Abstract

A seleção de pacientes colorectal cancer (CRC) propensos a responder à terapia continua a ser um desafio clínico. Os objetivos deste estudo foram estabelecer quais genes foram diferencialmente expressos em relação à sensibilidade tratamento e relacioná-lo com o número de cópias em um painel de 15 linhas celulares de CRC. variações no número de cópias dos genes identificados foram avaliados em uma coorte de CRCs. IC

50 foram medidos por 5-f luorouracilo, oxaliplatina, e BEZ-235, um inibidor de PI3K /mTOR. As linhas celulares foram perfilado usando um array hibridação genômica comparativa, análise de expressão gênica Illumina, matrizes de proteínas de fase reversa e sequenciamento alvo de

KRAS

mutações de ponto de acesso. ganhos frequentes foram observados em 2p, 3T, 5p, 7p, 7q, 8q, 12p, 13q, 14q e 17q e as perdas no 2T, 3p, 5q, 8p, 9p, 9q, 14q, 18q e 20p. regiões ganharam freqüentemente continham

EGFR

,

PIK3CA

,

MYC

,

SMO

,

TRIB1

,

FZD1

e

BRCA2

, enquanto as regiões frequentemente perdidos continha

FHIT

e

MACROD2

.

TRIB1

foi seleccionado para um estudo mais aprofundado. Análise de Enriquecimento de gene mostraram que os genes diferencialmente expressos com respeito à resposta ao tratamento estavam envolvidos na sinalização de Wnt, a sinalização do receptor de EGF, apoptose, ciclo celular, e angiogénese. integração gradual do número de cópias e expressão gênica de dados rendeu 47 genes candidatos que foram significativamente correlacionados.

PDCD6

foi diferencialmente expressos em todas as três respostas ao tratamento. microarrays de tecido foram construídos para uma coorte de 118 pacientes com CCR e

TRIB1

e

MYC

amplificações foram medidos utilizando fluorescência

in situ

hibridação.

TRIB1

e

MYC

foram amplificados em 14,5% e 7,4% da coorte, respectivamente, e estas amplificações foram significativamente correlacionados (p≤0.0001).

TRIB1

expressão da proteína no grupo de doentes foi significativamente correlacionada com Perk, Akt, e caspase 3 expressão. Em conclusão, um conjunto de candidatos biomarcadores preditivos de 5-fluorouracil, oxaliplatina e BEZ235 são descritos que justificam um estudo mais aprofundado. Amplificação do oncogene putativo

TRIB1

foi descrita pela primeira vez em uma coorte de pacientes com CCR

Citation:. Briffa R, Hum I, Faratian D, Zhou Y, Turnbull AK, Langdon SP, et al. (2015) Multi-Scale Genomic, Transcriptoma e proteoma Análise de linhas celulares de cancro colorrectal para identificar novos biomarcadores. PLoS ONE 10 (12): e0144708. doi: 10.1371 /journal.pone.0144708

editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, JAPÃO

Recebido: 16 de junho de 2015; Aceito: 23 de novembro de 2015; Publicação: 17 de dezembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Briffa et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi parcialmente financiado pelo percursos educativos Estratégico Scholarship (Malta). A bolsa é co-financiado pela União Europeia – Fundo Social Europeu (FSE) no âmbito do Programa Operacional II – Política de coesão 2007-2013, “Capacitando Pessoas de mais empregos e uma Melhor Qualidade de Vida”. Este projecto foi, adicionalmente, financiado pelo Medical Research Scotland

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O câncer colorretal (CRC) é responsável por 8 % de todas as mortes por câncer [1], com a sobrevida variável entre 39% e 65%, dependendo do estágio no momento do diagnóstico [2]. O risco de desenvolvimento de CRC é dependente de ambos os factores genéticos e relacionadas ao estilo de vida e aumenta acentuadamente com a idade [2]. Embora o tratamento pode ser curativa, uma proporção considerável de pacientes de CRC têm um alto risco de recorrência da doença após cirurgia e quimioterapia [3].

As principais vias implicadas na carcinogénese colorrectal incluem, mas não estão limitados a, a PI3K /mTOR, a via de proteína-quinases activadas por mitogénio (MAPK), e a via Wnt [4], com a via JAK /STAT, ouriço via, e NFkB via também envolvido [5]. Estas vias são controlados através de crosstalk complexo, feedback negativo, e outros mecanismos compensatórios. Enquanto a activação destas vias ocorre por meio de mutações em oncogenes e genes supressores de tumores que participam, respectivamente, das 80 mutações somáticas em qualquer CRC individuais, apenas 15 ou, possivelmente, menos são susceptíveis de ser condutores essenciais da iniciação do tumor, progressão e /ou manutenção [ ,,,0],6]. Os genes mais frequentemente mutado em CRC são

APC

(70-80%),

TP53

(50%),

KRAS

(35-45%),

PIK3CA

(25-32%),

BRAF

(10-17%) e

PTEN

(4-5%) [7-12].

terapia de primeira linha para o CRC é geralmente monoterapia fluoropyramidine e oxaliplatina ou quimioterapia à base de irinotecan [13]. Mais recentemente, os anticorpos monoclonais, tais como cetuximab, panitumumab, e bevacizumab foram licenciadas em combinação com quimioterapia para CRC metastático (CCRm) [14] Os agentes anti-cancerígenos como selectivos e específicos com um índice terapêutico elevado e toxicidade mais baixa do que as terapias convencionais [15]. No entanto, as respostas ao tratamento são variados, com menos do que um terço dos pacientes que respondem ao 5-fluorouracilo [16]. Embora

KRAS Comprar e

BRAF

mutações indicam resistência a terapias alvo-EGFR, cerca de 40-70% do tipo selvagem

KRAS

pacientes com CCRm obtém pouco ou nenhum benefício de EGFR terapias específicas [17]. Continua a haver uma falta de marcadores preditivos que permitem que os médicos a selecionar os pacientes com maior probabilidade de se beneficiar de uma terapia específica.

Aqui, procurou-se caracterizar sistematicamente um painel de linhas celulares de CRC, selecionado para refletir a diversidade desta doença , usando alto throughput análises a fim de identificar biomarcadores de resistência a ambas as terapias-alvo e não-alvo.

Métodos

CRC linha de células painel

Quinze linhas celulares de CRC foram estudados: as linhas perto célula diplóide DLD-1, HCT116, HCT116p53 – /-, SW48, e LoVo (todos da ECACC exceto HCT116p53 – /- que foi um presente do Dr. G Smith, da Universidade de Dundee, Reino Unido [18]) e as linhas de células aneuplóides SW480, SW837, HT29, T84, Colo 201, Colo 320DM, LS411N, SK-CO-1, NCI H508 e NCI H716 (todos da ATCC) além do Colo 320DM, T84, e SW837 (todos da ECACC) .

As linhas de células foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Gibco

®, N ° Cat 31885..) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS; PAA, N ° Cat.. A15-101) e 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco

®, Cat. No.15140-122). As linhas de células foram cultivadas numa incubadora humidificada a 37 ° C que contém 5% de CO

2. Todas as linhas celulares foram testadas para micoplasma usando o Venor

™ GeM Mycoplasma Detection Kit (Sigma-Aldrich, cat. No. MP0025). Quando as linhas de células atingiu 70-80% de confluência, foram tripsinizadas usando 0,05% de tripsina-EDTA (1X), com vermelho de fenol (Gibco

®, Cat. No. 25300).

Amostras clínicas

, amostras de tecido de arquivo fixados em formalina embebido em parafina (FFPE) foram obtidas a partir de amostras de ressecção de pacientes que vivem na Escócia que foram diagnosticados com CRC, entre 1996 e 2003 e estavam sob 55 anos de idade no momento do diagnóstico (consulte S1 a Tabela). Um total de 870 pacientes tinham sido recrutados como descrito anteriormente [19]. Todos os casos foram revistos por um histopatologista gastrointestinal antes da construção de TMA para assegurar que o tecido era composta principalmente de tumor. Todos os cânceres foram encenadas Dukes ‘A e acesso de materiais e clínicos B. coorte registros foi concedida pelo Comitê de Tecidos, Edimburgo Experimental Cancer Medicine (Ref: TR029), o Comitê de Ética em Pesquisa Lothian (Ref: 08 /S1101 /41) e no Sudeste da Escócia HSS (SAHSC) recursos biológicos. (Ref: SR117)

ensaios de sensibilidade às drogas

5-fluorouracil (5-FU) 50 mg /ml solução injectável foi comprado de Medac GmbH. A oxaliplatina (L-OHP) 5 mg /ml de concentrado para solução para perfusão (Fresenius Kabi Oncology plc, Reino Unido) foi obtido a partir da Western Hospital Geral de Farmácia, Edimburgo. O inibidor alvo BEZ235 (Cat. Nº. S1009) foi comprado de Selleck Chemicals. Cada placa de 96 poços consistiu em seis poços contendo células em DMEM suplementado com 10% FBS e 1% de penicilina /estreptomicina, que serviu como um controlo. As células foram semeadas durante 48 h antes da adição de drogas. Oito concentrações diferentes foram usadas por droga variando entre 5 uM a 100 uM (5-FU, L-OHP) e entre 2,5 nM e 80 nm, (BEZ235), respectivamente. As células foram incubadas com as drogas durante 96 horas. Para determinar a viabilidade das células, 20 uL de azul de Alamar foi adicionado em cada poço durante 6 h antes da leitura das placas utilizando Fluoroskan Ascent FL. Todos os ensaios foram replicados de sensibilidade aos fármacos, pelo menos, duas vezes e seis poços foram semeadas a cada concentração de fármaco.

uma leitura média RFU foi feita para cada concentração de fármaco e a viabilidade celular foi calculada como uma percentagem do controlo não tratado. As barras de erro foram calculados usando o desvio padrão correlacionado dos meios. O IC

50 para 5-FU, L-OHP e BEZ235 foram determinados utilizando o pacote XLfit 5.0 software (Solutions ID Negócios, UK). Nenhuma extrapolação foi realizada na definição do IC

50 valores e valores aberrantes foram calculados como tendo um nível de confiança superior a 0,05.

ADN, ARN, e proteína extracção

O ADN genómico foi extraído a partir de cada linha celular utilizando DNeasy Blood and Tissue kit (Qiagen, N ° de Cat 69504) de acordo com as instruções do fabricante. As concentrações de DNA foram verificados usando o espectrofotômetro micro-volumes NanoDrop 2000 (Thermo Scientific). A pureza do ADN foi considerado como satisfatório maior do que ou igual a uma proporção de 1,8 260/280, assegurando contaminação mínima de proteína da amostra. A qualidade das amostras de ADN foi adicionalmente testada usando electroforese em gel de agarose. Após a electroforese, o gel foi cuidadosamente removido e as bandas de ADN foram visualizadas usando o sistema de documentação de gel.

O ARN total foi extraído das linhas celulares, em duplicado, utilizando o kit RNeasy Limpeza MinElute (Qiagen, Cat. No. 74204 ) e miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Cat. n. 217004). A concentração de ARN foi verificada usando o espectrofotómetro NanoDrop 2000. pureza satisfatória de ARN foi considerada como uma razão de aproximadamente 2,0 260/230.

foram preparados lisados ​​de proteína quando as linhas de células foram de aproximadamente 80% confluentes, como descrito em detalhe noutro local [20]. A concentração de proteína dos lisados ​​foi determinada através do ensaio de ácido bicincon�ico (BCA) (Sigma-Aldrich, cat. Nº. C2284-25ML, B9643-1L Cat.No.).

KRAS

foram analisados ​​análise de mutação pelo seqüenciamento Sanger

mutações Hotspot no códon 12 e 13. O conjunto de primers foi projetado usando Primer Premier

® software V6.0 (PREMIER Biosoft International). As sequências dos iniciadores (5 ‘para 3’) para

KRAS

01 foram os seguintes: GGT ACT GGT GGA GTA TTT GAT AGT GT (para a frente) e TGA ATT AGC TGT ATC GTC AAG GCA CT (reverso).

KRAS

amplificação exão 2 foi realizado usando o HotStar Hi Fidelity Polymerase Kit (Qiagen Qualidade

®, cat. N. 202602). A reacção de PCR foi realizada no motor de ADN Opticon 2 Real-Time Cycler (GMI, Inc). O tamanho esperado do produto de PCR foi confirmada pela presença de uma única banda com o peso molecular apropriado. Sanger seqüenciamento foi realizado na Unidade de Genética Humana do Conselho de Pesquisa Médica (MRC-HGU), Edimburgo. Os produtos foram sequenciados utilizando o ABI Prism

® 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Hitachi) e os dados foram analisados ​​utilizando software Mutation Surveyor

® DNA Variant Analysis V3.97.

analisa Microarray

matriz hibridização genômica comparativa.

hibridização genômica comparativa (CGH) foi realizada utilizando o microarray NimbleGen (Roche). rotulagem da amostra foi realizada com o NimbleGen de duas cores de DNA Labeling Kit (Roche, Cat. no. 06 370 250 001). A hibridação foi realizada em MRC-HGU, Edimburgo utilizando um NimbleGen hibridação Kit (Roche, Cat. No. 05 583 683 001), NimbleGen Amostra de Seguimento Control Kit (Roche, Cat. No. 05 223 512 001) e duas CGH Humano 12 x 135K todo o genoma Tiling Arrays V3.0 (Roche, cat. nº. 05 520 878 001). NimbleScan software foi utilizado para gerar os arquivos de relatório par utilizados para análise do número de cópia dos dados. Os dados foram depositados no Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (NCBI) Omnibus Gene Expression com o número de acesso GSE72296.

perfil de expressão gênica.

Três conjuntos de amostras de RNA foram preparados para Illumina

® Genome Gene Whole Expression Profiling, onde 48.804 transcritos por amostra foram gerados. Os três conjuntos consistiu de dois conjuntos de repetições biológicas e um conjunto de réplicas técnicas. Todas as amostras de RNA foram diluídas até uma concentração de 500 ng /11μl. A Illumina

® TotalPrep

™ Kit RNA amplificação (Ambion

®, cat. Nº. AMIL1791) foi usado para gerar biotinilado, amplificado RNA de hibridação com a Illumina

® Humano HT-12 v4. 0 BeadChip. Antes de avançar com a preparação das amostras de RNA para análise de microarray, a integridade do RNA foi ainda avaliado com a Agilent

® 2100 Bioanalyzer usando o Agilent

® RNA 6000 Nano Kit (Agilent, cat. Nº. 5067-1511) . foram consideradas as amostras com uma integridade Número RNA (RIN) de 7 ou melhor aceitável para hibridação.

As amostras foram analisadas no Centro de Pesquisa Clínica Wellcome Trust, Edimburgo (Gene Expression Project-CRF E11960), onde foram diluído a uma concentração de 150 ng /mL e hibridizadas em três humanas HT-12 de expressão V4 matrizes BeadChip. Duas repetições técnicas foram hibridizados em cada matriz para servir como um controle de qualidade interno. As amostras foram hibridizados aleatoriamente ao longo dos três Illumina

® HumanHT-12V4 matrizes Expressão BeadChip.

Pós-hibridação, as matrizes foram digitalizados utilizando o Illumina HiScan

® Platform (Illumina

®, cat. nº. SY-103-1001). Os arquivos de dados BeadArray foram exportados do software de digitalização da Illumina e importados para o módulo do software GenomeStudio expressão gênica (Illumina

®), onde, posteriormente, os arquivos de dados foram transformados em arquivos de tabulação delimitado. Os dados foram depositados no Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (NCBI) Gene Expression Omnibus com o número de acesso GSE72544 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE72544).

arrays de proteínas de fase reversa

de fase reversa arrays de proteínas (RPPA) são uma técnica de médio rendimento que permite o rastreio de amostras com um grande painel de proteínas de interesse em um tempo relativamente curto , enquanto utilizando quantidades mínimas de amostra e ambos os anticorpos [21]. As amostras de proteínas desnaturadas e reduzidas das amostras de 15 CRC foram vistos em triplicado para cada bloco de um 2-Pad RÁPIDO

® nitrocelulose revestida lâmina de vidro (Whatman Ltd., cat. Nº. 10.485.317) usando um Biorobotics MicroGrid MG II Biobank (Isogen Life Science). Subsequentemente, eles foram sondadas com sucesso com um painel de 31 optimizado, em casa validado, total e anticorpos fosfo- como previamente descrito (Tabela S2) [20]. Estes anticorpos foram seleccionados para alvejar proteínas-chave envolvidas na proliferação e sobrevivência celular, invasão, metástase, angiogénese, danos no ADN, e apoptose foram optimizado e validado através de Western Blotting. As manchas RPPA foram quantificados utilizando MicroVigene

™ software RPPA Analysis Module (VigeneTech Inc.). Os dados foram analisados ​​como descrito anteriormente [22].

As manchas RPPA foram quantificados utilizando MicroVigene

™ software RPPA Analysis Module (VigeneTech Inc.).

Análise

Dados

análise de dados genômicos.

Os dados de sequenciamento Sanger foram analisados ​​utilizando Mutation Surveyor

® DNA Variant Analysis Software V3.97 (soft Genetics

®, EUA). Os arquivos de dados brutos .ab1 gerado pela ABI Prism

® 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Hitachi) foram importados para o software e as configurações de análise padrão foram aplicados. Os arquivos de anotação GenBank foram automaticamente baixados e os arquivos de referência utilizados para a detecção de mutações foram automaticamente sintetizados.

Dados aCGH foram analisados ​​utilizando Partek

® Genomic Suíte

™ versão 6.6 (Partek Inc.). Os dados foram inicialmente normalizados utilizando Loess Normalização e Segmentação algoritmo de Genomic foi utilizado para analisar as amplificações número de cópias e exclusões. A segmentação costume parâmetros foram como se segue: os marcadores genómicos mínimos foi de 10, o valor de p era de 0,001, e a relação sinal-ruído foi de 0,03. A região foi reportado como perdido se o rácio de número de cópias log2 estava abaixo de -0,3 e ganhou, se a relação do número de cópias de log 2 foi superior a 0,15. Três listas região diferentes foram criados: (1) as regiões que foram obtidos em sete ou mais linhas celulares; (2) As regiões excluído em sete ou mais linhas celulares; (3) os que contêm as maiores amplificações, isto é, o rácio de log2 igual ou superior a 1,0 (equivalente a um número de cópias de 2). Além disso, o agrupamento segmentação genoma foi realizada utilizando distância euclidiana e ligação média. A análise do número de cópias foi realizado no cromossomo 1 no cromossomo 22 e excluídos os dois cromossomos sexuais.

análise de dados Transcriptoma.

O arquivo de perfil gene amostra gerada a partir da análise de expressão gênica foi quantil normalizado e filtrada para essas sondas em que a detecção de p-valor ≤0.05. Os dados foram então transformadas e log2 dizer centrado para se obter os valores relativos entre as linhas de células. O arquivo de perfil gene amostra foi então anotada usando Hg18 antes de realizar a análise diferencial de expressão gênica (DGEA).

O DGEA foi realizada utilizando ArrayMining, um pacote de software de mineração de dados on-line microarray [23]. Expressão diferencial de genes foi realizada através da análise de SAM para a lista de genes diferencialmente expressos em relação à resposta ao tratamento. Três diferentes análises foram realizadas: (1) 5-FU altamente linhas celulares sensíveis

vs

. linhas de células menos sensíveis 5-FU, onde as linhas celulares altamente sensíveis foram definidas como tendo um IC

50 ≤ 30 �; (2) L-OHP altamente linhas celulares sensíveis

vs

. linhas de células menos sensíveis L-OHP, onde as linhas celulares altamente sensíveis foram definidas como tendo um IC

50 ≤ 10 �; (3) linhas de células sensíveis BEZ235

vs

. linhas de células insensíveis BEZ235, onde as linhas de células sensíveis foram definidas como tendo um

50 80nm.

A interpretação dos dados foi realizada utilizando Clustering anotação funcional em recursos de bioinformática DAVID [24].

Integração das regiões frequentemente amplificados com dados de expressão de genes.

A expressão do gene dados para os genes localizados nas regiões frequentemente obtidos foi filtrado para fora. Usando coeficientes de correlação de Pearson com correção de Bonferroni, foi gerada uma lista de genes que tinha uma correlação significativa entre o valor do número de cópias log2 e expressão gênica. Os dados de expressão gênica de linhagens de células foram analisados ​​em relação à resposta ao tratamento utilizando o teste Mann-Whitney usando GraphPad Prism 6.

análise de dados proteômica.

Os dados gerados a partir de RPPA foram normalizados utilizando Cluster 3.0 , uma ferramenta de agrupamento de código aberto [25]. Os dados foram log-transformados, significa centrado em Cluster 3.0, e agrupados por correlação de centralização e articulação média usando MeV 4.8 [26]. resultados RPPA para o painel de 15 CRC foram analisados ​​em relação à resposta ao tratamento utilizando o teste Mann Whitney usando GraphPad Prism 6.

Tissue microarray (TMA), análise quantitativa automatizada (AQUA) e FISH

hematoxilina Cinco micron e lâminas coradas-eosina foram preparados a partir dos blocos FFPE, e as áreas de tumor foram marcados por um patologista e uma investigação técnico treinado. Após o exame histopatológico, 118 casos foram escolhidos para fora do grupo original e uma tissue microarray (TMA) foi construído por um técnico qualificado. Quatro réplicas biológicas (TMA000034A-D) foram construídas como descrito em detalhe noutro local [27] e cortado em secções de 5um usando um micrótomo e montadas em lâminas de vidro. parâmetros clínicos e patológicos desta coorte estão resumidos na Tabela S1.

A expressão de proteínas de TRIB1 foi avaliada com anticorpo policlonal de coelho anti-TRIB1 no CRC TMA usando Automated análise quantitativa (AQUA), descrito em detalhes em outros lugares [28 , 29]. TRIB1 expressão em ambos os compartimentos nucleares e citoplasmáticos foi subsequentemente correlacionada com outras proteínas previamente medidos nesta coorte. expressão TRIB1 também foi investigado em relação à sobrevida do paciente, conforme descrito abaixo.

TRIB1

e

MYC

amplificação na coorte de pacientes CRC foram investigadas através de fluorescência

em situ

hibridação (FISH). A sonda /CEN8p MYC foi comprado de Abnova (cat. Nº. FG0065) ea sonda /CEN8p TRIB1 foi projetado por Abnova. O tempo de tratamento com protease foi variada para optimizar a digestão e garantir uma boa qualidade de hibridação. A visualização foi realizada utilizando DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindole-2-cloridrato de (Abnova) para corar os núcleos.

Ready-to-uso dual-sondas marcadas para

MYC e

TRIB1

foram adquiridos de Abnova. A sonda FISH MYC /CEN8p consistiu de um 160kb ~

MYC

sonda localizado na 8q24.12-q24.13 com um fluoróforo Texas Red juntamente com um ~ 520kb sonda CEN8p localizado na 8p11.21 com um fluoróforo FITC. A /sonda FISH CEN8p TRIB1 consistiu de um 260kb ~

sonda TRIB1

localizado na 8q24.13 com um fluoróforo Texas Red juntamente com uma sonda CEN8p 520kb ~ localizado na 8p11.21 com um fluoróforo FITC.

pontuação foi realizada por um técnico treinado e um consultor patologista. As lâminas foram registados com um microscópio fluorescente utilizando Leica DMLB lente de imersão em óleo de 100X. foram utilizados os critérios Colorado Scoring [ ,,,0],30] para marcar os slides TMA. um máximo de vinte núcleos por núcleo foram marcados na maioria dos casos, embora em alguns casos um mínimo de dez núcleos foram marcados devido a não ter vinte núcleos contáveis. A soma dos fluoróforos vermelhos e verdes foi anotado para cada núcleo, e o resultado final consistiu de a razão entre o fluoróforo vermelho para o fluoróforo verde. PEIXES pontuação inferior a 1,8 foram interpretados como negativos [31].

Análise estatística

dados de expressão de proteína TRIB1 gerados a partir da análise AQUA foram correlacionados com AKT, caspase 3, ciclina B1, ERK, Ki67, MYC, S6, PTEN, pAKT, perk, pHistone H3, pMEK e PS6 expressão da proteína. A análise estatística foi realizada utilizando correlações de Pearson, e p-valores foram ajustados para testes múltiplos utilizando a correção de Bonferroni. Um programa de código aberto TMA Navigator (https://www.tmanavigator.org/) foi usado para análise estatística. A análise de sobrevida para o

TRIB1

e

MYC

amplificação na coorte CRC foi realizada utilizando GraphPad Prism 6.

Resultados

análise mutacional do gene único é insuficiente para a estratificação de tumores no que diz respeito à terapia

Após o tratamento com 5-fluorouracilo (5-FU) durante 96 h, treze linhas celulares de CRC apresentaram diferentes graus de sensibilidade quando tratados com as concentrações de fármaco variando entre 2.5μM a 100 uM ( Fig 1A). Duas linhas celulares de CRC (Colo320DM, T84) eram insensíveis ao 5-FU, a uma concentração de 100 uM. O IC

50 valores para 5-FU variou de 3,1 a 100 � com uma mediana de 19.6μM. As linhas de células mais sensíveis foram HT29, LS411N e HCT116. DLD-1, HCT116, HCT116p53 – /-, SW48, e LoVo são relatados para ser deficiente reparação de emparelhamentos incorrectos [32]. Este perfil do estado de reparo incompatível não se correlacionou com 5-FU sensibilidade (p = 0,713; Mann-Whitney U). Contrário a um estudo realizado por Bracht e colegas [33]

A. plot Cachoeira para o

50 valores 5-fluorouracil IC (m). lote B. Cachoeira por

valores oxaliplatina IC50 (�). lote C. Cachoeira por BEZ235 IC

valores 50 (Nm). D. agrupamento hierárquico não supervisionado para os IC

50 valores para 5-FU, L-OHP e BEZ235 através da correlação de Pearson com ligação completa.

Embora um número de

in vitro

estudos têm sugerido que

deficiência TP53

contribui para a resistência às drogas [34], não conseguimos ver uma associação (p = 0,238; Mann-Whitney U). HT29, LS411N, p53 HCT116 – /-, SW837, NCI H508, NCI H716 são

TP53

deficiente (https://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/), mas eles ainda eram sensíveis ao 5-FU no presente estudo. Mariadason et ai., No entanto, relatada nenhuma diferença na apoptose induzida por 5-FU em linhas celulares de tipo selvagem e mutante p53 [35].

Depois de tratamento com oxaliplatina (L-OHP) durante 96 h, a CRC linhas celulares mostraram vários graus de sensibilidade quando tratados com concentrações crescentes de L-OHP variando de 2.5μM a 100 uM (Fig 1B). O

50 valores IC para L-OHP variou de 3,0 a 31.1μM, com mediana de 8,0 mM, demonstrando uma gama de dez vezes de sensibilidade. As linhas de células mais sensíveis foram HT29, LS411N e SW837, enquanto os menos sensíveis foram Colo320DM, NCI H716, e Colo201. foi observada quando se compara L-OHP IC valores

50 entre linhas celulares dMMR e linhas celulares pMMR, o que está de acordo com um estudo semelhante por Fink et al, sem significância estatística (Mann Whitney U p = 0,462). . [36]

Não houve associação entre o estado de p53 e L-OHP IC

50 valores (p = 0,187; Mann Whitney U Test), em contraste com um relatório anterior [37]. No entanto, um estudo recente realizado em 51 pacientes com CCR avançado concluiu que

estado mutacional TP53

não foi associada com benefício de um tratamento à base de oxaliplatina de primeira linha [38].

Sete linhas celulares de CRC foram sensíveis e oito linhas celulares de CRC eram insensíveis ao tratamento com várias concentrações (2,5 nM) e 80nm de BEZ235 durante 96 h (Fig 1C). O IC

50 valores para BEZ235 variou de 13,4 a 80 nm, com as linhas de células sensíveis com uma concentração média de 23.6nM sensível. As linhas de células mais sensíveis foram HT29, Colo201, e NCI H716, NCI H508, enquanto, T84, SW48, SW480, Colo320DM, HCT116, HCT116 p53 – /-, e LoVo eram insensíveis a uma concentração de 80nm. Não foi observada diferença estatisticamente significativa (p = 0,346; o teste de Mann-Whitney U) entre o IC

50 valores para o tratamento BEZ235 e

PIK3CA

mutantes e selvagens grupos do tipo. Todos os

PI3KCA

linhas de células mutantes tinha tanto um

BRAF

ou um

co-mutação KRAS

. Não existem dados COSMIC estava disponível para

mutações MTOR

nestas linhas celulares (https://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/). Serra et al. estabeleceu que BEZ235 proliferação em todas as linhas de células de câncer de 21 utilizados em seu estudo, preso independente da PI3K estado de mutação caminho [39], e que linhas de células com um

BRAF

ou

KRAS

mutação ou

EGFR

amplificação foram ligeiramente menos sensíveis a BEZ235 comparação com as outras linhas de células [39].

das 15 linhas celulares de CRC, oito linhas celulares possuíam

KRAS

exão 2 mutações . O DLD-1, HCT116, HCT116 p53 – /-, e linhas de células LoVo tinha um 5574 G A substituição consistente com uma mutação G13D missense; As linhas de células SW480 SK-CO-1 e tinha um 5571 G T substituição consistente com uma mutação G12V missense; SW837 tinha um 5570 G T substituição consistente com uma mutação G12C; e tinha um T84 5574 G A substituição consistente com uma mutação G13D. Isto está de acordo com os dados de sequenciamento publicados e dados no banco de dados COSMIC (https://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/). Não houve diferenças estatisticamente significativas na resposta ao 5-FU, L-OHP e BEZ235 com respeito a

KRAS

estado mutacional (p = 0,98, p = 0,60 e p = 0,17, respectivamente).

agrupamento hierárquico não supervisionado para o IC

50 valores para 5-FU, L-OHP e BEZ235 meio de correlações de Pearson com ligação completa mostrou que as linhas celulares não agrupar de acordo com qualquer mutação particular. Houve variabilidade em resposta aos três tratamentos diferentes (Fig 1D).

regiões cromossômicas frequentemente ganhos e perdidos no cancro colorectal linhas celulares

O painel de linhas celulares foi próxima avaliada por aCGH para identificar regiões cromossômicas comuns de ganho e perda. Vinte e quatro regiões foram frequentemente adquirida em pelo menos 7/15 linhas celulares de CRC. ganhos frequentes foram observados em 2p, 3T, 5p, 7p, 7q, 8q, 12p, 13q, 14q e 17q (Fig 2) (Tabela 1). Por outro lado, um total de 14 regiões foram perdidos em, pelo menos, 7/15 linhas celulares de CRC (Tabela 2). perdas frequentes foram observados em 2T, 3p, 5q, 8p, 9p, 14q, 18q e 20p (Fig 2). Estas regiões de ganho e perda foram semelhantes aos descritos na literatura [32, 40-44].

agrupamento hierárquico dos dados de número de cópias segmentadas utilizando ligação média distância euclidiana resultou em dois grupos principais: um cluster contido NCI H716, enquanto o outro conjunto continham as outras 14 linhas de células (Fig 3). Um dos sub-grupos continha HT29, SW48, LS411N, LoVo, HCT116, e HCT116p53 – /-. HCT116, HCT116p53 – /-, SW48, e LoVo são quase diplóides e conhecido por ter mutações em genes MMR

MLH1

e

MSH2

[45, 46]. A outra linha de células quase diplóide, DLD-1, também agrupadas separadamente. Esta linha celular é MMR deficiente em MSH6 [47].

Expressão

gene diferencial com relação a sensibilidade de drogas

Os genes diferencialmente expressos em relação ao 5-FU sensibilidade estão listadas na Tabela S3 e representado num mapa de pontos na figura 4A. anotação funcional usando DAVID [24] revelou que estes genes estavam envolvidos principalmente no ciclo celular (

TAF2

,

chfr

,

CCND2

,

OSGIN2

,

TERF1

,

TBRG4

), adesão focal (

ABCB1

,

SH3KBP1

,

EBAG9

), apoptose (

SHRKBP1

,

EBAG9

,

TERF1

,

TBRG4

), e regulação da transcrição (

LASS2

,

LMCD1

,

MAF1

,

TAF2

,

THAP11

,

CHURC1

,

MED14

,

PIAS3

,

PURB

,

TERF1

,

ZNF239

,

ZNF7

). vias KEGG importantes associados com o modo 5-FU de ação e, posteriormente enriquecido na lista de origem a partir deste estudo incluiu metabolismo das purinas (

NT5C2

,

POLR2J2

), o metabolismo pirimidina (

NT5C2

,

POLR2J2

), o metabolismo de fármacos (

GSTO2

), transportadores ABC (

ABCB1

) e fosforilação oxidativa (

NDUFA9

).

A. Um mapa de calor que descreve a análise SAM para genes diferencialmente expressos entre 5-FU linhas de células sensíveis e menos sensíveis CRC; B. Um mapa de calor que descreve a análise SAM para os genes expressos diferencialmente entre linhas celulares L-OHP sensíveis e menos sensíveis CRC; C. Um mapa de calor que descreve a análise SAM para genes diferencialmente expressos entre linhas celulares BEZ235 sensíveis e menos sensíveis CRC.

Os genes diferencialmente expressos em relação à sensibilidade L-OHP estavam envolvidos com ligação ao DNA (