de recorrência do câncer de bexiga para reduzir o número de cistoscopias em pacientes de baixo risco sem tumor concomitante (Figura 2) e, consequentemente, melhorar a qualidade de vida para os pacientes, bem como cuidados de saúde diminuição despesas.

Informações de Apoio

Figura S1.

Fluxograma que ilustra o fluxo de amostras durante o curso do estudo.

doi: 10.1371 /journal.pone.0046297.s001

(EPS)

Figura S2.

Exemplos de níveis de metilação na primeira visita e duas visitas posteriores para 5 pacientes com ou sem recorrências. Pacientes com duas recorrências subsequentes (A e B). Paciente sem recidivas na primeira visita de controle, mas o retorno em uma posteriores visitas de controlo (C e D). Um paciente sem recorrências posteriores (E). PMR é a percentagem de referência relativa. Um valor de 0% significa que nenhum metilação e um valor de 100% significa totalmente metilado. Uma barra escura representa uma visita com tumor concomitante e uma barra cinza representa uma visita sem tumor

doi:. 10.1371 /journal.pone.0046297.s002

(EPS)

Figura S3.

Kaplan-Meier do tempo de recorrência. metilação do DNA está associado a recidiva do tumor subsequente no prazo de 60 meses para os doentes sem tumor, mas com amostras de urina positivas metilação.