Abstract

Apesar dos avanços no diagnóstico precoce e terapia multimodal para o câncer, a maioria de cancro do pulmão pacientes foram localmente avançado ou metastizado no momento do diagnóstico, o que sugere a característica altamente progressiva de células do cancro do pulmão. A invasão mecanismos subalterno e metástase de câncer de pulmão estão ainda a ser elucidado. No presente estudo, imuno-histoquímica foi realizada para detectar a expressão de CXCL16-CXCR6 em tecidos de cancro do pulmão humano. Foi demonstrado que semelhante a CXCL12 e CXCR4, CXCL16 e CXCR6 também foram co-expressos em tecidos de câncer de pulmão primário humanos. Após a confirmação da existência funcional de proteínas CXCL16 e CXCR6 no A549, 95D e H292 células por ELSA e citometria de fluxo análise, exploramos ainda mais a importância do eixo CXCL16-CXCR6 nas funções biológicas de linhas celulares de cancro de pulmão

in vitro

. Verificou-se que CXCL16 não teve efeitos sobre a PCNA (antígeno nuclear de proliferação celular) expressão de A549, 95D e H292 células. No entanto, ambos CXCL16 exógeno e CM (meio condicionado a partir A549, 95D ou H292) melhorou significativamente a

in vitro

viabilidade e invasão de linhas celulares de cancro do pulmão de três. O anticorpo neutralizante para CXCL16 ou sub-regulação de CXCR6 foi capaz de inibir o aumento da viabilidade e invasividade de A549, H292 e 95D células estimuladas por CM ou CXCL16. Os nossos resultados sugerem que o eixo CXCL16-CXCR6 está envolvido na regulação da viabilidade e da invasão ao invés de expressão PCNA de células Caner do pulmão, o que abre a porta para uma melhor compreensão dos mecanismos de progressão do tumor de pulmão e metástase

Citation.: Hu W, Liu Y, Zhou W, Si L, Ren L (2014) CXCL16 e CXCR6 são co-expressos em câncer de pulmão humano

In Vivo

e mediar a invasão de linhas celulares de cancro do pulmão

In Vitro

. PLoS ONE 9 (6): e99056. doi: 10.1371 /journal.pone.0099056

editor: Vladimir V. Kalinichenko, Hospital Infantil de Cincinnati Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 19 de setembro, 2013; Aceito: 11 de maio de 2014; Publicação: 04 de junho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Hu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho é suportado pelo National Science Foundation Natural da China 81270753 (de W.-HZ), Wuhan Ciência e Tecnologia Projeto 2013060602010249 (a W.-DH), Natural Science Foundation of Ministério da Província de Hubei 2010CDB05502 Ciência e Tecnologia (de W.-DH ) e Pessoal Plano de Formação do sistema de cuidados de saúde de Pequim 2013-3-021 (a W.-HZ). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de pulmão é um tumor maligno comum que classifica como a principal causa de morte relacionada com malignidades em todo o mundo, ea incidência de câncer de pulmão tem vindo a aumentar nos últimos anos em algumas grandes cidades na China [1]. Apesar dos avanços no diagnóstico precoce e terapia multimodal para o câncer, a taxa de sobrevida global de cinco anos para a maioria dos pacientes com câncer avançado de pulmão ainda é inferior a 20%. Os mecanismos subalterno de invasão e metástase de câncer de pulmão têm atraído muita atenção de oncologistas torácicas por décadas de anos. Algumas hipóteses e moléculas foram apresentadas, mas uma profunda compreensão dos processos invasivos e metastáticos intrincados de células de carcinoma é ainda uma questão em aberto.

Desde a descoberta do primeiro quimiocinas em 1987, mais de 50 tipos de quimiocinas e 20 tipos de receptores de quimiocina foram clonadas e identificadas. A activação da via de sinalização da quimiocina /receptor foi confirmada para mediar uma série de eventos fisiológicos e patológicos, especialmente o recrutamento de linfócitos bem como o crescimento de tumores e metástase, que fornece a possibilidade para a elucidação de processo metastático de células malignas da imunologia perspectivas [2], [3], [4], [5], [6].

Entre várias quimiocinas e receptores de quimiocina, CXCL16-CXCR6 é um par receptor de quimioquina /quimiocina original. CXCL16, também conhecido como SR-PSOX, pertence à família das quimiocinas CXC e existe tanto sob uma forma solúvel transmembranar e [7], [8], [9]. Interacção entre CXCL16 e a sua ‘receptor único, CXCR6 (também chamado Bonzo, STRL33 e TYMSTR) está envolvido em várias actividades biológicas, incluindo o tráfico selectivo de subpopulações de linfócitos, a adesão celular, sobrevivência celular, regeneração muscular, desenvolvimento do cérebro, inflamação crónica e anti- imunidade tumoral [9], [10], [11], [12], [13], [14]. Em particular, estudos recentes têm verificado a-expressão ao longo de CXCL16 e /ou CXCR6 em vários tipos de cancros humanos e CXCL16 poderia estimular o crescimento, a migração, invasão e ativação de AKT via das células cancerosas a sinalização através de seu “receptor CXCR6

in vitro

[15], [16], [17], [18]. Nosso estudo anterior também confirmou a expressão excessiva de proteína CXCR6 em células de câncer de próstata nativos humanos ea ativação de CXCL16-CXCR6 via poderia promover a migração e invasão de PC3 e células LNCaP

in vitro

[19]. Estes resultados sugerem que a CXCL16-CXCR6 pode ser uma nova pares ligando /receptor de quimiocina envolvidos na tumorigénese e metástase. Alguns grupos começaram a prestar atenção ao papel da CXCL16-CXCR6 no tumor, no entanto, a relação entre o cancro do pulmão CXCL16-CXCR6 e ainda é evasivo e merece mais investigações.

No presente estudo, a expressão de CXCL16 e CXCR6 em tecidos do pulmão humano câncer e linhas de células de câncer de pulmão, A549, H292 e 95D, foi determinada por imuno-histoquímica e imunocitoquímica respectivamente. Em seguida, o ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA) e citometria de fluxo foram realizados para examinar a expressão funcional de CXCL16 e CXCR6 em três linhas de células de cancro. Para melhor elucidar o papel do eixo CXCL16-CXCR6 no cancro do pulmão, também observamos a ação de CXCL16 em PCNA (antígeno nuclear de proliferação celular) expressão e capacidade invasiva do A549, H292 e 95D células. Os efeitos do gene CXCR6 infra-regulação pela tecnologia pequeno RNA de interferência (siRNA) sobre a viabilidade e capacidade de invasão das células A549 também foram determinados por MTT e ensaio de invasão. Através de explorar a mudança de comportamento biológico das células de câncer de pulmão mediadas por eixo CXCL16-CXCR6, esperamos fornecer insights sobre um melhor entendimento da progressão deste tumor maligno agressivo.

Materiais e Métodos

Humano Recolha de Tecidos

Todos os procedimentos envolvendo participantes do estudo foram aprovados pelo Hospital Zhongnan do Comitê de Ética em Pesquisa Humana da Universidade de Wuhan, e os participantes tinham fornecido os seus consentimentos informados por escrito.

câncer de pulmão humano (33 casos) e normais (5 casos) os tecidos foram obtidos de pacientes que foram submetidos a ressecção pulmonar ou pneumonectomia para o câncer ou não câncer de doenças pulmonares em Zhongnan Hospital da Universidade de Wuhan de 2003 a 2006. a identificação dos tipos de tumor foi realizada por dois patologistas profissional . De 33 cancros do pulmão, 13 casos eram adenocarcinomas (AC), 12 casos eram carcinomas espinocelulares (SC), 7 casos foram Carcinoma Adenoescamoso (ASC) e 1 caso foi o carcinoma broncoalveolar (BC). Os estágios de tumores foram estimados de acordo com a sétima edição do novo sistema de estadiamento TNM sugerido pela associação internacional para o estudo do cancro do pulmão (IASLC) em 2009. Nos 33 amostras, 3, 1, 9, 8, 10 e 2 casos foram IA, IB, IIA, IIB, IIIA e IIIB, respectivamente.

Cultura de células

Lung linhas celulares de cancro A549, H292 e 95D células foram obtidas a partir do celular Banco da Academia chinesa de Science (Xangai, China). As células foram cultivadas em 1640 contendo inactivado pelo calor 10% de FBS (Gibco, Grand Island, NY, EUA), HEPES 10 mM, 1 mM pirúvico de sódio ácido, 4,5 g /L de glucose, 100 UI /ml de penicilina e 100 ug /ml estreptomicina. As células foram recuperadas e passadas por três vezes, em seguida, deixou-se crescer até à confluência pelas seguintes experiências.

A imuno-histoquímica

O método para imuno-histoquímica foi baseado nos nossos procedimentos anteriores [19]. Resumidamente, os tecidos foram fixados com formalina rotineiramente e embebidos em parafina. A recuperação de antígenos foi realizada e 0,3% H

2O

2 em solução tampão de fosfato (PBS) foi utilizado para bloquear a actividade da peroxidase endógena nas secções. Depois de tratada com a proteína de soro de bloqueio para bloquear a ligação não específica, as secções foram incubadas durante a noite a 4 ° C com o CXCR4 rato anti-humano (25 ug /ml), de ratinho anti-humano CXCR6 (25 ug /ml), anti-rato CXCL12 humana (20 ug /ml) e anticorpos de cabra anti-CXCL16 humana (20 ug /ml) (a partir de R D Systems, Abingdon, Reino Unido), respectivamente. Um kit de reagente de detecção de estreptavidina /biotina (Bio Maixin., Fuzhou, China), com 3, tetracloridrato de diaminobenzidina-30 (DAB) foi empregue para a detecção do sinal e hematoxilina de Harris foi utilizada como uma contra-coloração. Mouse ou isotipo IgG de cabra (10 ug /ml) (Bio Dingguo Co. Ltd., Shanghai, China) foi utilizado como um controlo negativo e do primeiro trimestre tecidos humanos vilosidades (5 amostras) foram utilizados como controlo positivo (13, 19). Pontuação foi realizada às cegas usando um sistema de telepatologia sem o conhecimento da informação clínica relacionada (por exemplo, o grau do tumor, o tamanho do tumor ou o resultado clínico). A intensidade imunocoloração foi observado e registado como sem coloração (pontuação = 0), amarelo-claro (pontuação = 1), castanho-claro (pontuação = 2) ou marrom (pontuação = 3). A percentagem de células positivas foi calculada como 5% (pontuação = 0), 5-25% (pontuação = 1), 26-50% (pontuação = 2), 51-75% (pontuação = 3) ou 75% (pontuação = 4). Combinando a pontuação intensidade imunomarcação ea percentagem de células positivas, classificamos o placar da seguinte forma: 2, expressão negativa; 2-3, fraca expressão; 4-5, expressão moderada e 6-7 expressão tão forte [19].

Imunocitoqu�ica

Depois de 70-80% de confluência das células, A549, H292 ou 95D células foram digeridos com 0,25 % de tripsina (Bio básica Inco., BBI, Ontário, Canadá) que contém 0,1% de EDTA e semeadas a uma densidade de 2 × 10

5cells /poço em placas de 6 poços pré-colocados com lamelas. Após cultura durante 48 h, linhas celulares de cancro de pulmão foram fixadas em formalina a 4% durante 20 min à temperatura ambiente, lavadas em PBS e permeabilizadas durante 15 minutos em 0,03% de Triton X-100-PBS, em seguida, tratada com 0,3% H

2O

2 para inactivar a actividade da peroxidase endógena. O procedimento seguinte foi como descrito acima no método de imuno-histoquímica e células trofoblásticas humanas de cultura principal foram também utilizadas como controlo positivo [13], [19]. Os resultados foram analisados ​​por Image-ProPlus 6.0 do software e a densidade média de expressão de CXCL16 e CXCR6 em três linhas de células foi gravada. As experiências foram repetidas três vezes.

Preparação de célula de cultura Condicionada

médio

O A549 isolado, 95D e H292 foram semeadas em frascos de cultura (6 ml /frasco) com uma densidade de 1 x 10

6 /ml, respectivamente, e foram cultivadas continuamente durante 48 h. Os sobrenadantes forma, ou seja condicionado (CM), foram recolhidas e centrifugadas a 2000 g, em seguida, armazenada a -80 ° C. Os sobrenadantes a partir de meio de cultura sem células também foram recolhidos como controlo.

enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

digeridas A549, H292 e 95D células foram semeadas em placas de 24 poços (500 ul /poço) a uma densidade de 5 x 10

5 /mL, respectivamente. Sobrenadantes das culturas de células foram coletadas em 24, 36, 48, 60, 72, 96 e 100 h de cultura. Cada sobrenadante recolhido foi armazenado a -80 ° C durante a análise de ELISA. A quantidade de CXCL16 em cada sobrenadante foi medida por CXCL16 humana kit de ELISA (Xangai Westang Bio-Tech Co. Ltd., Shanghai, China), de acordo com as instruções do fabricante. O kit de ensaio de CXCL16 demonstrou uma sensibilidade de 40 pg /ml e um coeficiente de intra-ensaio de variação inferior a 12%. As experiências foram repetidas três vezes.

Fluxo Citometria de detecção para CXCR6 Expressão

A expressão de proteína de membrana CXCR6 em A549, H292 e 95D células foi detectada por citometria de fluxo de acordo com o nosso método anterior e CXCR4 foi também utilizado como controlo, ao mesmo tempo [20]. Resumidamente, para proteger a localização da membrana do receptor de quimiocina, na medida do possível, as células, em confluência celular de 70-80%, foram digeridos com 0,25% de tripsina apenas para 30-50 s, em seguida, soprado suavemente e lavou-se com PBS [ ,,,0],20]. Após o bloqueio com 10% de FBS, as células recuperadas foram incubadas com rato PE anti-humano (ficoeritrina) -CXCR6 anticorpo monoclonal (1:10; R D Systems, Inc), anticorpo monoclonal humano anti-PE-Cy5 CXCR4 rato ( 1:05; eBioscience), rato de PE-isotipo IgG2b (R D Systems, Inc) ou rato de PE-Cy5 do isótipo IgG2a (eBioscience), no uso recomendado durante 1 h à temperatura ambiente na escuridão. As células foram então lavadas duas vezes com 1 ml de PBS por centrifugação a 2000 × g durante 5 minutos e analisadas por citometria de fluxo FACS Calibur (FC500, Beckman-Coulter, EUA) e o software CellQuest. As células de 1 x 10

5 foram contadas e a proporção de células positivas foi gravado. As experiências foram repetidas três vezes.

Detecção de PCNA por citometria de fluxo

O A549 isolado, H292 e 95D células foram semeadas em placas de 6 poços a uma densidade de 2 × 10

5 de células /poço. Na confluência 70-80% de células, as linhas celulares de cancro de pulmão foram deixados em jejum durante 12 h, depois tratou-se com CXCL16 humana recombinante (100 ng /mL) (Peprotech, Rocky Hill, NJ, EUA), ou uma combinação de CXCL16 com anticorpo neutralizante CXCL16 (100 ng /mL) (R D Systems, Inc.) para anteras 48 h. Em seguida, as células foram digeridos e recolhidos para o exame seguinte PCNA (antígeno nuclear de proliferação celular). Resumidamente, as células foram tratadas com 70% de etanol e 0,1% de Triton X-100, cada um durante 20 min, depois incubadas com anti-humano PE-PCNA anticorpo monoclonal de ratinho (1:05; eBioscience) ou PE-rato IgG

isotipo 2a (eBioscience) durante 1 h à temperatura ambiente no escuro [21]. O procedimento seguinte foi examinar como descrito acima no método de citometria de fluxo para a detecção de expressão CXCR6. As experiências foram repetidas três vezes.

CXCR6 silêncio em células A549

As células A549 foram semeadas isoladas em placas de 6 poços a uma densidade de 2 × 10

5 /ml. A 70-80% de confluência, as células foram transfectadas com plasmídeo phU6 GFP //Neo contendo ARN gancho de cabelo curto moléculas (shRNA) dirigidas contra CXCR6, com o uso de Lipofectamine 2000 (Invitrogen). As sequências de oligonucleótidos para três shRNA foram: (CXCR6-2819-1): 5′-AAT GAC ctGAG TCC AAG ACT T-3 ‘(sentido) e 5′-TCT GAA TGG AAT CCT TGT CAG-3′ (anti-sentido ); (CXCR6-2820-2) 5’-GAT CAT ctCAC TGT CTG CTA T-3 ‘(sentido) e 5′-ATA GCA GAC AAT CAT GGT GAG-3′ (anti-sentido); (CXCR6-2821-1) 5’-gcTTG CTC ATC TGG GTG ATA T-3 ‘(sentido) e 5′-ATA TCA CCC AGA TGA GCA AGC-3’ (anti-sentido) (GENECHEM, Xangai, China). Os grupos foram divididos em phU6 /GFP /Neo-CXCR6 (CXCR6-shRNA), não-alvo oligonucleotídeos siRNA controle negativo (phU6 /GFP /Neo, shRNA-controle) e em branco-controle (sem qualquer tratamento). Os transfectantes estáveis ​​foram seleccionados por cultura de G418, a uma concentração de 800 ug /ml. As experiências foram repetidas três vezes e a eficiência silenciamento foi determinado por western blot.

Ensaio de viabilidade celular

O MTT [brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2, brometo de 5-difeniltetrazólio, foi aplicado ensaio Sigma Chemicals], para avaliar os efeitos da CXCL16-CXCR6 sobre a viabilidade das células

in vitro

[21]. Os experimentos foram divididos em dois passos: em primeiro lugar, as células A549 isolado a partir de branco-controlo,-shRNA controlo e CXCR6-shRNA (2819-1) foram semeadas em grupos de 96 poços de fundo plano de microplacas com uma densidade de 2 × 10

3 células /poço e cultivadas durante 24, 48, 72, 96 e 120 h, respectivamente. Em segundo lugar, depois de fome com 1640 sem FCS durante 12 h, as células de controlo em branco-,-shRNA controlo ou CXCR6-shRNA (2819-1) grupos foram tratados com meio de controlo (1640) ou CXCL16 a uma concentração de 100 ng /mL durante 48 h.

o MTT (20 ul) foi adicionada a cada poço de microplacas de 96 poços e incubou-se a 37 ° C durante 4 h. O meio foi decantado e 100 ul de DMSO foram adicionados para solubilizar os cristais reactivos. Absorvência foi medida a um comprimento de onda de 570 nm num leitor de microplacas automático. As amostras foram executadas em triplicado e as experiências foram repetidas três vezes [21].

ECM Invasion Ensaio

A capacidade invasiva de células do câncer de pulmão foi avaliada objetivamente por

in vitro

ensaio de invasão com base no nosso método anterior [19], [20]. Resumidamente, as inserções de cultura de células (de tamanho de poro de 8 um, 6,5 mm de diâmetro; Corning, Corning, NY, EUA) revestidas com matriz extracelular 10 ul puro (ECM) em gel (Sigma, St. Louis, MO 63103, American) foram colocados em uma placa de 24 poços. Os experimentos foram divididos em duas partes seguintes: Em primeiro lugar, o A549 isolado, H292 ou 95D células (1 × 10

5/200 ul 1640 sem soro) foram colocadas na câmara superior, e tratada com CM, CXCL16 ( 100 ng /ml) e uma combinação de CM ou CXCL16 com anticorpo de neutralização CXCL16 (100 ng /mL). Em segundo lugar, as células A549, a partir da placa-controlo, phU6 /GFP /Neo e phU6 /GFP /grupo neo-CXCR6, foram inoculadas na câmara superior a uma densidade de (1 × 10

sérica 5/200 ul livre 1640), em seguida, tratada com CXCL16 (100 ng /ml) ou CM. As câmaras inferiores foram cheias com 800 ul de 1640 fornecido com 10% de FBS. Depois incubou-se a 37 ° C durante 24 h, as inserções foram removidas e lavadas em PBS. Em seguida, as células noninvading em conjunto com gel de ECM foram removidos a partir da superfície superior do filtro, limpando com um cotonete. As inserções foram fixadas em formalina a 4% durante 10 min à temperatura ambiente, e corados com hematoxilina. O resultado foi observado com um microscópio óptico (Olympus, Tóquio, Japão) e as células que migraram para a superfície inferior foram contadas. Para eliminar a variabilidade individual, os resultados foram avaliados por dois investigadores independentes e o índice invasivo foi calculada como a proporção das células que migraram do grupo experimento ao do seu próprio controlo. Cada experimento foi realizado em triplicado, e repetiu três vezes.

Estatísticas

As experiências

in vitro

foram mostrados na média ± SE. Os dados de expressão PCNA,

in vitro

ensaio de viabilidade e invasão foram avaliadas com o post hoc de Dunnett

t

e teste Dunnett T3, quando apropriado. As diferenças foram aceitos como significativa a

P

. 0,05

Resultados

expressão das proteínas CXCL16-CXCR6 em Câncer de Pulmão Humano

in vivo

a imuno-histoquímica foi realizada para determinar a expressão da proteína de CXCL16 e CXCR6 em Caner pulmão humano (33 amostras) e de tecidos normais (5 amostras). Os resultados na FIG. 1 demonstraram claramente a co-expressão da proteína CXCR6 e CXCL16 em tecidos de câncer de pulmão humanos. coloração de cor castanha específico para CXCR6 e CXCL16 no citoplasma e membrana pode ser claramente observado nas células de câncer de pulmão primário, mas a taxa de expressão positiva e intensidade da coloração da CXCR6 era mais forte do que a de CXCL16. Embora moderada a forte coloração, de cor castanha e para a CXCL16 CXCR6 foi também observada em tecidos pulmonares normais, mas a expressão positiva estava restrita principalmente às células epiteliais alveolares e células inflamatórias. Não havia nenhuma evidência para a coloração não específica com o anticorpo de controlo.

A imuno-histoquímica foi realizada para determinar a expressão da proteína de CXCL16-CXCR6 e CXCL12-CXCR4 em tecidos de cancro primário do pulmão humanos. Os anticorpos utilizados neste experiências foram de ratinho anti-humano CXCR4 (25 ug /ml), rato CXCR6 anti-humano (25 ug /ml), rato CXCL12 anti-humano (20 ug /ml) e de cabra CXCL16 anti-humano (20 ug /ml) de anticorpos. Foi demonstrado na Fig. 1 que uma coloração cor castanha específico para CXCL16-CXCR6 e CXCL12-CXCR4 no citoplasma e membrana de diferentes tipos patológicos humanos de células de câncer de pulmão. Moderada a forte, coloração de cor castanha e para a CXCL16 CXCR6 foi também observada em tecidos pulmonares normais, mas a expressão positiva estava restrita principalmente às células epiteliais alveolares e células inflamatórias. Não havia nenhuma evidência para a coloração não específica com o anticorpo de controlo. As imagens foram representante dos experimentos. AC: adenocarcinomas; SC: carcinomas espinocelulares; BC: carcinoma broncoalveolar; Con: tecidos pulmonares normais; Villi: primeiro trimestre tecidos vilosidades humanos, como um controlo positivo. Ampliação, × 200.

Além disso, analisamos também a associação de padrão de expressão CXCL16-CXCR6 com diferentes tipos patológicos de câncer de pulmão. Foi demonstrado na Fig. 2, que das 33 amostras de câncer de pulmão detectados, para a expressão da proteína CXCR6, apenas 3 casos SC eram fracos positivo e os outros eram todos moderada a forte positivo, enquanto que para CXCL16, a intensidade da coloração foi negativa (10), fraco (8), moderada (8) e forte (7). Das 10 amostras de CXCL16-negativos, 7 casos pertencem ao AC, 2 casos pertencem a SC e 1 caso foi ASC. Das 7 amostras CXCL16-forte, 5 casos foram SC e 2 casos foram ASC. O resto da 16 fraco a moderado amostras foram AC (6), SC (5) ASC (4) e BC (1), respectivamente (Fig. 2).

De acordo com a pontuação da intensidade da imunocoloração e a percentagem de células positivas, os resultados da análise imunoquímica foram classificados como se segue: 2, expressão negativa; 2-3, fraca expressão; 4-5, expressão moderada e 6-7 expressão tão forte. AC: adenocarcinomas; SC: carcinomas espinocelulares; ASC: Carcinoma Adenoescamoso; BC:. Carcinoma broncoalveolar

No presente estudo também utilizado CXCL12-CXCR4 como controle positivo e compararam o padrão de expressão entre CXCL16-CXCR6 e CXCL12-CXCR4. Como mostrado na Fig. 1,2 e Tabela 1, a maioria das amostras expressa CXCR4 (30/33) e CXCL12 (28/33) de proteínas, apesar de uma diferença na intensidade de luz de expressão. Além disso, em 33 amostras detectadas, havia 30 casos que co-expressa a proteína CXCR6 e CXCR4, e 19 casos que co-expressa proteínas CXCL16 e CXCL12.

expressão das proteínas CXCL16-CXCR6 no Pulmão humano linhas celulares de cancro

Depois de confirmar a co-expressão de proteínas CXCL16-CXCR6 em células de câncer de pulmão nativos humanos, analisamos ainda mais a expressão de CXCL16-CXCR6 no cancro do pulmão linhas celulares A549 humano, H292 e 95D por imunocitoquímica. Como mostrado na Fig. 3, a coloração de cor castanha positivo para ambos CXCL16 e CXCR6 pode ser claramente observada no citoplasma e cytomembrane de A549, células H292 e 95D, respectivamente. Embora não houvesse diferenças de intensidade de expressão em A549, H292 e 95D células, a coloração para o ligando foi todos relativamente mais fraca do que é o receptor em três tipos de células. Além disso, o padrão de CXCL16-CXCR6 expressão foi semelhante ao de CXCL12-CXCR4, a coloração específica tanto para o CXCR4 e CXCL12 também pode ser observado em linhas celulares de cancro de pulmão de três apesar da diferença de intensidade de expressão em diferentes células.

imunocitoquimica foi realizada para detectar a expressão da proteína de CXCL16-CXCR6 e CXCL12-CXCR4 em linhas celulares de cancro de pulmão humano. Os anticorpos utilizados neste experiências foram de ratinho anti-humano CXCR4 (25 ug /ml), rato CXCR6 anti-humano (25 ug /ml), rato CXCL12 anti-humano (20 ug /ml) e de cabra CXCL16 anti-humano (20 ug /ml) de anticorpos. coloração de cor marrom de positivo tanto para CXCL16 e CXCR6 foi claramente observada no citoplasma e cytomembrane de A549, células H292 e 95D, respectivamente. Além disso, CXCL12 e CXCR4 foram também co-expresso em linhas celulares de cancro de pulmão de três. Nenhuma coloração de fundo foi observado no controlo do isotipo. A: As imagens eram representativas dos experimentos; B: A intensidade relativa de expressão de CXCL16-CXCR6 e CXCL12-CXCR4 em A549, H292 e 95D células. Tro: células cultivadas primárias de trofoblastos humanos como um controlo positivo. Ampliação, × 200.

Em seguida, um ensaio ELISA foi realizada para examinar a liberação da CXCL16 solúvel em A549 cultivadas, H292 e 95D células

in vitro

. Como mostrado na Fig. 4, três tipos de linhas celulares de cancro de pulmão todos CXCL16 secretado espontaneamente a uma taxa quase constante, mas houve uma pequena diferença na concentração de CXCL16 no meio de cultura. A quantidade de CXCL16 produzido por H292 células foi o maior entre os três tipos de células. A concentração de CXCL16 no meio de 24 horas de cultura-H292 já atingiu a 1391,9 ± 13,43 ng /ml e a concentração acumulada de CXCL16 foi 2633,2 ± 2566,9 ± 9,84 e 3,1 ng /ml após cultura durante 96 h e 120, respectivamente. Embora a produção de CXCL16 por células A549 foi relativamente menos do que a de ambos H292 e 95D células, a produção de CXCL16 era ainda de um modo dependente do tempo e a quantidade de CXCL16 foi 977,45 ± 12,85 ng /ml após cultura durante 120 horas. Para 95D células, a concentração de CXCL16 também correlacionada positivamente com o tempo de cultura e a 120 h produção de CXCL16 foi 1165,2 ± 12,00 ng /ml.

digeridas A549, H292 e 95D células foram semeadas em placas de 24 poços (500 ul /poço) a uma densidade de 5 x 10

5 /mL, respectivamente. Sobrenadantes das culturas de células foram coletadas em 24, 36, 48, 60, 72, 96 e 100 h de cultura. Um ensaio ELISA foi realizada para examinar a liberação da CXCL16 solúvel em A549 cultivadas, H292 e 95D células

in vitro

. Como mostrado na Fig. 4, três tipos de linhas celulares de cancro de pulmão todos CXCL16 secretado espontaneamente de uma maneira dependente do tempo, Despites de uma diferença na concentração de CXCL16 no meio de cultura. As experiências foram repetidas três vezes. As barras de erro representam o erro padrão da média.

A citometria de fluxo foi usada para detectar a expressão de membrana CXCR6 em A549, H292 e 95D células. Embora a proporção de expressão CXCR6 por células H292 foi menos do que a de ambos A549 (52,4 ± 5,79%) e as células 95D (56,03 ± 11,42%), a percentagem média de 34,87 ± 6,17 ainda (Fig. 5) foi. Além disso, também detectada a expressão de membrana de CXCR4 em A549, H292 e 95D células com citometria de fluxo. Verificou-se que a percentagem de células positivas em CXCR4-A549, H292 e 95D era 25,56 ± 6,44, 46,00 ± 6,52 e 28,57 ± 1,43, respectivamente. Assim, a membrana CXCR6 e CXCR4 foram co-expressos em linhas celulares de cancro de pulmão de três apesar de uma ligeira diferença na proporção expressão positiva.

A citometria de fluxo (FCM) foi utilizado para detectar a expressão de membrana CXCR6 em linhas celulares de cancro de pulmão . As células de 1 x 10

5 foram contadas e a razão de diluição do (ficoeritrina) -CXCR6 anticorpo monoclonal e o anticorpo monoclonal PE-Cy5 CXCR4 foram 01:10 e 01:05, respectivamente. O histograma demonstrou a proporção média de expressão CXCR6 e CXCR4 em A549, H292 e 95D células, respectivamente. As imagens FCM eram representativas dos experimentos. A percentagem de células positivas CXCR6 membrana em A549, H292 e 95D foi de 52,4 ± 5,80, 56,03 ± 11,42 ± 6,17 e 34,8, respectivamente. Além disso, a expressão de CXCR4 membrana também foi observada em A549, H292 e 95D células ao mesmo tempo. Os experimentos foram repetidos três vezes e as imagens eram representativas dos experimentos. As barras de erro representam o erro padrão da média.

Efeitos de CXCL16 no PCNA Expressão de linhas celulares de cancro do pulmão

in vitro

Depois de identificar a existência funcional CXCL16 e CXCR6 em A549, H292 e 95D, observou-se ainda mais o efeito de estimulação sobre a expressão de PCNA CXCL16 destas células. Como mostrado na Fig. 6, não houve alterações significativas no nível de PCNA nos diferentes grupos experimentais (P 0,05, comparado com o controlo). Os resultados foram bastante consistentes em três linhas celulares de cancro do pulmão e do eixo CXCL16-CXCR6 não demonstrou quaisquer efeitos sobre a expressão de PCNA de A549, H292 ou 95D.

Após carente de 12 (100 ng /mL) ou uma combinação de CXCL16 com anticorpo neutralizante CXCL16 (100 ng /mL) durante 48 h antera. Então, (antígeno nuclear de proliferação celular) os efeitos da estimulação CXCL16 no PCNA expressão foi detectada por citometria de fluxo. Como mostrado na Fig. 6, não houve alterações significativas no nível de PCNA nos diferentes grupos experimentais (P 0,05, comparado com o controlo). As imagens são representativos das experiências e os resultados eram reprodutíveis e consistente em linhas celulares de cancro de pulmão de três. As barras de erro representam o erro padrão da média.

CXCR6 foi Down-regulada por siRNA Techonology

Eficiência de interferência RNA contra CXCR6 foi validado por western blot. Foi mostrada na Fig. 7, que foi substancialmente CXCR6 proteína expressa em células A549 (Banco-controlo, sem qualquer tratamento) e a tecnologia de RNA de interferência que inibia eficazmente a expressão CXCR6 em células A549. A eficiência silenciamento de CXCR6 shRNA- (2819-1) foi o melhor, portanto, em todos os experimentos posteriores, utilizamos este siRNA para silenciar a expressão do mRNA CXCR6.

Para silenciar a expressão do gene CXCR6, nós transfectadas células A549 com phU6 GFP plasmídeo //Neo contendo ARN de gancho de cabelo curto (shRNA) moléculas dirigidas contra CXCR6, com o uso de Lipofectamine 2000 (Invitrogen). As sequências de oligonucleótidos para três shRNA foram: (CXCR6-2819-1): 5′-AAT GAC ctGAG TCC AAG ACT T-3 ‘(sentido) e 5′-TCT GAA TGG AAT CCT TGT CAG-3′ (anti-sentido ); (CXCR6-2820-2) 5’-GAT CAT ctCAC TGT CTG CTA T-3 ‘(sentido) e 5′-ATA GCA GAC AAT CAT GGT GAG-3′ (anti-sentido); (CXCR6-2821-1) 5’-gcTTG CTC ATC TGG GTG ATA T-3 ‘(sentido) e 5′-ATA TCA CCC AGA TGA GCA AGC-3’ (anti-sentido). Eficiência de RNA de interferência contra CXCR6 foi validado por western blot. Foi mostrada na Fig. 7, que foi substancialmente CXCR6 proteína expressa em células A549 (Banco-controlo, sem qualquer tratamento) e a tecnologia de RNA de interferência que inibia eficazmente a expressão CXCR6 em células A549. Pista 1: Blank-controle; Pista 2: ARN-controle; Pista 3: CXCR6 shRNA- (2821-1); Pista 4: CXCR6 shRNA- (2820-2); Pista 5:. CXCR6 shRNA- (2819-1)

Efeitos da CXCL16-CXCR6 no A549 viabilidade celular

in vitro

ensaio MTT resultados na Fig. 8 mostraram que não houve diferença do

in vitro

viabilidade entre o branco-controle e shRNA-controle. No entanto, em comparação com o branco-controlo, a viabilidade das células A549 do CXCR6-shRNA (2819-1) grupos diminuiu significativamente com o prolongamento do tempo de cultura (em comparação com o controlo, P 0,01 a 72, 96 e 120 h) . Além disso, CXCL16 humana recombinante foi capaz de aumentar o

In vitro

viabilidade de células A549 a partir da placa-controlo e shRNA-controle (em comparação com o controlo, P 0,01), ao passo que não tinha efeito sobre a viabilidade de as células A549 do CXCR6 regulada negativamente grupo (em comparação com o controlo, P 0,05).

o ensaio MTT foi utilizado para avaliar os efeitos da CXCL16-CXCR6 sobre a viabilidade das células

in vitro

. Como mostrado na Fig.