Abstract

Andrographis lineata

é uma planta medicinal à base de plantas usadas na medicina tradicional como um substituto para

andrographis

. Aqui, utilizando explantes de folhas maduras de

A

.

lineata

demonstramos pela primeira vez que a indução de calos estabelecidas em meio MS contendo 1,0 mg l

-1 IAA. calo seca foi submetida a extracção por solvente com acetona. Além disso, o resíduo de acetona foi separada por cromatografia em coluna de gel de sílica, cristalizado e caracterizado com base na ressonância magnética nuclear (protões e C13) e espectroscopia de massa de cromatografia líquida. Esta análise revelou a ocorrência de dois flavonas conhecidos ou seja, 7

O

-methylwogonin (MW) e Echioidinin (ED). Além disso, estes compostos foram testados quanto à sua citotoxicidade contra a linha celular de leucemia, CEM. Identificamos que a ED e MW induzida citotoxicidade de uma maneira tempo e dependente da concentração. Novo aumento da libertação de LDH após tratamento com ED e MW confirmou ainda mais nossos resultados de citotoxicidade contra linha de células leucêmicas. Surpreendentemente, MW foi mais potente do que a ED, quando comparado por ensaios de azul de tripano e MTT. Os nossos resultados recapitular o utilitário de culturas de calos para a produção de metabolitos secundários vegetais específicos bioactivos em vez da utilização de plantas selvagens. Juntos, os nossos

in vitro

estudos fornecem novos insights de

A

.

lineata

calos culturas que servem como fonte de agentes quimioterápicos para câncer

Citation:. Mohammed A, Chiruvella KK, Rao YK, Geethangili M, Raghavan SC, Ghanta RG (2015)

In vitro

Produção de Echioidinin, 7-

O

-Methywogonin de calos de

Andrographis lineata

e sua citotoxicidade sobre as células cancerosas. PLoS ONE 10 (10): e0141154. doi: 10.1371 /journal.pone.0141154

editor: Brett Neilan, da Universidade de New South Wales, Austrália

Recebido: 26 de maio de 2015; Aceito: 03 de outubro de 2015; Publicação: 21 de outubro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Mohammed et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

financiamento:.. os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Abreviaturas: MS, Murashige e Skoog; BA, benziladenina; IAA, ácido acético indol 3; NAA, ácido acético naftaleno; 2,4-D, ácido 2,4-diclorofenoxiacético; CCF, cromatografia em camada fina; RMN, ressonância magnética nuclear; LC /MS, cromatografia líquida /espectrometria de massa; UV, espectroscopia visível ultravioleta; IR, espectroscopia de infravermelho; MTT, 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio; MW, 7-

O

-methylwogonin; ED, echoidinin; DMF, dimetilformamida; DMSO, sulfóxido de dimetilo; nm, nanómetro; MHz, hertz mega-

Introdução

Entre todos os tipos de câncer, leucemia é considerado um dos vida mais agressivo ameaçando doenças malignas hematológicas com milhões de pacientes diagnosticados a cada ano. Leucemia é encontrado para ser muito sensível a agentes quimioterapêuticos [1]. A triagem de produtos naturais derivados de plantas medicinais têm sido promissores como fontes valiosas para drogas anti-tumorais. produtos naturais exercem potenciais anti-cancro através da inibição da proliferação das células e indução de apoptose [2,3]. Os extractos de plantas que exibem actividade anti-cancro é uma mistura de todos os compostos presentes no extracto, em vez do composto em particular [4,5]. Este apela para a busca de compostos isolados com propriedades farmacológicas bem definidas.

In vitro

culturas empregam tecnologia de cultura de tecidos de plantas é vantajoso em relação planta intacta para produzir metabólitos secundários sem destruir habitat natural [6,7,8]. Isto é devido ao facto de a taxa de crescimento celular e biossíntese de cultura iniciada a partir de uma pequena quantidade de material de planta é bastante elevada, uma consideravelmente produzido num curto período de tempo. Manipulando as condições de cultura, fito-hormonas é uma ferramenta valiosa para aumentar o nível de metabolitos bioactivos [9]. Isso está em contraste com grande número de

In vivo

plantas utilizadas para obter uma pequena quantidade de droga.

A produção de compostos medicinais derivados de plantas é uma questão de grande importância socio-económica. Isso fez com que as indústrias, bem como os cientistas a considerar o uso de

in vitro

culturas como uma fonte alternativa. Produção de produtos secundários de plantas por crescimento tecidos indiferenciados

in vitro

grandes quantidades têm sido reconhecidos como um meio no qual tanto a sazonalidade e especificidade momento da produção seria contornada. calos são promissores para obter específico da planta metabolitos valiosos exploradas para melhorar o rendimento de compostos bioativos, para acelerar o ritmo de conservação e propagação de um importante plantas etno-medicinal [10]. Estudos anteriores conseguiram a produção de metabólitos secundários por meio de

in vitro

cultura [11,12,13,14,15,16]. Por exemplo, preniladas flavanonas tais como sophoraflavanone G e lehmanin foram obtidos a partir de

Sophora flavescens

cultura de calo [17]. Callus de

Hypericum perforatum

yeilded luteolina 6-C-prenil, juntamente com luteolina-5,3′-dimetil éter, luteolina-5-glicosídeo e glicosídeo luteolina-3 ‘[18]. É importante salientar composto anti-cancro, tais como o taxol, também foi obtido a partir de culturas de calo da espécie Taxus [19,20,21]. Surpreendentemente, teor de isoflavonas a partir de culturas de calos de espécies Genista foram mais do que o

In vivo

plantas [22,23].

Andrographis

(Acanthaceae) compreende 250 gêneros e 2500 espécies. Entre todos os géneros, Andrographis

paniculata

é de importância potencial na medicina tradicional para o tratamento de várias doenças, devido ao seu amplo espectro de atividades biológicas [24,25]. As atividades farmacológicas de

Andrographis Quais são devido à presença de flavonóides, terpenóides e flavonóides glicosídeos como andrographolide, echiodinin e echiodinin 5-

o

-β-D-glucopiranósido. Andrographolide e seus derivados possuem propriedades anti-cancro potenciais [26]. 7-

O

metil dihydrowogonin, 5-hidroxi-3,7,8,2′ tetrametoxi flavona e flavona 7-

O

-methylwogonin das raízes de

A

.

paniculata

foram identificados [27]. calos de

A

.

paniculata

foram relatados para ser 7-

O

-methylwogonin, calota craniana flavona I e 5-hidroxi-7,8,2′-trimetoxiflavona [28]. A ocorrência de 7-

O

-methylwogonin constitui o primeiro relatório de um 2′-deoxyflavone.

Andrographis lineata

utilizado no presente estudo é uma planta medicinal tribal servindo tão bom substituto para

a

.

paniculata

. Da mesma forma esta planta é usada por médicos para o tratamento de picadas de cobra, diabetes, doenças de pele, febre, constipação, bronquite, câncer, inflamação e estomacal. Possui também anti-helmíntica, anti-inf lamatória, antipirética e propriedades antiperiódicas [29,30]. pasta de folha é usado para curar infecções respiratórias, enquanto decocção raiz como antídoto. Flavonóides, juntamente com andrographolide foram relatados a partir de extratos de folhas [31]. Os estudos farmacológicos com extratos de folhas exibido antibacteriano, hepatoprotective diurético e actividades anti-diabéticos [32,33,34].

Estudos anteriores com

A

.

paniculata

demonstraram a utilidade de culturas de calos para a produção de metabolitos secundários, em vez da utilização de plantas selvagens. Isto levou-nos a desenvolver indução de calos para

in vitro

produção de metabólitos secundários em um período relativamente curto de tempo, passando pressão sazonal ronda do ano. Aqui nós relatamos pela primeira criação tempo de calos a partir de explantes foliares de

A

.

lineata

. Mostramos isolamento e caracterização estrutural de echioidinin (ED) e 7-

O

-methywogonin (MW) por cromatografia em coluna de sílica gel seguido por ressonância magnética nuclear (protões e C13) e espectroscopia de massa de cromatografia líquida. Além disso, demonstramos ED e MW citotoxicidade induzida contra células leucémicas em um tempo e forma dependente da concentração.

Materiais e Métodos

Reagentes e produtos químicos

Substâncias químicas como NAA, 2,4-D, IAA foram obtidos da Sigma. HgCl

2 foi a partir de E. Merck, sacarose de Sisco, gel de sílica a partir Acme produtos químicos sintéticos e Agar de CDH, Mumbai, na Índia. DMSO, DMF, acetona, hexano, acetato de etilo e metanol foram obtidos de Sigma.

Condições material vegetal e cultura de tecidos para Callus Indução

Mature folhas coletadas de plantas de campo crescido de

A

.

lineata

foram utilizados como explantes. As folhas foram esterilizadas à superfície em 70% de etanol durante 30 seg seguido de lavagem em água destilada estéril, em seguida, tratada com 0,1% de HgCl

2 (w /v) (Merck) durante 2 min e seguida por lavagem em água destilada estéril. As extremidades cortadas dos explantes foram aparadas com ponta afiada lâminas cirúrgicas estéreis. Além disso, os explantes foram riscados sobre discos de papel de filtro estéril antes da inoculação. Os meios nutrientes utilizados no presente estudo foi de Murashige e Skoog, meio de, 1962. Os meios foram congelados com ágar (0,8%), sacarose e 3% foi utilizada como uma fonte de hidratos de carbono. O pH do meio foi então ajustado para 5,6-5,8 e o meio foi finalmente feita a um volume conhecido. Agar foi adicionado ao meio antes de dispensar para os recipientes (15 ml para 25 × 150 mm) tubos de ensaio que foram autoclavados durante 15 min a 15 lbs /in

2. Os tubos de ensaio contendo meio estéril foram colocados numa posição inclinada, a fim de aumentar a área de superfície dos meios de comunicação. Todas as culturas foram incubadas numa sala de cultura a 25 ± 2 ° C com uma humidade relativa de 50-60% e fotoperíodo de 16 h a uma densidade de fluxo de fótons de 15-20 μ m E

2 s

-1 de branco lâmpadas fluorescentes frias

meio MS com diferentes concentrações de auxinas (2,4-D, AIA e ANA), variando 0,1-1,0 mgl

-. l foram usadas para estudar seus efeitos sobre a indução de calos na concentrações variáveis ​​(Tabela 1). Subsequentemente, o calo bem estabelecida obtido em meio MS fortificado com 1,0 mg L

-1 IAA foi subcultivada 4-5 vezes para uma óptima produção de calos a intervalos regulares de 20 dias após a inoculação. Esta técnica de indução de calos para a produção de metabólitos secundários foi previamente descrito por vários grupos [10,14,23,35].

Extração, isolamento e identificação de compostos purificados a partir de

A

.

lineata

Calli

O calos obtido foi primeiro secas à temperatura ambiente durante alguns dias e, em seguida, o material foi moído para um pó fino (750 g). O pó obtido foi submetido a extracção por solvente utilizando acetona quente num Soxhlet aparatos [10]. extracção a quente aumenta a solubilidade do soluto de produtos naturais e, extrai a maior parte dos metabolitos secundários. A fim de se obter o número máximo de compostos de

Andrographis lineata

calos, utilizou-se a acetona para soxhlation sob condição quente. Além disso, o uso de acetona como solvente de extracção não é para extrair os lípidos com a mesma eficácia como o faria para os metabolitos secundários. A evaporação do extracto

in vácuo

originou um resíduo castanho escuro, extracto de acetona (30 g) (Figura 1B). O extracto de acetona suspenso em H

2O, foi particionado com hexano para dar hexano fracções solúveis e insolúveis. Além disso, realizou-se hexano fracionamento, pois elimina a clorofila e componentes não-polares.

(A) Callus foi induzida a partir de explantes de folhas em meio MS suplementado com 1,0 mg l

-1 IAA (Bar = 2,5 mm) depois de 4 semanas. (B) Representação esquemática da análise fitoquímicos de calo de

Andrographis lineata

para o isolamento de compostos bioactivos.

O resíduo insolúvel hexano (20 g) foi cromatografado sobre gel de sílica, utilizando hexano- acetato de etilo gradiente eluente, e as fracções semelhantes foram combinadas para produzir quatro sub-frações (Fr. I ao P. IV). As fracções II foi ainda separada usando uma coluna de gel de sílica eluindo com um gradiente de hexano-acetato de etilo para se obter um sólido amarelo (24 mg) o qual foi designado como ALC-1. Isso deu uma cor verde com Fe

3+ uma cor vermelho laranja com tanto Mg-HCI e Zn-HCI. Por outro lado, repetiu CC sobre gel de sílica (5 x 90 cm) da fracção solúvel em hexano com polaridade crescente utilizando misturas de acetato de etilo /hexano deu origem a três sub-fracções (F1-F3). Fracção F2 foi recromatografado sobre uma coluna de gel de sílica, utilizando hexano /EtOAc (60:40), para se obter um sólido branco (20 mg). Além disso, este, após cristalização a partir de metanol proporcionou agulhas incolores (19 mg). Este foi designado como ALC-2. Ele deu uma cor verde com cloreto férrico alcoólica e uma cor-de-rosa com ácido Mg-HCl.

Outra purificação de subfrações de hexano insolúvel (Fr. I, Fr. III-IV), e hexano solúvel (F1 e F3) frações não deu qualquer princípio cristalina. Todos os eluatos que continham “resíduo” ou “sem resíduo” foram analisados ​​por TLC como descrito abaixo, por pulverização de 8% de ácido sulfúrico metanólico. Isto é seguido por aquecimento numa placa quente a 100 ° C durante 4 minutos para desenvolvimento de cor óptima. As placas foram visualizadas e valores de Rf foram calculados. Em seguida, os compostos purificados foram eluídos nos sistemas de solventes correspondentes e os eluatos foram conservadas para análise espectral.

ultra violeta (UV) os espectros foram registados num Beckman 25 e Shimadzu UV-240 espectrofotómetros e valores foram dadas em nm. Infra-vermelho (IR) espectros foram registrados em modelo Perkin-Elmer 283B e 297 espectrofotômetros de feixe duplo e

ν

valores foram dadas em cm

-1. Resonância magnética (

1H RMN) Os espectros foram registados num Varian, 200, JEOL FX-90Q e Bruker AM-300-espectrofotómetros com TMS como padrão interno. Carbono-13 de ressonância magnética nuclear (

13C RMN) foram registados num JEOL FX-90Q espectrofotómetro. Os desvios químicos foram dados em ppm δ. Os espectros de massa (MS) foram registrados em LC-MSD-Trap-SL (Agilent Technologies) no Centro Nacional de Espectroscopia de Massa pelo Instituto Indiano de Tecnologia Química, Hyderabad.

cromatografia em camada delgada (TLC)

as placas de vidro de (20 × 20 cm) foram cuidadosamente lavados em água corrente da torneira, seguido por água destilada, e as placas foram mantidas prontas para aplicação do gel de sílica. gel de sílica 25 g (ACME) foi dissolvido em 50 ml de água destilada duas vezes, bem agitada e a lama foi então passada no espalhador. O difusor foi gentilmente puxou ao longo das placas, (2-3 mm de espessura) para obter uma aplicação uniforme. As placas foram activadas a 100 ° C durante cerca de 45 min, deixou-se arrefecer, retirado do forno e submetido a utilizar.

Os eluatos foram aplicados sob a forma de mancha com micropipeta, 2 cm acima da base de a placa e foram deixadas a secar com secador de cabelo. Em seguida, as placas foram desenvolvidas em hexano: acetato de etilo 9: 1 (v /v) e em hexano: acetato de etilo 8: 2 (v /v). O solvente foi deixado mover-se para 15 cm, em seguida, foram removidos, deixou-se secar. As placas foram pulverizadas com ácido sulfúrico a 8% de metanol, não depois sujeito a aquecimento num forno de ar quente a 100 ° C durante 5 min. Em seguida, os compostos foram visualizados e valores de Rf foram calculados. De igual modo as placas revestidas previamente feita de gel de sílica foi desenvolvido em diferentes sistemas de solventes com hexano, acetato de etilo e os extractos de metanol. As placas foram opostos aos cromatoplacas recebeu o reagente spray. O contorno dos compostos foi marcado com uma agulha sobre as placas de gel de sílica não pulverizados.

Cultura de Células

linha de células de leucemia humana CEM foi comprado de Centro Nacional de Ciência celular, Pune, na Índia. As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 (LAB Sera, EUA) contendo 10% de FBS (Gibco BRL, EUA), 100 U de penicilina G /mL e 100 ug de estreptomicina /ml a 37 ° C numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO

2. As células foram divididos na proporção de 1:10 cada 3-5 dias.

Echioidinin (ED) e 7-

O

-methywogonin (MW) utilizado no presente estudo são os flavonóides naturais purificado a partir de calos folha de

A

.

lineata

. Os compostos ED e MW foi dissolvido em DMF (Sigma, EUA). A concentração máxima de DMF (dimetilformamida) usado nas experiências foi igual a 0,05% e a mesma quantidade foi utilizada como controlo do veículo. Em todas as experiências aqui descritas echioidinin e 7-O-methywogonin foi adicionada 24 h depois da cultura.

A viabilidade celular por exclusão com Azul de Tripano

ensaio de exclusão

azul de tripano foi realizada para avaliar o efeito de ED e MW na viabilidade das células CEM. Aproximadamente 0,75 x 10

5 células /ml foram tratadas com diferentes concentrações de ED e MW. Após 24 h de crescimento de células, diferentes concentrações de ED e MW (10, 50, 100, ou 250 ^ M) ou veículo (DMF) foram adicionados às células. As células foram retiradas da cultura após cada 24 horas e corados com azul de tripano como descrito [2,36]. O número de células (viáveis-imaculado e não viáveis-azul) foram contadas utilizando um hemocitómetro. Cada experiência foi realizada três vezes independentes com boa concordância.

A proliferação celular pelo ensaio de MTT

A sobrevivência das células foi ainda avaliada por 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2, brometo (MTT) de redução do corante 5-difenil tetrazólio, o qual é baseado na capacidade de células viáveis ​​para metabolizar um sal de tetrazólio amarelo a violeta produto formazan que pode ser detectado espectrofotometricamente. As células CEM de crescimento na fase logarítmica foram tratadas com diferentes concentrações de ED e MW (10, 50, 100, 250 pM) e incubadas em 5% de CO

2 atmosfera com humidade elevada. As células foram recolhidas após 48 e 72 horas e tratou-se com MTT (0,5 mg /ml) tal como descrito anteriormente [36,37]. A absorvância foi medida a 570 nm num leitor de placas com múltiplas cavidades de ELISA. A absorvância média dos controlos médio era o branco e foi subtraída. A concentração de composto que provoca 50% de inibição do crescimento celular (IC

50) foi estimada após 72 horas de exposição. A absorvência das células de controlo foram tomados como 100% de viabilidade e os valores de células tratadas foi calculada como uma percentagem do controlo. Os dados mostrados são obtidos a partir de três lotes independentes de experiências.

Ensaio de Libertação de LDH

A libertação de lactato desidrogenase (LDH) é um indicador da integridade da membrana e, portanto, a lesão da célula. ensaio de LDH foi realizada para avaliar a libertação de LDH na cultura seguinte ED e tratamento MW (10, 50, 100 e 250 uM) em células CEM durante 48 e 72h de acordo com protocolos convencionais [37]. A LDH intracelular foi determinado após lise das células por congelamento e descongelamento rápido. A libertação de LDH foi medida a uma absorvância de 490 nm. A percentagem de libertação de LDH foi calculada como: (actividade de LDH nos meios de comunicação) /(actividade de LDH nos meios + actividade de LDH intracelular) × 100. Cada experiência foi realizada três vezes independentes com boa concordância.

Análise estatística

Os resultados são expressos como a média mais ou menos o erro padrão. Todas as análises foram realizadas com o software GraphPad utilizando ANOVA de uma via seguido pelo teste de Tukey-Kramer teste de comparação múltipla. A significância estatística foi considerada para p . 0,05

Resultados

In vitro

Callus Indução de Mature Folha explantes

Nós estabelecemos calos a partir de explantes de folhas maduras em meio MS fortificada com auxinas como NAA, 2,4-D e IAA. A natureza do calo variou com a concentração de auxinas utilizados diferentes (Tabela 1). Branco, calo mole e friável foi obtida em meio MS suplementado com 2,4-D (0,1-0,5 mg l

-1). A frequência da luz, duro calos organogênica verde amarelado, em termos de crescimento da biomassa foi encontrado para ser o máximo (75%) em presença de 1,0 mg L

-1 IAA (Fig 1A) após 4 semanas (Tabela 1).

no entanto, 1,0 mg l

-1 NAA e 2,4-D agravado consideravelmente a frequência de formação de calos. A idade do explante foi fundamental para calo proliferação contínua. Uso das folhas mais velhas reduzido a formação de calo. A indução de calos óptima foi observada em presença de 1,0 mg L

-1 IAA e foi utilizado para o isolamento de compostos bioactivos (Fig 1A). calo organogênica foi aumentada no seu volume através de subcultura segmentos de calos em meio MS fortificada com 1,0 mg l

-1 IAA para cada vinte dias. Callus era saudável durante todas as subculturas e subcultura de calo fornecida a quantidade em massa para a extração de metabólitos secundários. Como esperado, após a transferência para a mídia contendo citocinina, BA mostrou atirar resposta morfogênica (dados não mostrados).

Identificação Estrutura de Echioidinin e 7-

O

-methylwogonin

Caracterização e determinação estrutural de echioidinin (ED) e 7-

o

-methywogonin (PM) foram estabelecida principalmente na base de RMN 1D e estudos do espectro de massa. O composto ALC-1 foi cristalizada a partir de metanol na forma de cristais amarelos (20 mg) com o ponto de fusão, 264-265 ° C. Foram analisados ​​por sua fórmula molecular C

16H

12O

5 com peso molecular de 285 [M + H]

+. Foi roxo sob UV e UV /NH

3. Os detalhes espectrais do composto são indicados a seguir

UV (S1A Fig.):

λ

max (MeOH) (ε log) 265 (4,40), 335 (4,19) nm . IR (S1B Fig):

v

max (KBr) 3416 (OH), 2980, 1662 ( C = O), 1614, 1504, 1452, 1350, 1245, 1159, 865 , 831 cm

-1.

RMN de 1H (Fig 2A): (300 MHz, DMSO

d

6) δ 12,88 (1H, s, 5-OH, permutável com D

2O), 10,90 ( 1H, s, 2′-OH, permutável com D

2O), 7,90 (1H, dd,

J

= 2,0, 8,0 Hz, H-6 ‘), 7,40 (dt, 1H,

J

= 2,0, 8,0 Hz, H-4 ‘), 7,10 (s, 1H, H-3), 6,99-7,05 (m, 2H, H-3’, 5 ‘), 6,75 (d, 1H,

J

= 2,5 Hz, H-8), 6,35 (d, 1H,

J

= 2,5 Hz, H-6), 3,90 (s, 3H, OMe-7) .

13C RMN (Figura 2B): (300 MHz, DMSO

d

6) δ 182,0 (C-4), 165,1 (C-7), 161,4 (C-2), 161,0 (C-5), 157,3 (C-8a), 156,7 (C-2 ‘), 132,8 (C-4’), 128,4 (C-6 ‘), 119,3 (C-5’), 117,0 (C-1 ‘), 116,9 (C-3’), 109,1 (C-3), 104,6 (C-3a), 97,8 (C-6), 92,4 (C-8), 55,9 (OMe-7). LC-MSD (Fig 2C):.

m

/

z

= 284 [M]

+, 285 [M + H]

+

(a)

espectros de RMN de 1H (B)

13C os espectros de RMN (C) a cromatografia líquida espectros de massa (D) Estrutura de echioidinin.

Assim, a partir do exposto acima estudos espectrais ALC -1 foi caracterizado como 5, 2′-di-hidroxi-7-metoxiflavona (Echioidinin, ED) (figura 2D) como os seus dados físicos e espectrais estava em boa concordância com os valores na literatura [38].

em seguida, o composto ALC-2 foi cristalizada a partir de hexano na forma de agulhas amarelo pálido (20 mg) com ponto de fusão, 181-182 ° C. Foram analisados ​​por sua fórmula molecular C

17H

14o

5 com peso molecular, 298. Foi roxo sob UV e UV /NH

3. Os detalhes espectrais do composto são indicados a seguir

UV (S2A Fig.):

λ

max (MeOH) nm (log

ε

) 272 (4,52 ), 345 (3,78) nm. IR (S2B Fig):

ν

max (KBr) 3416 (OH), 2938 (-OMe), 1661 ( C = 0), 1605, 1510, 1447, 1376, 1274 , 1225, 1125, 1030, 970, 833, 767, 686 cm

-1.

RMN de 1H (Figura 3A): (300 MHz, DMSO

d

6) δ 12,65 (1H, s, OH-5), 8,10 (2H, m, H-2 ‘ , 6 ‘), 7,61 (3H, m, H-3’, 4 ‘, 5’), 7,01 (1H, s, H-3), 6,60 (1H, s, H-6), 3,98 (3H, s , OMe-7), 3,87 (3H, s, OMe-8).

13C RMN (Figura 3B): (300 MHz, DMSO

d

6) δ 183,5 (C-4), 164,7 (C-2), 160,0 (C-7), 159,4 (C-5), 150,3 (C-8a), 132,8 (C-4 ‘), 132,3 (C-8), 130,0 (C-1’), 130,1 (C-3 ‘, 5’), 127,2 ( C-2 ‘, 6’), 105,8 (C-3), 105,4 (C-4a), 96,7 (C-6), 61,6 (OMe-8), 56,8 (OMe-7). LC-MSD (Fig 3C):.

m

/

z

= 299,1 [M + H]

+

(A)

1H NMR espectros (B)

13C espectros (C) espectro de massa de cromatografia líquida (D) Estrutura de 7-

o

metil wogonin.

Assim, a partir dos estudos espectrais precedentes, a estrutura de ALC-2 foi elucidada como 5-hidroxi-7, 8-dimethoxyflavone (7-

o

-methylwogonin) (Figura 3D) e também foi confirmada por comparação dos valores da literatura [39].

Echioidinin (ED) e 7-

o

-Methylwogonin (MW) citotoxicidade induzida em células leucêmicas em uma dose e tempo-dependente Manner

em seguida, examinaram o efeito citotóxico de ED e MW (Figs 4A e 5A) sobre a sobrevivência e proliferação de linha celular de leucemia, CEM (leucemia de células T). Tripano azul ensaio foi a primeira linha da nossa investigação, onde CEM foi tratada com 10, 50, 100 ou 250 ^ M de ED e MW. As células sem adição de composto serviram como controlo. Uma vez que o composto foi dissolvido em DMF (dimetilformamida), as células com DMF foram usadas como controlo do veículo. A concentração máxima de DMF utilizado nas experiências era igual a 0,05% e a mesma quantidade foi utilizada como controlo do veículo. A seguir à adição do composto, as células foram contadas em intervalos de 24 h até que as células de controlo atingiram a fase estacionária. Os resultados mostraram que o crescimento celular foi afectada com aumento do tempo (Figuras 4B e 5B). O efeito foi reduzido quando ED 10 uM e MW foi usada. No entanto, as concentrações de 100 e 250 uM resultou num aumento da morte celular (Figuras 4B e 5B). O IC

50 de ED e MW foi de aproximadamente 100 mM, às 72 horas de tratamento.

(A) Estrutura do ED. (B) Avaliação da viabilidade celular utilizando o ensaio de azul de tripano seguinte 10, 50, 100 e 250 uM de ED ou tratamento DMF (controlo). As células foram colhidas, trypan azul manchado e contados a cada 24 h até atingir a fase estacionária. (C) Determinação da viabilidade das células por ensaio MTT% em células CEM. As células foram cultivadas com 10, 50, 100 e 250 uM de ED ou de controlo de veículo, durante 24, 48 e 72 h. A% de viabilidade celular foi calculado considerando DMF células tratadas como 100% e plotados com a representação de barras de erro. (D) Medição da libertação de LDH após o tratamento com ED. Após a exposição das células CEM com ED em diferentes concentrações (10, 50, 100 e 250 uM) durante 24, 48 e 72 h, a libertação de LDH foi medida a 490 nm. Os resultados são apresentados como percentagem de libertação de LDH. Cada experimento foi realizado três vezes independentes com um bom acordo.

(A) Estrutura do MW. (B) Avaliação da viabilidade celular utilizando o ensaio de azul de tripano seguinte 10, 50, 100 e 250 uM de MW ou DMF tratamento (controlo de veículo). As células foram colhidas, trypan azul manchado e contados a cada 24 h até atingir a fase estacionária. (C) Determinação da viabilidade das células por ensaio MTT% em células CEM. As células foram cultivadas com 10, 50, 100 e 250 uM de controlo do veículo MWor para 24, 48 e 72 h. A% de viabilidade celular foi calculado considerando DMF células tratadas como 100% e plotados com a representação de barras de erro. (D) Medição da libertação de LDH após o tratamento com MW. Após a exposição das células CEM com PM em diferentes concentrações (10, 50, 100 e 250 uM) durante 24, 48 e 72 h, a libertação de LDH foi medida a 490 nm. Os resultados são apresentados como percentagem de libertação de LDH. Cada experimento foi realizado três vezes independentes com um bom acordo.

A citotoxicidade induzida por ED e MW na proliferação de células leucêmicas foi ainda verificada utilizando o ensaio MTT. As células CEM tratadas com 10, 50, 100 e 250 uM de ED e MW foram colhidas após 24, 48 ou 72 h, e foram submetidos a ensaio de MTT (Fig 4C e 5C). Os resultados mostraram que a viabilidade celular foi afectado por tratamento com ED e MW de 100 e 250 pM, especialmente após 72 h. Estes resultados sugerem ainda que o ED e MW induzir a citotoxicidade.

Além disso, o ensaio de LDH foi realizado para determinar a integridade celular e o tratamento seguinte ED MW (10, 50, 100 e 250 uM). Os resultados mostraram um aumento da sua concentração e dependente do tempo da libertação de LDH por tratamento com ED e MW, confirmando ainda mais os resultados acima (Figuras 4D e 5D). No geral, nossos resultados sugerem que a DE e MW foram capazes de induzir citotoxicidade na linha de células de câncer.

Discussão

Tem havido um interesse crescente para identificar produtos vegetais como agentes terapêuticos que podem efetivamente interferir com proliferação de células de cancro. Uma planta medicinal marcante neste registo é

A

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lineata

com uma vasta gama de efeitos farmacológicos. No presente estudo, em primeiro lugar, descrevemos estabelecimento de culturas de calos a partir de explantes de folhas maduras. Em segundo lugar, demonstramos isolamento e caracterização estrutural de echioidinin, 7-

O

-methywogonin de calos. Em terceiro lugar, utilizando ensaios baseados em células que exibem tratamento de echiodinin, 7-

O

-methywogonin em células de leucemia aboliu a sua proliferação celular. As conclusões acima apresentadas são baseadas em várias análises diferentes, tal como descrito em nosso papel. Estes resultados são importantes devido às realizações para os seres humanos como a busca de novos compostos farmacologicamente ativos de plantas levou à descoberta de muitas drogas clinicamente úteis.

Diversas linhas de evidência no passado sugere que os reguladores de crescimento papel planta estimulante a biossíntese de metabólitos secundários importantes medicinalmente na fábrica

in vitro

culturas de tecidos [10,22,35,40]. Tal produção de metabolitos secundários

In vitro

baseia-se na premissa de que o produto valioso produzido na natureza em qualquer órgão ou outro tecido a partir de uma planta pode ser estimulada a acumular-se nas células indiferenciadas. Tais culturas de calos são capazes de produzir metabolitos em quantidades bem acima do limite de detecção, dependendo do meio nutriente, a concentração de sacarose, idade da linha de calo e de células. Wewetzer [40] relatou que a diferenciação morfológica não é um pré-requisito para a produção de azadiractina; No entanto, as concentrações mais elevadas foram detectadas em células indiferenciadas completamente. Nós relatamos pela primeira vez IAA acumulando os flavonóides na cultura de calos de

A

.

lineata

. Recentemente, tem sido relatada a influência de IAA em aumentar o teor de isoflavona em culturas de calos de

Genista Tinctoria

juntamente com citocinina [22]. Ainda mais a nossa observação de manchas verdes no calo indicar a elevada taxa de crescimento de calos bem capacidade de calo para produzir brotos. Os pesquisadores conseguiram produzir vários fitoquímicos secundárias valiosas calos desorganizados [14,35,41,42,43,44,45].

No presente estudo, a investigação fitoquímica sistemática de

A

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lineata

culturas de calos levar ao isolamento e caracterização de dois compostos: 5, 2′-di-hidroxi-7-metoxiflavona (echioidinin) e 7-

O

-methylwogonin. Isolamento de flavonóides 2′-oxigenados, que ocorrem raramente na natureza, de

A

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