Abstract

Os produtos naturais estão sendo amplamente explorado por seu potencial para prevenir, bem como tratar o câncer, devido à sua capacidade de direcionar várias vias moleculares.

Ficus religiosa

foi mostrado exercer diversas actividades biológicas, incluindo a apoptose em linhas celulares de cancro da mama. No presente estudo, relatamos o potencial anti-neoplásica de extrato aquoso de

F. religiosa

(FR

aq) casca em linhas celulares de cancro do colo do útero humanos, SiHa e HeLa. FR

aq alterou a cinética de crescimento de SiHa (HPV-16 positivo) e HeLa (HPV-18 positivos), as células de uma forma dependente da dose. Bloqueou a progressão do ciclo celular em G fase

1 /S em SiHa que foi caracterizado por um aumento na expressão de p53, p21 e proteínas pRb com um simultâneo decréscimo na expressão da proteína Rb fosfo (ppRb). Por outro lado, em células HeLa, FR

aq apoptose induzida através de um aumento no Ca intracelular

2+ que conduz à perda de potencial de membrana mitocondrial, a libertação de citocromo-c e ao aumento na expressão da caspase-3. Além disso, FR

aq reduzida a migração, bem como a capacidade de invasão de ambas as linhas celulares de cancro do colo do útero, acompanhadas com regulação negativa de MMP-2 e Her-2 expressão. Curiosamente, FR

aq reduzida a expressão de oncoproteínas virais E6 e E7 em ambas as linhas celulares de cancro do colo do útero. Todos estes dados sugerem que

F. religiosa

poderiam ser explorados por seu potencial quimiopreventivo do câncer cervical

Citation:. Choudhari AS, Suryavanshi SA, Kaul-Ghanekar R (2013) O extrato aquoso de

Ficus religiosa

Induz celular parada do ciclo celular em linhas de cancro do colo do útero humano SiHa (HPV-16 positivo) e apoptose em células HeLa (HPV-18 positivo). PLoS ONE 8 (7): e70127. doi: 10.1371 /journal.pone.0070127

editor: Chunhong Yan, Albany Medical College, Estados Unidos da América

Recebido: 22 de fevereiro de 2013; Aceito: 14 de junho de 2013; Publicação: 26 de julho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Choudhari et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores obrigado IRSHA, Bharati University Vidyapeeth e CSIR para apoiar este trabalho. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer cervical é a segunda maior causa de morte por cancro nas mulheres em todo o mundo [1], [2]. De alto risco vírus do papiloma humano (HPV), como o HPV 16, 18, 31 e 33 foram atribuídos a ser os principais fatores de risco para o cancro do colo do útero, dos quais HPV-16 e -18 são responsáveis ​​por quase 70% dos cancros [ ,,,0],3]. E6 e E7 são oncoproteínas virais os dois necessários para o desenvolvimento e manutenção do fenótipo transformado em células de cancro do colo do útero. E6 promove a degradação de p53 através de uma via de proteassoma dependente de ubiquitina enquanto os associados com E7 do retinoblastoma (pRb) e a proteína interfere com a sua ligação a E2F [4], [5]. Isso resulta em perda de RB /complexos E2F levando à liberação de fator de transcrição E2F que induz a expressão de genes de proliferação celular [5].

Apesar de os tratamentos atuais podem curar a 80-95% do início de carreira e 60% dos cancros loco-regional avançada, a doença recorrente e metastático continua a ser um grande problema [6]. Recentemente, Medicina Alternativa e Complementar (CAM) está ganhando popularidade como uma abordagem quimiopreventivo para a gestão, bem como a prevenção de recorrência do câncer [7], [8]. Mais de 60% das drogas anti-cancro estão actualmente utilizados originalmente derivado a partir de fontes naturais tais como plantas, microrganismos e organismos marinhos [9]. Vários estudos científicos, incluindo o nosso, têm sugerido o potencial das plantas medicinais como anti-câncer droga candidatos [10], [11]. Recentemente, relatou o potencial anticancerígeno de

Cinnamomum cassia

(canela) no cancro do colo do útero [12].

Ficus religiosa

L. família Lauraceae, tem sido amplamente utilizada em a medicina tradicional para várias desordens. As suas diferentes partes foram utilizadas medicinalmente em diferentes formas, bem como em combinação com outras ervas [13], [14]. Tem sido demonstrado que exibem diversas actividades biológicas [14], incluindo a cicatrização de feridas [15], anti-bacteriana [16], anti-convulsivante [17], anti-diabético [18], [19], anti-inflamatório [20] , actividade de acetil colinesterase inibidora [21] e a actividade anti-ansiedade [22]. O extracto de acetona de

F. Religiosa

folhas foi mostrado para induzir a apoptose em linhas celulares de cancro da mama [14].

relataram recentemente a actividade antioxidante e citotóxica de

F. religiosa

casca em células cancerosas cervicais [23]. No presente estudo, investigamos o mecanismo molecular subjacente a putativa o potencial antineoplásico do extrato aquoso de

F. religiosa

(FR

aq) casca em câncer cervical. Os nossos dados sugerem que Ficus inibe o crescimento de linhas celulares de cancro do colo do útero, SiHa e HeLa, através da indução de paragem do ciclo celular e apoptose, respectivamente. Curiosamente, FR

aq reduziu significativamente a expressão de oncoproteínas virais E6 e E7, sugerindo assim o potencial terapêutico de

F. religiosa

em câncer cervical.

Materiais e Métodos

produtos químicos e reagentes

plasticware cultura de tecidos foi comprado de BD Biosciences (CA, EUA) e Axygen Scientific Inc ( CA, EUA). Modified Eagles Médium (DMEM) em pó, penicilina e estreptomicina de Dulbecco foram obtidos a partir de Invitrogen /Gibco (Grand Island, NY, EUA). de soro bovino fetal (FBS), 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-diphenylthiazolium brometo (MTT), FCCP, Ionomicina e JC-1 foram adquiridos a partir de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO ). O anticorpo primário contra p53 (DO-1), p21 (187), caspase-3 (H-277), cito-C (7H8), Her-2 (M-11), pRb (C-15), ppRb (SER 807/811), HPV16 E6 /18 E6 (C1P5), HPV16 E7 (ED17), HPV18 E7 (N-19) ou tubulina (B-7) foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, EUA ). Anexina V-FITC kit de apoptose # 3 foi adquirido a partir de Invitrogen (CA, EUA). Todos os outros reagentes comuns foram adquiridos a partir de Qualigens Fine Chemicals (Mumbai, Índia).

Preparação de extrato aquoso de

Ficus religiosa

(FR

aq) e PRELIMINARES fitoquímicos Investigações

A casca do Ficus

religiosa

L. foi coletado de Pune District, Maharashtra, Índia e foi autenticado como descrito anteriormente [23]. O espécime voucher (MPCC 2417) de espécies de plantas autênticas foi depositado no herbário de Plantas Medicinais Conservation Center (MPCC), Pune, Maharashtra, Índia. A casca foi pesado, em pó e extraída em água destilada duas vezes em um extrator de água quente como descrito anteriormente [23], [24]. O extracto resultante foi centrifugada a 13000 rpm durante 15 min para remover a matéria particulada. O sobrenadante foi ainda (tamanho dos poros, 0.45 um) usando filtro Swiney esterilizada por filtração, e o filtrado resultante foi armazenada em alíquotas a -80 ° C até à sua utilização. O rendimento do extracto seco obtido a partir do material em bruto de partida foi de 8,6% (w /w). A FR recentemente preparada

extracto aquoso foi testado qualitativamente a presença de flavonóides, fenóis, saponinas, taninos e hidratos de carbono, utilizando procedimentos convencionais de análise [25].

Cultura celular

O humana linhas celulares de carcinoma cervical, SiHa (HPV-16), HeLa (HPV-18) e C33A (HPV-negativos) foram obtidos a partir de National Center for Cell Science (NCCS), Pune, Maharashtra, índia. As células foram cultivadas em DMEM suplementado com 10% de FBS, 2 mM de L-glutamina, e antibióticos (100 unidades /ml de penicilina e estreptomicina). As células foram incubadas numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 incubadora a 37 ° C.

Análise de Crescimento de Células

O ensaio foi realizado como descrito anteriormente [12]. Resumidamente, as células SiHa e HeLa foram semeadas a uma densidade de 1 x 10

5 e 1,5 x 10

5 células /mL, respectivamente, em placas de 24 poços em triplicado. No dia seguinte, as células foram tratadas com diferentes concentrações de FR

aq (0-80 ug /ml) durante 24, 48 e 72 h. As células foram colhidas e contadas para a viabilidade utilizando o método de exclusão de corante azul de tripano [12], [26].

Crescimento celular em monocamada

O ensaio foi realizado como descrito anteriormente [12]. Resumidamente, as células SiHa e HeLa foram plaqueadas a uma densidade de sementeira de 1 × 10

3 células /ml em placas de 6 poços. Após 24 h, as células foram expostas a várias concentrações de FR

aq (0-80 ug /mL) seguido de incubação a 37 ° C em 5% de CO

2 incubadora durante uma semana na presença do extracto . Isto foi seguido pela fixação das colónias com paraformaldeído a 4% e coloração com violeta de cristal a 0,5%. As colônias foram fotografados com câmera Sony DSC-S75 Cyber-shot.

Crescimento Celular brandamente no Agar Ensaio

O ensaio foi realizado como descrito anteriormente [12], [26]. Resumidamente, as células SiHa e HeLa (5 x 10

3 células /ml), juntamente com diferentes concentrações de FR

aq (0-80 ug /ml) foram misturados com 0,35% de agarose (grau de ADN, Gibco BRL) em completar meio DMEM a 40 ° C e gelif içado à temperatura ambiente durante 20 minutos sobre uma camada previamente gelificado de 0,5% de agarose em meio completo em placas de 6 poços. Após a incubação durante duas semanas, as colónias foram contadas em 10 campos diferentes usando um Axiovert 200 M microscópio (Carl Zeiss, Alemanha) e o valor médio foi calculado.

Cicatrização Ensaio

Ambos SiHa e células HeLa foram semeadas a uma densidade de 4 x 10

5 /ml em placas de 24 poços e foram deixadas a aderir durante a noite a 37 ° C em 5% de CO

2 incubadora. No dia seguinte, as células foram privadas de soro durante 6 horas, seguido da adição de meio completo com ou sem FR

aq (0-80 ug /ml). Uma ferida artificial foi feita em placas contendo as células tratadas e não tratadas com uma ponta de micropipeta de 10 ul e a ferida foi deixada a curar durante 24 h a 37 ° C em 5% de CO

2 incubadora. As imagens para 0 h, bem como 16 h foram capturados com a ajuda de Axiovert 200 M microscópio. A extensão média de fecho de feridas foi avaliada através da medição da largura da ferida, utilizando o ImageJ 1.44p [27].

Matrigel transmembranar Invasão Ensaio

Para estudos de invasão, 24 bem BioCoat invasão Matrigel Chambers (BD Bioscience, Bedford, MA) foram utilizados [28]. células SiHa e HeLa (5 x 10

4) com ou sem FR

tratamento aquoso (0-80 ug /ml) foram semeadas em meio isento de soro para as câmaras superiores de invasão e deixou-se invadir através da Matrigel- membrana revestida durante 24 h. O meio contendo FBS a 10% foi adicionado para a câmara inferior, que serviu como um atractor quimioterapia. Após 24 h de incubação, as células não-invasoras foram removidos a partir do topo de cada membrana com cotonetes de algodão molhado; células invasoras ligados à parte inferior da membrana foram fixadas com 4% de formalina e coradas utilizando 0,5% de violeta de cristal. Os números de células foram contadas em cada dez de alta potência aleatório (× 20) campos usando Axiovert 200 M microscópio (Carl Zeiss, Alemanha) equipado com uma câmera de 3.3 mega pixels Sony Cyber-shot.

Gelatina zimografia

a actividade de MMP-2 no meio condicionado foi determinada por zimografia em gelatina, como descrito anteriormente [12]. Resumidamente, as células SiHa e HeLa foram semeadas a uma densidade de 4 x 10

5 células /ml em placas de 6 poços e deixou-se aderir durante a noite a 37 ° C em 5% de CO

2 incubadora. No dia seguinte, as células foram tratadas com várias concentrações de FR

aq (0-80 ug /ml), preparado em meio isento de soro e incubaram-se durante 24 h. No dia seguinte, o meio de cultura foi recolhido e centrifugado a 14000 rpm durante 20 min a 4 ° C para remover os detritos celulares. O meio condicionado a partir de células de controlo, bem como as células tratadas com FR

aq foi recolhido e concentrado em concentrador Centricon YM-30 tubos (Millipore, MA). As amostras contendo uma quantidade igual de proteínas totais, foram misturadas com tampão de amostra (SDS a 2%, glicerol a 25%, azul de bromofenol 0,1% e 60 mM de Tris-HCl pH 6,8) e sujeita em condições de não redução em SDS a 7,5% em gel de poliacrilamida contendo gelatina (0,5 mg /ml). Após a electroforese, o gel foi lavado com 0,25% de Triton X-100 e incubou-se durante a noite a 37 ° C em tampão contendo NaCl 150 mM, CaCl 100 mM de

2, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 1% de Triton X- 100, 0,02% de NaN

3. O gel foi corado com solução de coloração (0,1% de azul brilhante de Coomassie R-250 em 40% de isopropanol) e descorados em ácido acético a 7%. atividade gelatinolítica foi detectado como bandas coradas contra o fundo azul. A quantificação das bandas no controle e amostras tratadas foi realizada por análise densitométrica em Alpha Imager usando software Facilidade FC Alpha, Alpha Innotech.

Immunoblotting

células HeLa e SiHa foram semeadas a uma densidade de semeadura de 4 × 10

5 células /ml em placas de 6 poços e deixou-se aderir durante a noite a 37 ° C em CO

2 incubadora. No dia seguinte, as células foram expostas a várias concentrações de FR

aq (0-80 ug /ml) e incubou-se durante 24 h. Após a incubação, as células foram recolhidas por tripsinização, lavadas com 1 x PBS e proteína foi extraído como descrito anteriormente [12]. Resumidamente, os sedimentos celulares foram ressuspensos em tampão de lise de 60 ul contendo 50 mMTris (pH 7,4), EDTA 5 mM, NP40 a 0,5%, NaF 50 mM, DTT 1 mM, PMSF 0,1 mM, 0,5 ug /ml de leupeptina (Pro-puro Amersco , Solon, EUA), 1 ug /mL de pepstatina (Amresco, Solon, EUA), NaCl a 150 mM, 0,5 ug /ml de aprotinina (Amersco, Solon, EUA) e cocktail de inibidor de protease (Roche, Lewes, Reino Unido) e incubou-se em gelo durante 1 h com agitação intermitente. O extracto foi centrifugado durante 20 min a 4 ° C a 12000 rpm. Para a libertação de citocromo-c, foram preparadas fracções de citosol e mitocondrial, como descrito anteriormente [29]. A proteína foi estimada utilizando o reagente de Bradford (Biorad Laboratories Inc, CA, EUA). Uma quantidade igual de proteína foi carregada para ser 10% ou 12% (para a proteína E6) em gel de SDS-poliacrilamida e transferidas electroforeticamente para Amersham Hybond-P PVDF membrana (GE Healthcare, UK) em tampão de fosfato de sódio (pH 6,8). A membrana foi bloqueada em 5% de BSA em TST e incubadas a 4 ° C durante a noite com anticorpo primário contra p53, p21, caspase-3, cito-C, Her-2, pRb, ppRb, HPV16 E6 /18 E6, E7 de HPV16, HPV18 E7 ou tubulina (Santa Cruz, CA, EUA) a uma diluição 1:500. A membrana foi lavada em PCT e incubaram-se com IgG secundário conjugado com HRP em 1:5000 diluição. As proteínas foram visualizadas com um kit de quimiluminescência (kit Amersham ECL Avanço western blot detecção, GE Healthcare, UK) e análise de densitometria foi realizada em imagens immunoblot digitalizadas usando a ferramenta de análise de gel Imagem J.

Avaliação da parada do ciclo celular

para a análise do ciclo celular, linhas de células HeLa, SiHa e C33A foram plaqueadas a uma densidade de sementeira de 5 × 10

5 células /poço em placas de 6 poços e deixou-se aderir durante 24 h a 37 ° C em CO

2 incubadora. No dia seguinte, as células foram tratadas com FR

aq (0-80 ug /ml) durante 24 h. As células foram colhidas por tripsinização e fixada em gelo-etanol a 70% frio a -20 ° C durante 30 min. A seguir à lavagem com 1 x PBS, as células foram tratadas com RNase A (100 mg /ml) à temperatura ambiente durante 30 minutos e coradas com PI (20 ug /ml). As células coradas foram analisadas para a fluorescência de ADN-PI utilizando um citómetro de fluxo (FACS Calibur, BD). Um mínimo de 10.000 eventos foram contadas por amostra; os dados foram analisados ​​utilizando software de busca de células Calibur FACS (Becton Dickinson) para as proporções de células em G

0 /L

1, fase S e G

2 /M fases do ciclo celular.

a avaliação da apoptose

Para determinar o número de células que sofrem apoptose em cima FR

tratamento aquoso, HeLa, SiHa e C33A foram plaqueadas a uma densidade de sementeira de 5 × 10

5 células /poço em placas de 6 poços e deixou-se crescer durante a noite a 37 ° C em CO

2 incubadora. No dia seguinte, as células foram tratadas com várias concentrações de FR

aq (0-80 ug /ml) e incubou-se durante 24 h. As células foram coradas com anexina V-FITC de acordo com as instruções do fabricante (Anexina V-FITC kit de apoptose # 3, Invitrogen, Grand Island, NY). Um total de 10.000 eventos foram adquiridos e trama dupla parâmetro ponto de FL2-H (X-eixo; PI fluorescência, escala linear) versus FL1-H (eixo Y; Anexina V-FITC de fluorescência, linearscale) foi registada. Os dados foram analisados ​​utilizando o software FACS CaliburCell Quest (Becton Dickinson).

Análise de Membrana Mitocondrial Potencial (Δψm)

A citometria de fluxo análise foi realizada em células usando JC-1 do corante, como descrito anteriormente [12]. As células HeLa foram plaqueadas a uma densidade de sementeira de 5 × 10

5 placas células /poço em 6 poços e deixou-se aderir durante a noite a 37 ° C em CO

2 incubadora. No dia seguinte, as células foram tratadas com FR

aq (0-80 ug /ml) durante 24 h. Isto foi seguido de colheita das células, lavagem duas vezes com 1 x PBS, seguido de incubação com meio de cultura fresco contendo um corante JC-(2,5 ug /ml) durante 30 min a 37 ° C no escuro. As células coradas foram lavadas duas vezes com gelo frio 1 × PBS, ressuspensas em 1 ml de 1 x PBS e analisadas para Δψ

m

por citometria de fluxo. FCCP (10 uM) foi usada como um controlo positivo. Um mínimo de 10.000 eventos foram contadas por amostra e as intensidades de fluorescência foram medidos a 527 nm (verde) e 590 nm (vermelho).

Detecção de cálcio intracelular utilizando Fluo-3 /AM

As células HeLa foram plaqueadas a uma densidade de sementeira de 5 × 10

5 células /alvéolo em placa de 6 poços e deixou-se aderir durante a noite. No dia seguinte, as células foram tratadas FR

aq (0-80 ug /ml) durante 24 h a 37 ° C em 5% de CO

2. Após a incubação, os níveis intracelulares de Ca

2+ foram analisadas por citometria de fluxo como descrito anteriormente [12]. Resumidamente, as células foram carregadas com Fluo-5 3 /AM (Sigma, St. Louis, MO) e 100 ug /ml de Pluronic F127 (Sigma, St. Louis, MO) em tubos de centrifugação e incubadas a 37 ° C, 5% de CO

2 durante 1 h no escuro. As células foram ressuspensas, após cada 20 min para assegurar mesmo o corante de carga. Os sedimentos celulares foram lavados duas vezes com 0,9% de soro fisiológico e ressuspensas em 3 ml de Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS) em tubos de FACS. Ionomicina (30 ^ M) foi usada como um controlo positivo. intensidades de fluorescência foram medidas a 525 nm por FACS Calibur (Becton Dickinson Immunocytometry Sistemas, San Jose, CA) para obter as leituras da linha de base. A média de intensidades de fluorescência de canal foram calculados utilizando software CellQuest.

Análise Estatística

Todos os experimentos foram realizados em triplicata e repetido pelo menos três vezes e os dados foram apresentados como média ± SD. A análise estatística foi realizada com o programa SigmaStat 3.5 (Systat Software, Inc.), utilizando-se ANOVA com α = 0,05.

Resultados

Ficus Modula a cinética de crescimento de células de câncer do colo do útero

Temos relatado anteriormente que

F. religiosa

exibiu potencial antioxidante significativa, assim como a citotoxicidade em linhas celulares de cancro do colo do útero, células HeLa e SiHa [22]. Com base nisto, nós escolhemos concentrações não citotóxicas de FR

aq (0-80 ug /ml) para SiHa (HPV-16) e HeLa (HPV-18) em nossos ensaios. Observou-se que FR

aq diminuiu o crescimento das células de uma maneira dose e dependente do tempo. Em SiHa, FR

aq diminuiu o crescimento das células a 80 ug /ml de concentração por ~4.78- (p = 0,008), ~4.72- (p = 0,001) e ~3.42 vezes (p = 0,053) a 24, 48 e 72 h, respectivamente, em comparação com as células de controlo não tratadas (Figura 1A). Do mesmo modo, a 80 ug /ml de concentração de FR

AQ, células HeLa exibiu ~5.53- (p≤0.001), ~5.94- (p = 0,010) e ~6.37 vezes (p = 0,001) diminuição do crescimento celular a 24, 48 e 72 h, respectivamente, em comparação com as células de controlo não tratadas (Figura 1B). Isto foi ainda apoiado pela formação de colónias e os ensaios de agar mole, em que uma diminuição dependente da dose no número de colónias foi observada em ambas as linhas celulares de cancro do colo do útero (Figura 1C e D, respectivamente). Curiosamente, a 80 ug /ml de concentração, FR

aq reduziu significativamente o número de colónias em células HeLa (~4.97 dobra; p≤0.001) e SiHa (~2.95 dobra; p≤0.001) em comparação com as respectivas células de controlo não tratadas ( Figura 1D). Assim, Ficus regulada a cinética de crescimento de células de cancro do colo do útero de modo significativo. Como controlo negativo, tomamos C33A (negativo HPV) linha de células e analisou a citotoxicidade de FR

aq nele. Ficus não induziu qualquer citotoxicidade até 160 ug /ml de concentração em células C33A, que foi semelhante ao observado em SiHa e HeLa (Figura S1). No entanto, a concentrações mais elevadas, FR

aq citotoxicidade induzida em todas as três linhas de células, em que as células HeLa e C33A mostraram efeito citotóxico semelhante.

SiHa (A) e HeLa (B) foram tratadas com FR

aq (0-80 ug /ml) durante 24-72 h e o número de células viáveis ​​foram contadas utilizando o método de exclusão de corante azul de tripano. Os dados representam a média ± SD de três experiências independentes. (C) As linhas celulares de cancro do colo do útero (SiHa e HeLa) foram tratados com FR

aq (0-80 ug /ml) durante uma semana. As colónias foram coradas com violeta cristal e fotografada. As experiências foram repetidas três vezes. (D) Ambos SiHa e HeLa (5 x 10

3) juntamente com FR

aq (0-80 ug /ml) foram cultivados em agar mole por duas semanas. As colónias foram contadas a partir de pelo menos 10 áreas diferentes e a média de cada um foi representada graficamente. Os dados representam média ± SD de cinco experimentos independentes.

Ficus Induz G Detenção

1 Fase em SiHa e altera a expressão de proteínas reguladoras do ciclo celular

Para analisar o mecanismo atrás da regulação mediada Ficus da cinética de crescimento em células de cancro do colo do útero, investigou-se a distribuição do ciclo celular em SiHa, HeLa e C33A. Citometria de fluxo mostrou que, em presença de FR

AQ, SiHa exibiram um aumento em L

1 população com uma redução simultânea da fase S num (Figura 2A) dose-dependente maneira. Curiosamente, a 80 ug de concentração /mL, houve um aumento na percentagem de células em G

1 fase (59,88-72,33%) com uma redução simultânea na população em fase S (15,98-8,50%, p 0,050). Por outro lado, em células HeLa, houve um aumento significativo na sub-L

0 população (3,65-87,38%, p 0,001), indicando população apoptótica (Figura S2). Curiosamente, em doses não tóxicas, FR

aq não afetou o crescimento de células C33A negativo HPV (Figura S2).

células SiHa foram tratadas com diferentes concentrações de FR

aq (0- 80 ug /ml) durante 24 h. (A) a acumulação melhorada das células em G

1 fase, com uma diminuição concomitante na população da fase S foi observada após tratamento com Ficus (como indicado por histogramas). Western blot mostra os níveis de p53 e pRb (B), bem como o p21 e ppRb (C) de expressão. Tubulina foi utilizada como um controlo de carga. Análise (D, E) densitométrica do Western blot que mostra a mudança vezes nos níveis de proteína mediante FR

aqtreatment. As bandas foram quantificados por densitometria usando ImageJ 1.44p (Wayne Rasband, National Institutes of Health, EUA, https://imagej.nih.gov/ij). Os dados representam média ± DP de três experiências independentes.

Nós investigamos o mecanismo de G 1 /S prisão fase

em SiHa avaliando a expressão de G

1 proteínas do checkpoint tais como p53, pRb, fosfo Rb (ppRb) e p21. Houve um aumento significativo na expressão de p53 (Figura 2B e D), bem como o seu efector a jusante, p21 (Figura 2C e E) após tratamento das células com FR

aq. A expressão de pRb foi analisado desde desfosforilado pRb é conhecido por formar complexos com E2F para reprimir a transcrição de genes de células proliferativas [30]. FR

AQ, aumentou significativamente a expressão de pRb (Figura 2B e D), com um simultâneo decréscimo nos níveis de ppRb (Figura 2C e E) de um modo dependente da dose. Estes resultados sugerem que induzido Ficus prisão L

1 /S em SiHa através da modulação da expressão das proteínas reguladoras do ciclo celular.

Ficus induz a apoptose em células HeLa através do aumento da Cit c e caspase 3 Expressão

Nós descobrimos que em células HeLa, resultou em tratamento Ficus aumento no número de células em sub-L

0 fase, indicativo da população apoptótica (Figura S2). Na coloração com anexina V-FITC, as células mostraram um aumento dependente da dose, tanto no início, bem como população celular por apoptose tardia (Figura 3A). Curiosamente, a 80 ug /ml FR

aq concentração, houve ~4.4 vezes (p≤0.050) e aumento ~5.5 vezes (p≤0.050) em ambos precoce, bem como população celular por apoptose tardia, respectivamente, em comparação para as células de controlo não tratadas. Por outro lado, não foi observada apoptose em FR

aq tratada SiHa ou células C33A (Figura S3).

(A) pictogramas representativas FACS de células tratadas com FR

aq (0-80 ug /mL) estão indicados. Por cento das células (early-apoptóticos, quadrante inferior direito) anexina V-positivas e anexina V /PI células-double-positivo (células late-apoptóticos, quadrante superior direito) são indicados. (B) A análise de citometria de fluxo de a libertação de cálcio em células HeLa rápida após o tratamento com FR

aq (0-80 ug /ml) foi mostrado. Ionomicina foi usada como um controlo positivo. Os dados representam média ± SD de três experiências independentes. (C) Análise FACS seguinte JC-1 coloração de células HeLa mostraram alteração do potencial de membrana mitocondrial após o tratamento FR

aq (0-80 ug /ml) em comparação com células de controlo não tratadas. Os dados representam média ± SD de três experiências independentes. (D) mancha de Western mostra a expressão do citocromo c a partir da fracção citosólica. Tubulina foi utilizada como um controlo de carga. (E) A proteína total foi isolado e analisado quanto à expressão de p53 e caspase 3 por imunotransferência. Tubulina foi utilizada como um controlo de carga. (F e G) A análise densitométrica do Western blot que mostra a mudança vezes nos níveis de proteína. As bandas foram quantificados utilizando ImageJ 1.44p (Wayne Rasband, National Institutes of Health, EUA, https://imagej.nih.gov/ij).

Foram estudados Ca

2 + mecanismo em células tratadas com FR

aq e observados que induziu um aumento dependente da dose nos níveis de cálcio intracelular (Figura 3B) de sinalização. Ionomicina foi usada como um controlo positivo. Curiosamente, o aumento do cálcio intracelular resultou em ruptura do potencial de membrana mitocondrial (Δψm) que foi observado pela diminuição da intensidade de fluorescência vermelha, depois de corar as células com o corante JC-1 (Figura 3C). Houve ~ 3 vezes redução na intensidade de fluorescência vermelha (p≤0.001) a 80 ug /ml de concentração de FR

aq. FCCP foi usada como um controlo positivo no estudo. A despolarização da membrana mitocondrial foi associado com um aumento dependente da dose no citocromo c citossólico (Figura 3D e F) que foi acompanhado por um aumento na expressão de caspase 3 e p53 (Figura 3E e G). Estes resultados indicam que a apoptose induzida Ficus em HeLa através de via dependente mitocondrial.

Ficus Diminuições invasão e migração de células HeLa e SiHa

ensaio de cicatrização de feridas foi realizada em ambas as linhas celulares e verificou-se que Ficus inibiu eficazmente a migração dos SiHa (Figura 4A) e HeLa (Figura 4B) numa dose e modo dependente do tempo em comparação com as células de controlo não tratadas. Após 16 h, as células SiHa e HeLa não tratadas foram capazes de encobrir ~82% da ferida, enquanto que a 80 ug /ml de FR

tratamento aquoso, as células coberto a ferida por ~33% (p 0,001 ) e 22% (p 0,001), respectivamente (Figura 4C). A esta dose particular, Ficus reduziu a capacidade invasiva de ambos SiHa e HeLa por ~2.45- (p≤0.001) e ~3.8-dobras (p≤0.001), respectivamente, em comparação com as células de controlo não tratadas (Figura 4D).

Análise da migração de células SiHa em (a) e HeLa (B) tratou-se com FR

aq (0-80 ug /ml) foi medida por ensaio de cicatrização da ferida. O painel superior da imagem mostra a ferida feita a 0 h. O painel inferior mostra a migração de células correspondentes com a distância percorrida a 16 h. (C) Representação gráfica de fechamento da ferida em células SiHa e HeLa em 16 horas após a FR

tratamento aq foi mostrado. Os valores foram representados como o fechamento da ferida por cento e expressos como média ± DP de três experiências independentes. (D) Ensaio de invasão celular que mostra a percentagem de células invadidas por campo, na presença ou ausência de FR

aq. As células invadidas foram contados em dez campos aleatórios e os valores foram expressos como média ± DP de três experiências independentes. (E) zimografia mostrando a regulação negativa da expressão de MMP-2 em FR

aq (0-80 ug /ml) tratada SiHa e HeLa. (F) análise de transferência de Western que mostra a diminuição na expressão de Her-2 em SiHa e HeLa tratadas com FR

aq (0-80 ug /ml). Tubulina foi utilizada como um controlo de carga. análise (G) densitométrica do Western blot mostrando a mudança vezes em HER-2 níveis de proteína em SiHa e HeLa. As bandas foram quantificadas por densitometria utilizando o ImageJ 1.44p (Wayne Rasband, National Institutes of Health, EUA, https://imagej.nih.gov/ij).

é bem sabido que o aumento da expressão das MMPs em tecidos tumorais está associada com a degradação da matriz de células de cancro, invasão, bem como metástase [31]. Observou-se que FR

aq significativamente regulada negativamente a expressão de MMP-2 em ambas as SiHa e HeLa (Figura 4E), em comparação com as células de controlo não tratadas.

HER2 /

neu

tem sido relatado para aumentar o potencial metastático de células de cancros [32] e está positivamente correlacionada com a expressão de MMP-2 [33]. Descobrimos que FR

aq diminuiu a expressão de Her-2 de um modo dependente da dose em ambas as SiHa e HeLa (Figura 4F e G). Os dados sugerem que Ficus reduziu a migração, bem como a invasão das células cancerosas do colo do útero através da modulação da expressão do HER-2 proteínas e MMP-2.

Ficus Reduz a expressão de viral oncoproteínas E6 e E7

Uma vez que, Ficus exibiu potencial antineoplásica significativa tanto de HPV16 (SiHa) e linhas de células positivas de HPV18 (HeLa), foi investigada a expressão das proteínas virais E6 e E7 nas células tratadas e não tratadas. Observou-se que, FR

aq reduziu significativamente a expressão de E6 e E7 oncoproteínas em ambos SiHa e HeLa (Figura 5A e B, respectivamente). A 80 ug /mL FR

aq concentração, a expressão das proteínas E6 e E7 foram diminuiu ~3.0- (p≤0.001) e 3,7-dobras (p≤0.001), respectivamente, em SiHa (Figura 5A e C) e por ~3.2- (p≤0.001) e 4,0-dobras (p≤0.001), respectivamente, em células HeLa comparação com as células de controlo não tratadas (Figura 5B e D). Assim, Ficus diminuiu a expressão de oncoproteínas virais E6 e E7, o que potencia a sua importância na regulação terapêutica do cancro.

A expressão de oncoproteínas E6 e E7 foi determinada por imunotransf erência com anticorpos E6 e E7 em SiHa (A) e HeLa (B) tratou-se com FR

aq (0-80 ug /ml). Tubulina foi utilizada como um controlo de carga. A análise densitométrica do Western blot que mostra a mudança vezes nos níveis de proteínas E6 e E7 em cima FR

tratamento aquoso em SiHa (C) e HeLa (D).