Abstract

difusa do tipo tumores sólidos são frequentemente compostos por uma elevada proporção de células cancerosas proliferam raramente (ou seja, dormentes), fortemente, indicando o envolvimento de células-tronco cancerosas (CSCs) Embora o câncer gástrico difuso-tipo (GC) os pacientes têm um prognóstico pobre devido ao desenvolvimento de alta frequente de disseminação peritoneal (PD), é de conhecimento limitado que o CSCs associado-PD e eficácia de CSC- segmentação em terapia de tipo difuso GC. Neste estudo, nós estabelecemos linhas celulares GC altamente metastáticas por

in vivo

selecção projetado para o enriquecimento de células GC associada à DP. Por análise de microarray, encontramos CXC tipo receptor de quimiocinas 4 (CXCR4) pode ser um novo marcador para CSCs altamente metastáticas, uma vez que as células CXCR4-positivos podem crescer ancoragem-independente, iniciar tumores em camundongos, ser resistente ao fármaco citotóxico, e produzir filha diferenciada células. Em amostras clínicas, estas células CXCR4-positivos foram encontrados a partir não só fase tardia de metástase (ascite) acumulados mas também fase anterior (lavagens peritoneal). Além disso, o tratamento com factor de crescimento transformante-β aumentou o efeito anti-cancro do docetaxel através da indução da divisão celular diferenciação celular /assimétrico das CSCs gástricas CXCR4-positivos, mesmo em um estado dormente. Portanto, indutores de diferenciação promissora para a obtenção do resultado terapêutico máximo de drogas anti-câncer atualmente disponíveis através do re-ciclismo de CSCs

Citation:. Fujita T, Chiwaki F, Takahashi Ru, Aoyagi K, Yanagihara K, Nishimura T, et al. (2015) Identificação e Caracterização de CXCR4-positiva Câncer Gástrico Stem Cells. PLoS ONE 10 (6): e0130808. doi: 10.1371 /journal.pone.0130808

editor: Masaharu Seno, Universidade de Okayama, Japão

Recebido: 18 de fevereiro de 2015; Aceito: 25 de maio de 2015; Publicação: 25 de junho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Fujita et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação. Todos os dados de microarranjos foram depositados em um banco de dados compatível Miame, GEO; número de acesso GSE53276

Financiamento:. Este trabalho foi financiado em parte pelo Instituto Nacional de Biomedical Inovação (para a Pesquisa Avançada para produtos médicos Programa Mining ID10-41), o Ministério da Saúde, Trabalho e Bem-estar do Japão (para o Terceiro abrangente estratégia de 10 anos para o cancro Controle H22-007), Fundo de Investigação e Desenvolvimento National Cancer Center (25-a-6, 26-a-3). Drs T Fujita, M Tamaoki e T Nishimura são os destinatários de uma pesquisa Residente bolsa da Fundação para a Promoção da Cancer Research no Japão

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico (GC) é uma das principais causas de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo. Histopatologicamente, GC podem ser classificados em duas categorias principais: tipo intestinal e difuso-tipo. Tipo intestinal GC predomina em áreas geográficas de alto risco e se desenvolve através de algumas etapas sequenciais, incluindo

Helicobacter pylori

(

H

.

pylori

) -associated gastrite atrófica, metaplasia intestinal (IM), e displasia. Por outro lado, GC difusa do tipo, que responde por metade de todos os pacientes do GC, tem uma ampla distribuição geográfica e desenvolve mesmo a partir de

H

.

pylori

-livre, mucosa gástrica morfologicamente normais, sem gastrite atrófica ou IM, e do tipo difuso GC pode ser diferente do tipo intestinal, tanto genética e fenotipicamente [1-5]. Ao contrário da diminuição da incidência do tipo intestinal, a prevalência do tipo difuso é declaradamente aumentando em todo o mundo [6]. O prognóstico para pacientes GC avançada do tipo difuso manteve-se pobre ao longo da última década devido a uma elevada taxa de difusão peritoneal (DP) (78%) comparada com a de tipo intestinal (45%) [7]. Em particular, pacientes com tipo Bormann IV GC tem um extremamente mau prognóstico, mesmo se eles receberam tratamento multidisciplinar [8]. Portanto, dirigindo-PD é uma questão urgente para a melhoria no prognóstico de pacientes do tipo difuso GC.

difusa do tipo GCs são tipicamente caracterizados por uma extensa fibrose estromal com má vascularização e proliferativa raros (

i

.

e

.) células cancerosas dormentes, o que leva a uma resistência terapêutica substancial. Do ponto de vista da quimioterapia, transformando β do factor de crescimento (TGF-p) foi pensado para contribuir para a progressão através agressivo transição epitelial-mesenquimatosa e pela indução de fibrose [9]. No entanto, o TGF-β também inibe a proliferação celular, induz a apoptose, e medeia a diferenciação de células epiteliais, sugerindo que os componentes das vias de sinalização de TGF-β possuem actividade supressora de tumor em tumores epiteliais [10, 11]. Embora a acumular evidência tem demonstrado o papel crítico de TGF-β em células estaminais cancro (CSC) biologia existe informação limitada sobre o seu papel em GC do tipo difuso.

Tem sido relatado que cada população de células tumorais mostram heterogeneidade funcional distinta caracterizada pela proliferação e capacidade de diferenciação em vários tipos de tumores [12]. Para ter em conta esta heterogeneidade do tumor, dois modelos foram propostos: o modelo clonal evolução [13] e o modelo de CSC [14]. O último modelo tem recebido grande atenção, uma vez que fornece uma explicação razoável para a resistência à quimioterapia convencional e radioterapia, em que CSCs quiescentes ou slow-ciclismo sobreviver, e resulta em eventual reincidência do tumor [15-17]. Portanto, estratégias terapêuticas para atingir as CSCs são fundamentais para erradicar a doença residual e para prevenir a recorrência de não só GC, mas também outros tipos de câncer. Além disso, com conhecimentos correntes sobre os mecanismos celulares da carcinogénese, o potencial metastático de células tumorais é atribuída a CSCs, que podem iniciar a formação do tumor por clonagem em locais distantes [18 19]. Embora um número de moléculas da superfície celular têm sido propostos como marcadores CSC em uma grande variedade de malignidades humanas, não houve nenhuma identificação do marcador associado para os CSCs-PD em GC [20-23]. Para identificar tais marcadores, considerou-se a noção de que funcionalmente e geneticamente heterogéneas tumores têm mecanismos comuns e intrínsecas de manutenção tumor de acordo com o contexto de uma determinada microambiente. Assim, a hipótese de que CSCs deve ser definido funcionalmente por ensaios bem-validado, como o

in vivo

transplante. Em tipo difuso GC, inicialmente focada na colonização específica do peritônio de células e enriqueceu as CSCs associada à DP pelo

In vivo

seleções repetitivas [24, 25]. Aqui, nós achamos CXC tipo de receptor de quimiocina 4 (CXCR4) pode ser um marcador para os CSCs gástricas associadas com a DP e demonstraram que o TGF-β aumenta a eficácia de drogas anti-tumorais através de indução da divisão de células de diferenciação celular /assimétrico no CXCR4

+ população CSC mesmo em um estado dormente.

Materiais e Métodos

amostras clínicas

as amostras clínicas foram fornecidas pelo Hospital Cancer Center Nacional (Tóquio, Japão) após a obtenção consentimento informado por escrito de cada paciente e aprovação do Cancer Center Institutional Review Board Nacional (ID: 15-44, 2012-181, 2010-031).

As linhas celulares e culturas primárias

Um ser humano linha celular de GC, HSC-60 foi estabelecida por um colaborador utilizando o procedimento como descrito anteriormente [26]. Uma linha de células altamente metastáticas-peritoneal, 60As6 foi estabelecida a partir de HSC-60 utilizando o implante de tecido ortotópico em murganhos SCID SCID /brevemente como se segue: o tumor xenoenxerto de células HSC-60 foi transplantado para a parede gástrica de um rato. Nós repetido seis ciclos de células de tumor ascítico de colheita e da inoculação ortotópico destas células. Estas duas linhas de células foram mantidas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal de vitelo. Nós também estabeleceu duas linhas de células que expressam luciferase (HSC-60Luc e 60As6Luc). Seis outras linhas de células derivadas de HSC (GC-39, 44-HSC, 44As3, HSC-58, 58As9, e Kato III) também foram mantidos sob as mesmas condições. Destes seis, HSC-39, 44-HSC, 44As3, HSC-58, e 58As9 foram estabelecidas pelo processo acima descrito [27, 28], e KATO III foi obtido a partir de American Type Culture Collection. Para culturas primárias, as células foram recolhidas a partir de lavagens peritoneais dos pacientes e ascite (NSC-16C, NSC-20C, e NSC-22C) e cultivadas num meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal de vitelo.

microarray Analysis

o ARN total de 60As6, 60As6Luc, HSC-60, e as células HSC-60Luc foi isolado por suspensão das células em tampão de lise ISOGEN (Nippon Gene, Toyama, Japão), seguido por precipitação com isopropanol. Realizamos microarray analisa duas vezes usando Genoma Humano U133 mais 2,0 Array (Affymetrix, Santa Clara, CA). Os procedimentos foram conduzidos de acordo com os protocolos dos fornecedores. As matrizes foram digitalizadas com um scanner GeneChip 3000 (Affymetrix), e os dados foram analisados ​​por Microarray Suite versão 5.0 com as configurações de análise de Affymetrix padrão e escalonamento global como método de normalização. A intensidade alvo média aparada de cada matriz foi arbitrariamente definida para 1000. Todos os dados de microarranjos foram depositados em um banco de dados compatível Miame, GEO; número de acesso GSE53276. Por uma alteração de 2 vezes, 684 genes foram seleccionados como genes específicos para células 60As6 e 60As6Luc, e 1150 genes foram seleccionadas para células HSC-60 e HSC-60Luc.

As experiências com animais

Seis C.B17 fêmea /ICR-SCID (SCID /SCID) -week de idade (CLEA Japan, Japão) foram criados na sala com uma temperatura de 12 h ciclo de luz por dia /escuro. Os ratos foram mantidos sob condições específicas livres de patógenos e desde estéreis alimentos, água, e gaiolas. 1 × 10

4 para 1 × 10

6 das células cancerosas foram suspensos com 1 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e depois injectado na cavidade abdominal através do uso de uma agulha de 26 1/2-calibre. Os ratos foram pesados ​​e medidos semanalmente. critérios de endpoint crueldade incluídos acumulação significativa de ascite abdominais, dispneia, piloereção, anemia, ou perda de peso superior a 10% do peso inicial. Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com as diretrizes éticas da Associação Internacional para o Estudo da Dor e foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal do Centro Nacional do Câncer. Foram feitos esforços para minimizar o número e qualquer sofrimento dos animais utilizados nas experiências.

RT-PCR

O ARN total foi isolado por suspensão das células num tampão de lise ISOGEN seguido de precipitação com isopropanol. Semi-RT-PCR quantitativa foi realizada dentro da faixa linear de 25 a 30 ciclos por

MUC5AC

,

CXCR4

,

CXCR7

,

CXCL12

,

LGR5

,

TGFBR1

,

TGFBR2

, e

ACTB

utilizando os seguintes iniciadores: 5′-ACATGTGTACCTGCCTCTCT-3 ‘e 5’-GTTGTCCACATGGCTGTT-3 “para

MUC5AC

, 5′-CCACTGAGTCTGAGTCTTCA-3 ‘e 5′-AGACTGTACACTGTAGGTGC-3’ para

CXCR4

, 5′-CGGAGTACTCTGCCTTGGAG-3 ‘e 5′-ACAGCTGCGTCATCAAGAGA-3’ para

CXCR7

, 5′-GAAGCTTCCCTGACTCATTCT-3 ‘e 5′-AAAGCACGCTGCGTATAGGA-3’ para

CXCL12

, 5′-TGCTCTTCACCAACTGCATC-3 ‘e 5′-CTCAGGCTCACCAGATCCTC-3’ para

LGR5

, 5′-GCATGATGGACCTGTCTACA-3 ‘e 5′-GCTTCATATCCTGGTGATGTC-3’ para

TGFBR1

, 5′-CAAAGGTCCCATTTGCAGTT-3 ‘e 5′-GAGACCTTCCACCATCCAAA-3’ para

TGFBR2

, e 5′-GAAGTCCCTTGCCATCCTAA-3 ‘e 5′-GCACGAAGGCTCATCATTCA-3’ para

ACTB

.

imunocitoqu�ica

imunocitoquímica fluorescente indireta foi realizada para CXCR4, MUC5AC, e Smad2 /3 em células crescidas em lâminas de câmara 4 poços. As células foram fixadas em paraformaldeído a 4% à temperatura ambiente durante 20 min. Depois de três vezes a lavagem com PBS (-), que foram incubadas com o anticorpo monoclonal CXCR4 anti-humano (R D Systems, Minneapolis, MN), anticorpo MUC5AC anti-humano (Santa Cruz Bioquímica, Santa Cruz, CA), ou anti- Smad2 humano /anticorpo de 3 (BD ​​Biosciences, Bedford, MA) seguido de incubação com uma diluição de 1: 1000 de anti-rato de burro-Alexa 488-soro conjugado (Invitrogen, Grand Island, NY) durante 1 h à temperatura ambiente. núcleos de células foram coradas com 4 ‘, dicloridrato de 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) (Invitrogen, Carlsbad, CA). Para o ensaio de células de linhagem, classificado única CXCR4

+ pequenas células foram marcadas por CellTracker Green (Invitrogen) para a detecção de células viáveis.

citometria de fluxo e

células 60As6 triagem

celulares (1 × 10

6 células) foram co-incubadas durante 30 min a 4 ° C com os anticorpos seguintes: a APC anti-humano CD184 (CXCR4) (IgG2a, clone 12G5) ou APC de IgG2a de ratinho, de controlo de isotipo k obtido a partir de BioLegend ( San Diego, CA). As células mortas foram marcadas com iodeto de propídio e excluídos da análise. Na separação de células, as subpopulações CXCR4-positivas e CXCR4-negativos foram purificados usando um classificador de células JSAN (Bay Bioscience, Kobe, Japão) e foram analisados ​​por um software, FlowJo (Árvore Star, Inc., Ashland, OR). Para a análise do ciclo celular, as células foram transferidas para um meio isento de soro, durante 5 dias, e subsequentemente recolhidas com 0,05% de tripsina-EDTA, e, em seguida, suspenso em etanol frio a 80%. Após fixação durante a noite a -20 ° C, as amostras foram lavadas em PBS (-) e incubadas em 500 ul de PI /RNase A coloração Buffer (BD Pharmingen, San Diego, CA) por 1 x 10

6 células durante 30 min a temperatura ambiente antes da análise. A citometria de fluxo foi realizada utilizando FACSCalibur (BD, Franklin Lakes, NJ), e analisadas por software, FlowJo.

Anchorage-independente ensaio de crescimento de células

Um ensaio de formação de colónia em agar mole foi realizado utilizando o Kit CytoSelect 96 poços Transformação celular Ensaio (Cell Biolabs, San Diego, CA) seguindo as instruções do fabricante. Resumidamente, 5 x 10

células pequenas 3 CXCR4-positivas ou CXCR4-negativas foram suspensas em DMEM contendo 0,4% de FBS baixo ponto de fusão de agarose e 10% e semeadas em 1% de agarose de baixo ponto de fusão contendo DMEM e FBS a 10%. Após incubação das células durante 5 dias a 37 ° C em 5% de CO

2, as células foram lisadas e detectada com corante CyQUANT GR. A fluorescência da colónia células formadoras foi lido na Multifuncional Microplate Reader (Safire, Tecan, Mannedorf, Swizerland) a excitação /emissão de comprimentos de onda de 485/520 nm.

ensaio de invasão

invasão celular foi determinada utilizando BD BioCoat invasão tumoral Sistema de Ensaio (BD Biosciences) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, 4 × 10

5 60As6 de células com meio isento de soro foram semeadas para dentro da câmara superior do sistema. poços de fundo foram cheios com meios com 10 ng /ml de SDF-1β (Invitrogen, Carlsbad, CA). Após 24 horas de incubação, as células na câmara superior foram removidos e as células que invadiram através da membrana Matrigel foram coradas com corante Diff-Quick (BD Biosciences) e contadas manualmente.

ensaio Caspase

As células 60As6 foram preparados numa placa de 96 poços (5 x 10

3 células /cavidade). O ensaio de caspase 3/7 foi realizada utilizando o Caspase-Glo 3/7 Assay (Promega, Madison, WI), às 24 h após a adição de TGF-β1 recombinante (240-B, R D systems) para a cultura de células em uma concentração de 2 ng /ml.

ensaios de crescimento celular

Para determinar IC

50 valores contra o docetaxel (DOC), ambas as células HSC-60 e 60As6 foram cultivadas na presença de 0-100 nM Doc (Aventis Pharma, Tóquio, Japão) durante 4 dias a 37 ° C em 5% de CO

2, seguido pelo ensaio de MTT convencional. Para validar o tratamento de combinação com doe e TGF-β, todas as células 60As6 e 2 as culturas primárias (NSC-16C e -22C) foi preparado de uma placa de 6 poços (1 × 10

5 células /poço), seguida pela um tratamento com Doc (2,5 nM) e TGF-β1 (0 ou 2 ng /ml) durante 72 h a 37 ° C em 5% de CO

2. As células foram coradas por azul de tripano e contadas com TC20 automatizada celular Contador (Bio-Rad, Hercules, CA).

A análise estatística

Todos os dados foram expressos como a média ± SE e analisados ​​usando o teste t não pareado. O nível aceito de significância foi de

p Art 0,05. SPSS (SPSS, Chicago, IL) foi utilizado para todas as análises estatísticas.

Resultados

diferenças fenotípicas entre parentais HSC-60 células e as células 60As6 Sub-linha altamente tumorigênico

Para abordar o fenómeno do tipo difuso PD associado-GC do ponto de vista da biologia molecular e celular, nós estabelecemos uma linha altamente peritoneal metastático de células, 60As6, a partir de uma linha de células derivadas do tipo difuso GC, HSC-60, através de

in vivo

selecções que consistem de uma inoculação ortotópico de as células tumorais e o isolamento das regiões altamente metastáticas a partir de ascites de ratinhos imunodeficientes [25]. Embora o tempo de duplicação destas duas linhas de células foi comparável (30 h para HSC-60 e 31 h para 60As6)

In vitro

, células 60As6 formados múltiplos nódulos tumorais mais rapidamente após a inoculação intraperitoneal em ratinhos. O tempo médio de sobrevivência foi de 167 dias após a implantação de 5 × 10

6 HSC-60 células, ao passo que a implantação do mesmo número de células 60As6 resultou numa formação notável de ascite de sangue e o tempo médio de sobrevivência de apenas 28 dias. Anchorage-independência pode ser necessária para a sobrevivência de células cancerosas livres no interior da cavidade peritoneal e para a colonização. No ensaio de formação de colónia, células 60As6 formado muito mais em comparação com colónias de HSC-60 células (S1 FIG) que mostram que 60As6 possui uma elevada capacidade de crescimento independente de ancoragem. Nós validou o chemoresistance também conhecido como um grande propriedade de CSCs. As células foram cultivadas na presença de docetaxel (DOC), o qual é um fármaco anti-cancro frequentemente empregue para o tratamento de pacientes de GC. 60As6 mostrou um vezes superior IC 6

50 valor de doe comparada com a de HSC-60 (52 nM e 8,4 nM, respectivamente) (Fig S2). Estes dados indicam que 60As6 ganhou um elevado fenótipo resistente à quimioterapia. Além disso, a morfologia das células HSC-60 foi caracterizado como plano e grande, enquanto que as células de 60As6 foi semi-flutuante e pequena, que é semelhante à morfologia frequentemente observada para os CSCs (S3 FIG). A seguir, analisou a localização jangadas lipídicas utilizando subunidade B da toxina da cólera (CtxB) como um marcador jangada lipídica, uma vez que já foi relatado que os aglomerados de jangadas lipídicas foram enriquecidas em células estaminais hematopoiéticas [29]. Uma acumulação do fluorescente CtxB foi observado para 60As6 células, mas não no HSC-60, sugerindo uma outra propriedade CSC, como para os antigos células (S3 FIG)

.

Para avaliar as diferenças biológicas entre HSC-60 e 60As6 células, foram comparados os perfis de expressão gênica por microarrays análise (S1 Tabela). Down-regulação dos três marcadores de células-diferenciação pit gástrica (

MUC5AC

,

MUC1

, e

TFF1

) e alguns citoqueratinas foram encontrados em 60As6. Por outro lado, vários marcadores de células-tronco (

LY75

,

CD44

,

GPNMB

, e

CXCR4

) foram upregulated nesta linha celular. O perfil de expressão que sugere 60As6 tem um forte fenótipo mesenquimal, que é uma característica das CSCs derivadas de células epiteliais.

investigada a expressão de ARNm de tanto um marcador de diferenciação típico

MUC5AC

[3 , 4] e um receptor de quimiocina-associado metástase

CXCR4

[30] por RT-PCR. De acordo com os resultados de microarrays,

MUC5AC

e

CXCR4

mRNAs mostrou uma expressão mutuamente exclusivos em HSC-60 e 60As6 (Fig 1A). Uma quimiocina SDF-1 codificado por

CXCL12

é conhecido por se ligar o CXCR4 e o seu receptor cognato CXCR7 [30]; no entanto, o mRNA de

CXCL12

e

CXCR7

não foram detectados em qualquer linha de células. A expressão de ambos MUC5AC e CXCR4 também foi confirmada a um nível de proteína por coloração imunocitoquímica (Fig 1B). Assim, estes resultados sugerem que as células HSC-60 abrigar células mais diferenciadas do que as células 60As6, que são compostos principalmente por células indiferenciadas. Tomados em conjunto, todas estas características CSC-como de 60As6 indicam que a subpopulação indiferenciada com elevado tumorigenicidade e resistência aos medicamentos pode ser eficientemente enriquecido a partir de células parentais durante a

In vivo

seleções.

(A ) RT-PCR de

MUC5AC

,

CXCR4

,

CXCR7

, e

CXCL12

numa linha celular GC HSC-60 e sua sublinha 60As6. (B) Imunocitoqu�ica para MUC5AC (painel esquerdo, verde) e CXCR4 (painel direito, verde) em células HSC-60 e 60As6, respectivamente. Os núcleos foram contrastadas com DAPI (azul). barras de escala representam 100 um. (C) análise de citometria de fluxo de CXCR4 na superfície celular em células 60As6. Os painéis internos representam CXCR4

+ pequenas células (I), CXCR4

– pequenas células (II) e CXCR4

– células grandes (III) (Ci). Cada população de células foi separada por FACS a respectiva pureza (Ci-Civ). células imunopositivas para MUC5AC foram observadas em apenas o CXCR4

– fração de células grandes (Civ, painel inferior, verde). barras de escala representam 50 um. (D) Imagens representativas após a cultura

CXCR4 – células pequenas e grandes para 3 dias. barras de escala representam 50 um.

Identificação e caracterização de CSCs gástricas em 60As6 e células de cultura principal

A seguir, examinou o papel de CXCR4 em células GC-tipo difuso de PD. Como mostrado na Fig 1A, o receptor

CXCR4

foi altamente expressa em comparação com 60As6 HSC-60, ao passo que o seu ligando

CXCL12 /SDF1

não estava em ambos. No entanto, é de salientar que este ligando é conhecida por ser expressa em células de mesotélio peritoneal [31] e para funcionar como uma quimiocina para induzir metástases à distância através de uma interacção com as células cancerosas que expressam CXCR4 [30]. Portanto, nós examinamos se CXCR4 pode servir como um marcador para a identificação de CSCs associada à DP. A expressão de CXCR4 nas células 60As6 foi analisado por análise de separação de células activadas por fluorescência (FACS). De acordo com a expressão de CXCR4 e padrão de dispersão para a frente, as células exibiram uma heterogeneidade 60As6 que consiste em três subpopulações diferentes: I. CXCR4

+ células pequenas (15%), II. CXCR4

– pequenas células (65%), e III. CXCR4

– células grandes (20%) (Fig 1CI). As células foram então separadas para cada subpopulação com uma pureza de I: 97%, II: 99%, e III: 54%, respectivamente (Fig 1Cii-1Civ). A baixa pureza triagem das CXCR4

– grande subpopulação de células III foi atribuído à contaminação com CXCR4 agregada

– pequenas células (Fig 1Civ, painel black-box). Entre estes três subpopulações, apenas uma CXCR4

– grande subpopulação de células contidas MUC5AC

+ células diferenciadas (Fig 1Civ, três painéis exteriores). Pelo acompanhamento do crescimento celular em um nível de uma única célula, verificou-se que CXCR4

– pequenas células proliferaram, enquanto o CXCR4

– grandes células não sofrem divisão celular, mesmo 3 dias após cultura (Fig 1D e S4 Fig). Estes achados sugerem que CXCR4

– pequenas células são células amplificadoras transitórias, enquanto o CXCR4

– grandes células são células terminalmente diferenciadas

Depois de classificar os dois subpopulação (I e II), analisamos. qualquer deslocamento da população de células (Fig 2A); após 7 dias de cultura. CXCR4

+ pequenas células correspondentes a subpopulação I gerado si, CXCR4

– pequenas células e CXCR4

– células grandes (11%, 62% e 21%, respectivamente), enquanto CXCR4

– pequenas células correspondentes a subpopulação II foram capazes de dar origem principalmente para si mesmos (80%) com algumas células grandes (17%) e muito poucos

+ células pequenas CXCR4 (2%). Estes resultados sugerem que CXCR4

+ pequenas células têm potencial de diferenciação e produzir CXCR4

– grandes células, possivelmente através de um estágio de CXCR4

-. Pequenas células no esquema de diferenciação celular

(A ) Ambos CXCR4

+ e CXCR4

– células 60As6 foram classificadas por FACS (coluna da esquerda). As células de cada fracção foram cultivadas durante 7 dias e então analisados ​​para os níveis de CXCR4 (coluna da direita) de expressão. (B) Imunocitoqu�ica para MUC5AC (verde) de uma colônia derivado de uma única CXCR4

+ pequena cela. barras de escala representam 50 um. (C) ensaio de células de linhagem com duas cores diferentes.

+ células CXCR4 individuais ordenados pequenos foram coradas pelo anticorpo anti-MUC5AC (vermelho) e CellTracker Green (Invitrogen, verde) e para a detecção de células viáveis ​​durante 7 dias. barras de escala representam 50 um. (D) RT-PCR de

LGR5

em células epiteliais gástricas normais (painel esquerdo), CXCR4

+ células pequenas e CXCR4

– pequenas células (painel direito). microdissecção a laser separa a mucosa gástrica normal em três regiões:. pit, pescoço e glândula

Além disso, a CXCR4

+ pequena célula única produziu uma colónia contendo MUC5AC células diferenciadas

+ depois 7 dias de cultura (Figura 2B). Esta conclusão foi apoiada por um ensaio de células de linhagem combinado com coloração de células vivas e imunocoloração de MUC5AC (Fig 2C). Além disso, o CXCR4

+ pequenas células mostraram expressar um elevado nível de

LGR5

, que é conhecida como um marcador de células estaminais epiteliais gástricas localizados na glândula da mucosa normal [32] (Figura 2D ).

Em seguida, validou a independência de ancoragem e capacidade de iniciação do tumor de dois a subpopulação de células pequenas (I e II). No ensaio de formação de colónias, CXCR4

+ pequena células formado muito mais colónias do que o CXCR4

– pequenas células (Fig 3A). experiências de diluição em série de inoculação intraperitoneal em ratinhos imunodeficientes revelou que CXCR4

+ pequenas células também possuía uma capacidade maior tumorigênico (desenvolvimento de tumores em 4/5 e 1/5 ratos mediante inoculação de 10

5 e 10

4 células, respectivamente) em comparação com CXCR4

– pequenas células (1/10 e 0/10 ratinhos após 10

5 e 10

4 células, respectivamente) (Fig 3Bi). Notavelmente, todos os cinco ratos portadores de tumores após a inoculação de CXCR4

+ células pequenas teve múltiplos nódulos tumorais (Fig 3Bii), e começou a desenvolver ascite sangrentos dentro de 3 semanas (Fig 3Biii).

(A) imagens representativas de crescimento independente de ancoragem de CXCR4

+ células pequenas e CXCR4

– pequenas células no ensaio de formação de colónias (à esquerda). A análise quantitativa do crescimento celular usando corante de CyQUANT GR (direita) (n = 3, média + SE; *** p 0,001). barras de escala representam 200 um. frequência de formação (B) Tumor de CXCR4

+ células pequenas e CXCR4

– grandes células em camundongos de xenotransplante (BI). Os painéis inferiores mostram achados macroscópicos representativos de múltiplos nódulos tumorais (Bii, ponta de seta), juntamente com o intestino e ascite sangrentas (BIII) em um rato SCID /SCID. (C) RT-PCR (painel da esquerda) e coloração imunocitoquímica (painéis da direita) de CXCR4 (verde) e CXCR7 (verde) em células de cultura principal GC (NSC-20C). barra de escala representa 200 um. análise de citometria de (D) Fluxo em células primárias cultivadas GC (NSC-20c), (di) e CXCR4

+ células classificadas depois de cultivar por 14 dias (Dii). ensaio de formação de colónia de CXCR4

+ e CXCR4

– pequenas células derivadas de células NSC-20C (n = 3, a média + SE; **

p Art 0,005). (Diii)

Além de difundir tipo linhas celulares GC, nós também investigou o papel da CXCR4 em uma amostra clínica (NSC-20C): a cultura primária estabelecida a partir de ascite de um paciente GC-tipo difuso com PD. Em experimentos de positividade RT-PCR e, confirmou-se que a cultura primária expressar

CXCR4

mas não

CXCR7

(Fig 3C). Importante, CXCR4

+ pequenas células classificadas de NSC-20C possuía tanto uma capacidade repovoamento (Fig 3Di e 3Dii) e uma capacidade de alta formação de colónia (Fig 3Diii).

O envolvimento do CXCR4 /CXCR7 /SDF -1 eixo no PD

em outras seis GC linhas celulares derivadas do tipo difuso (HSC-39, HSC-44, 44As3, HSC-58, 58As9, e Kato III), investigamos ainda mais a relação entre a estado de expressão /SDF-1 dois receptores CXCR4 e CXCL12 (CXCR7) e a acumulação de ascite em ratinhos inoculados com as células cancerosas por via intraperitoneal. As experiências de RT-PCR revelou que duas linhas de células GC (HSC-39 e Kato III) altamente expresso

CXCR4

(Fig 4A). Além disso, ambos estes ratinhos xenoenxertados teve múltiplos nódulos de tumor e ascites acumuladas (Fig 4B). Em contraste, as outras duas linhas celulares (HSC-44 e HSC-58) não mostrou nenhuma ou muito baixa expressão de CXCR4, um único ou poucos nódulo de tumor peritoneal e não se acumulam ascite (Fig 4B). Nós também confirmou a acumulação de ascite em outro sublinha altamente peritoneal metastático 58As9 (derivado do HSC-58), que expressa

CXCR7

a um nível elevado, mas não

CXCR4

. Um caso excepcional foi 44As3 derivado de HSC44 que teve múltiplos nódulos tumorais e ascite acumulados sem a expressão de ambos

CXCR4

e

CXCR7

. No geral, encontramos uma alta correlação entre o nível de expressão

CXCR4

ou

CXCR7

e os fenótipos agressivos em sete das oito linhas celulares, exceto 44As3.

(A) RT-PCR de

CXCR4

e

CXCR7

em 6 linhas celulares derivadas do tipo difuso GC. (B) Os achados macroscópicos de ascite sangrentas e múltiplos nódulos tumorais (ponta de seta ou círculo pontilhada) em SCID /SCID formados dentro de 3 semanas após a inoculação de cada linha celular.

Na prática clínica, lavagem peritoneal citologia (CY) fornece importantes informações de prognóstico para pacientes GC, porque ele pode detectar a “semente” da DP antes de sua manifestação macroscópica. Mesmo nos casos sem PD (P0), os pacientes CY-positivos têm um mau prognóstico [33], o que sugere que muito poucas CSCs metastáticas estão presentes na lavagem peritoneal desses pacientes. Portanto, o próximo investigou a presença de CXCR4

+ células GC em lavagens peritoneais de pacientes sem ascite clinicamente aparentes.

CXCR4

mRNA foi raramente detectada nas lavagens em 9 dos 10 pacientes CY-negativos; No entanto, o ARNm foi detectada nas lavagens em 19 dos 34 pacientes (CY-positivos S5A FIG). Nós também confirmou a presença de células a CXCR4 e GC pequenas duplo positivas para citoqueratina nas células mesoteliais em forma de paralelepípedo ligados à superfície do prato de cultura de curto prazo (7 dias) de cultura de ascite do doente (Fig S5B). Nas nossas experiências, as células mesoteliais peritoneais geralmente desapareceu em cultura a longo prazo após cerca de um mês. Em tal cultura a longo prazo, também encontramos a presença de alguns CXCR4 ou células GC CXCR7-altamente positivos que mostraram uma característica para a transição epitelial-mesenquimal, vimentina (VIM) (cabeça de seta em S5C Fig) -positivo mas citoqueratina (PAN )-negativo. Portanto, o CXCR4 células

+ GC estão presentes nas ascites malignas não apenas na fase inicial de difusão peritoneal (P0 /CY

+), mas também nas fases mais progressiva caracterizada por uma acumulação de ascites evidente. Em suma, a evidência experimental e clínica acima sugere que uma parte da CXCR4

+ ou CXCR7

+ células GC têm um potencial para o desenvolvimento de metástase peritoneal.

A seguir, investigou o papel funcional do CXCR4 via de sinalização na DP. A expressão de

CXCL12

/

SDF-1

no mesotélio peritoneal humana e de ratinho foi confirmada por RT-PCR (Figura 5A). Portanto, o envolvimento de CXCL12 /SDF-1 para a invasão de células foi investigada. Como mostrado na Fig 5B, o número de células invasivas 60As6 foi drasticamente aumentada por SDF-1, indicando que estas células têm a capacidade de quimiotaxia para SDF-1. knockdown induzida shRNA Lentivirus de CXCR4 em 60As6 atenuada invasão SDF-1-mediada, mas não afectou a formação de nódulos de tumores na cavidade peritoneal de ratinhos (não mostrado). Além disso, a expressão de CXCR4 forçado numa linha celular parental HSC-60 não aumentou a tumorigenicidade (não mostrado).