Abstract

Os microtúbulos são um alvo altamente validada na terapia do cancro. No entanto, o desenvolvimento clínico de agentes de ligação de tubulina (TBA) tem sido dificultada por problemas de toxicidade e quimiorresistência e exigiu a busca de novos TBA. Aqui, relatamos a identificação de uma nova molécula celular permeável, desestabilizando-tubulina – 4,5,6,7-tetra-hidro-1H-indazole-3-carboxílico [1p-tolil-met- (E) -ilideno] -hidrazida (denominado como Suprafenacine, SRF). SRF, identificado por

in silico

rastreio de bibliotecas químicas anotados, foi mostrado para ligar microtúbulos no local de colchicina de ligação e inibir a polimerização. Isto levou a paragem do ciclo L

2 /M celular e morte celular apoptótica através de uma via mediada por mitocôndrias. A morte celular foi precedida por perda de potencial de membrana mitocondrial, JNK – mediada por fosforilação de Bcl-2 e Bad, e a activação de caspase-3. Curiosamente, SRF foi encontrado para inibir selectivamente a proliferação de células cancerosas e era eficaz contra as células cancerosas resistentes a drogas, em virtude da sua capacidade de contornar a resistência a múltiplos fármacos transportador de P-glicoproteína. Tomados em conjunto, os nossos resultados sugerem que a SRF tem potencial como um agente quimioterapêutico para o tratamento de câncer e proporciona uma armação alternativo para o desenvolvimento de agentes anti-câncer melhoradas

Citation:. Choi BH, Chattopadhaya S, Thanh LN, Feng G, Nguyen QT, Lim CB, et al. (2014) Suprafenacine, um agente indazole-hidrazida, ataca as células cancerosas através de microtúbulos desestabilização. PLoS ONE 9 (10): e110955. doi: 10.1371 /journal.pone.0110955

Autor: Ben CB. Ko, da Universidade Politécnica de Hong Kong, Hong Kong

Recebido: 10 de outubro de 2012; Aceito: 26 de setembro de 2014; Publicação: 29 de outubro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Choi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Ministério da Saúde de Cingapura Grant NMRC1177 /2008. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Os microtúbulos – polímeros longos, filamentosas, em forma de tubo – mediar papéis importantes na sinalização celular, transporte de cargas, estabelecimento de polaridade celular, a manutenção da forma da célula, migração celular e divisão celular [1], [2]. Composto por heterodímeros a- e ß-tubulina ligados de uma forma head-to-tail, os microtúbulos não são polímeros de equilíbrio simples; em vez disso eles são altamente estruturas dinâmicas e a montagem e desmontagem dinâmica rápidos é crucial, em grande parte para as suas funções celulares. Não surpreendentemente, microtúbulos de polimerização está sujeito à regulação espacial e temporal apertado e isso é conseguido em vários níveis, incluindo (1) a transcrição de diferentes isotipos de tubulina com funções diferentes; (2) através da regulação α /β – rácios de tubulina e heterodímero de dobragem (3) através de várias modificações pós-traducionais de tubulina, que, por sua vez, altera a localização de microtúbulos e /ou a sua interacção com as vias de sinalização e (4) através da interacção com microtubule- proteínas associadas (MAPs), como dineína e proteínas do motor cinesina, stathmin, TOG, EB1, dinactina 1, RAC1 etc [3] – [5]. Paradoxalmente, a mesma natureza dinâmica dos microtúbulos também os torna extremamente sensível a inibidores. Ao interromper o comportamento afinado de microtúbulos, drogas de ligação a tubulina de interferir com o processo de divisão celular e demonstraram ser altamente eficaz em pacientes com cancro [6].

A maioria das drogas de ligação a microtúbulos identificada até agora foram isolados a partir de plantas ou organismos marinhos durante telas em grande escala de produtos naturais. drogas anti-mitóticas alvo-microtúbulos são geralmente classificados em dois grupos – os agentes de desestabilização de microtúbulos tais como alcalóides vinca, colchicina e agentes de estabilização de microtúbulos, como paclitaxel e docetaxel. Embora os taxanos e alcalóides de vinca ainda são administrados por uma grande variedade de cancros e são muitas vezes integrados em regimes de combinação de quimioterapia [7], [8], o conjunto actual de medicamentos de ligação à tubulina tem vários inconvenientes. Em comparação com outras drogas anti-cancro, drogas de ligação a microtúbulos são estruturalmente complexa, quimicamente diverso e têm baixa solubilidade. Além disso, as drogas ativas ocorrem em quantidades apenas hora em natureza e da escassez de suas fontes naturais tem prejudicado gravemente o seu desenvolvimento clínico. Embora esta questão foi abordada pelo desenvolvimento de métodos parciais ou totais de síntese [9] e através de engenharia metabólica de intermediários da via [10], o problema ainda persiste em que o desenvolvimento de novos compostos de ligação de microtúbulos estão em causa. Outra desvantagem é a resistência à droga causada por mutações e /ou a expressão de diferentes isotipos de tubulina como βIII-tubulina. A resistência às drogas pode também resultar da sobre-expressão de bombas de efluxo drogas, incluindo a resistência a múltiplas drogas transportador P-glicoproteína (P-gp) ou multirresistência proteína associada (MRP) [11]. Os pacientes a ser administrados com agentes de ligação de microtúbulos tendem a sofrer de neuropatia axonal periférica que limita a dose tolerável [12]. Apesar destas limitações, várias drogas anti-mitóticas com diversos locais de ligação na tubulina estão em vários estágios de desenvolvimento clínico. O arsenal de agentes alvo-microtúbulos com uma melhor farmacocinética e perfis farmacocinéticos, uma toxicidade neurológica mínima e eficácia de largo espectro, continua a crescer [13] – [15]. Idealmente, esses leads também deve ser desprovido de efluxo de drogas P-mediada-gp e ser passíveis de abordagens de síntese química fáceis.

Neste trabalho relatamos um novo composto com base no cadafalso indazole, 4,5,6 , 7-tetra-hidro-1H-indazole-3-carboxílico [1p-tolil-met- (e) -ilideno] -hidrazida (Suprafenacine ou SRF), que mostra as propriedades anti-cancro potentes. Discute-se a identificação de SRF usando

in silico

abordagem high-throughput screening, sua otimização química e elucidação de seu modo de ligação de microtúbulos. SRF desestabiliza os microtúbulos que conduzem à paragem do ciclo celular na fase G2 /M e a morte celular por apoptose. Além disso, mostramos que SRF pode ignorar o transportador da glicoproteína P, visa especificamente as células cancerosas e é eficaz contra vários tipos diferentes de câncer.

Materiais e Métodos

Chemicals e anticorpos

Nocodazol, o paclitaxel (Taxol), vinblastina, colchicina e foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). SRF foi comprado de ChemDiv enquanto SB203580, PD98059 e SP600125 eram da Calbiochem (San Diego, CA). Os anticorpos foram obtidos a partir das seguintes empresas: vimentina, α- e β-tubulina, de JNK-1, MDR-1, Bcl-2, 2-pBcl (T56), pBcl-2 (S70), pBcl-2 (S87) ( Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA); pp38, pErk1 /2, pJNK (Cell Signaling Technology, Denver, MA); Os anticorpos monoclonais anti-glicoproteína P (MDR) (Sigma, EUA) e actina foram monoclonal da BD Pharmingen (San Diego, CA). [

3H] vinblastina (actividade especifica, 11,6 Ci /mmol) e silicato de ítrio de ensaio de proximidade de cintilação grânulos revestidos com estreptavidina (SPA) foram adquiridos a partir de GE Healthcare (Buckinghamshire, Reino Unido). [

3H] colchicina (actividade especifica, 80,4 Ci /mmol) foi obtido a partir de Perkin Elmer (Boston, MA, EUA).

Cultura celular

linhas celulares de cancro humano (HeLa, MDA -MB-231, A549, HCT15, Jurkat, PC12 e SH-SY5Y) e linhas celulares de fibroblastos humanos (CCL-116 e WI-38) foram obtidos de American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, EUA). SNU16, linha de células de cancro do estômago humano, foi obtido a partir coreano celular Linha Bank (KCLB, Seoul, Coreia do Sul). O epitelial F10 humano linha celular primário, e a linha celular parental para os mutantes resistentes aos medicamentos, KB-3-1, e multi-resistente linha, KB-V1 foram uma generosa oferta do Dr. Peter Dröge (NTU, Singapore) e Dr. M. Gottesman (NCI, Bethesda, MD), respectivamente [16]. As linhas celulares foram cultivadas em qualquer Modified Eagle Médium da Dulbecco (DMEM) ou meio RPMI 1640 contendo soro bovino fetal a 10%, 1% de penicilina /estreptomicina e mantido a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 câmara. Para KB-3-1 e KB-1V, o meio foi suplementado com piruvato de um adicional de 1 mM de sódio e 10 ug /ml de vinblastina, respectivamente. Todas as linhas resistentes foram incubadas em meio isento de fármaco antes dos ensaios de proliferação celular.

análise do ciclo celular

a progressão do ciclo celular foi monitorizada utilizando ADN por citometria de fluxo. As células foram semeadas a uma densidade de aproximadamente 2 × 10

5 células /poço numa placa de 24 poços. Quando as monocamadas estavam 50-70% confluentes, as células foram tratadas com fármacos, tal como indicado. Após 24 h de tratamento, as células foram tripsinizadas, lavadas com PBS e fixadas em etanol a 80% durante 1 h a -20 ° C. As células fixadas foram ressuspensas em iodeto de propídio (PI) a coloração de tampão (10 mM Tris-HCl pH 8,0, NaCl 10 mM, 50 ug /mL de PI, 10 ug /L de ARNase A, 0,1% de NP-40) durante 30 min a 4 ° C no escuro. O teor de ADN foi determinado com um sistema FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA). Para cada análise, 10.000 células foram contadas e a percentagem de células em cada fase foi calculada utilizando o software ModFit LT.

Apoptose Os ensaios

A apoptose foi monitorizada utilizando anexina V-iodeto de propídio (PI) duplo método de coloração. As células foram coradas utilizando o kit de coloração de anexina V-FLOUS (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) de acordo com as instruções do fabricante. As células foram analisadas por um citómetro de fluxo BD LSR II (BD Biosciences, San Jose, CA) utilizando a 488 laser azul nm para excitação e um 505LP espelho-530/30 pb de filtro e 550LP espelho-575/26 BP combinações de filtros para detectar fluoresceína e PI fluorescência, respectivamente. Para cada amostra, foram coletados 10.000 eventos.

mitocondrial potencial de membrana Medições

Alterações no potencial da membrana mitocondrial foi detectada utilizando o Kit de Detecção de potencial de membrana mitocondrial (Stratagene, Cedar Creek, TX) e baseados sobre a utilização do corante catiónico, 5,5 ‘, 6,6′-tetracloro-1,1′, 3,3’- iodeto tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine (vulgarmente conhecido como JC-1). JC-1 forma fluorescente vermelho agregados em mitocôndria de células intactas, enquanto nas células apoptóticas, colapso do potencial mitocondrial faz com JC-1 para permanecer no citoplasma, na sua forma monomérica verde. Resumidamente, as células foram tratadas com o SRF, na presença ou ausência de inibidor de JNK SP600125, e incubadas durante a noite. As células foram então tripsinizadas, lavadas com PBS e sedimentadas (400

g

, 5 min, RT). Em seguida, peletes (1 × 10

6 células /amostra) foram ressuspensas em 500 ul de uma solução de coloração X JC-1 e incubadas durante 15 min a 37 ° C em 5% de CO

2 atmosfera humidificada. Após lavagens com 2X tampão de ensaio, as células foram ressuspensas no volume final de 500 ul de tampão de ensaio. intensidades de fluorescência foram medidos num FACSCalibur Sistema BD (BD Biosciences, San Jose, CA) e o software CellQuest foi usada para análise de dados. A perda de potencial mitocondrial foi medido como a razão entre a fluorescência vermelho-para-verde; em comparação com células não tratadas, este rácio irá diminuir em células apoptóticas.

Activação de Caspase Ensaio

a actividade da caspase-3 foi medida utilizando o sistema de ensaio de CaspACE (Promega, Madison, WI) de acordo com o fornecedor de protocolo. Resumidamente, 2 × 10

5 células /poço foram semeadas numa placa de 6 poços. Quando as monocamadas estavam 50-60% confluentes, as células foram tratadas com o SRF na presença ou ausência do inibidor de JNK, SP600125 e incubadas durante a noite a 37 ° C em 5% de CO

2 atmosfera humidificada. Depois as células foram colhidas, pelotas foram lavadas com PBS gelado e ressuspensas em tampão de lise celular. método de congelação-descongelação foi utilizado para lisar as células e os lisados ​​foram mantidas em gelo durante 15 min. Após clarificação dos lisados ​​por centrifugação (15, 000

g

, 20 min, 4 ° C), o sobrenadante foi utilizado para determinar a actividade da caspase-3. Numa placa de 96 poços, 2 ul (10 mM) do substrato Ac-DEVD-pNA foi adicionado à mistura de reacção contendo o lisado celular, DTT, caspase Tampão de Ensaio e água desionizada num volume final de 100 ul. As placas foram incubadas durante a noite a 20-22 ° C durante 4 h e a absorvância foi medida a 405 nm utilizando um leitor de microplacas de Referência Além disso, (Bio-Rad, Hercules). extractos de células não tratadas foram utilizados como controlo para as experiências.

Microscopia de imunofluorescência

para imuno-histoquímica, as células foram fixadas com 3,7% de PFA seguido de incubação numa solução de bloqueio (5% BSA em PBS) durante 30 min a 4 ° C. Após lavagens 3X PBS, as células foram permeabilizadas com 0,2% de Triton X-100, lavou-se 3 x com PBS e depois incubadas durante a noite com a- ou p-tubulina anticorpos a 4 ° C. Após a lavagem, as amostras foram incubadas com o anticorpo 488 AlexaFluor secundário conjugado (Molecular Probes, Eugene, Oregon) durante 1 h à temperatura ambiente. As lâminas foram montadas utilizando a solução Prolongar ouro anti-fade (Molecular Probes, Eugene, Oregon) contendo DAPI e visualizado pelo aumento 60x em um microscópio confocal de varrimento laser Zeiss LSM META510. Todo o processamento e análise de imagem pós-aquisição foi feito usando o software Metamorph (dispositivos Molecular, LLC, Sunnyvale, CA).

In Vitro

Tubulin Polimerização Ensaio

Tubulin polimerização foi medido

in vitro

usando o kit de polimerização de tubulina Assay (citoesqueleto, Denver, CO). Tubulina foi dissolvido em tampão 1 (PIPES 80 mM, MgCl 2 mM de

2, EGTA 0,5 mM, pH 6,9, 10 uM repórter fluorescente, GTP 1 mM) a uma concentração final de 10 mg /ml. Para ensaiar a polimerização da tubulina, uma mistura contendo 85 uL de tubulina (concentração final de 2 mg /ml), GTP 4,4 ul (100 mM), 280 ul de tampão 1 e 75 uL de tubulina tampão de glicerol (PIPES 80 mM, MgCl 2 mM

2, 0,5 mM de EGTA, 60% de glicerol, pH 6,9), foi feita e mantida em gelo. Em seguida, 5 ul de composto de teste, o paclitaxel, nocodazol tampão ou controlo foi aliquotado em cada poço de uma metade da área de 96 poços, placa preta, de fundo plano (Corning Costar). A placa foi aquecida durante 1 min num leitor de placas de 37 ° C pré-aquecido. A polimerização foi iniciada por pipetagem de 50 ul de mistura de reacção /poço e monitorada pela medição da alteração na fluorescência (E

X = 360 nm; E

m = 420 nm). Medição foi feita usando Spectrafluor Além disso leitor de microplacas (TECAN GmbH, Áustria). As leituras foram realizadas a cada minuto por 1 h (total de 61 leituras).

Tubulin Competição de Ligação de Proximidade de Cintilação Ensaio

Este ensaio foi realizado para a ligação concorrência à colchicina e vinculativa vinblastina sites na tubulina e realizado em uma placa de 96 poços. tubulina marcada com biotina (Cytoskeleton, Denver, CO) foi dissolvido em tampão G-PEM (80 mM de PIPES, pH 6,8, MgCl 2 mM de

2, EGTA 0,5 mM, GTP 1 mM e glicerol a 10%) para uma concentração final de 0,8-1 mg /ml. [

3H] colchicina ou [

3H] vinblastina (concentração final de 50 nM e 100 mM, respectivamente), 50 uM de SRF e 1,0 ug de tubulina marcada com biotina foi misturado em um volume de reacção final de 100 uL de G-PEM de tampão e incubou-se durante 45 min a 37 ° C. esferas de estreptavidina SPA (80 ug /poço) foi adicionada a cada mistura de reacção e incubado durante mais 30 min a 4 ° C. As contagens radioactivas foram medidos utilizando um contador de cintilação Wallac Microbeta (Perkin Elmer, Waltham, MA). Para reacções de controlo, SRF foi omitido da mistura de reacção.

In Vivo

Eficácia Estudos

imunodeficiência combinada grave (SCID) camundongos fêmeas, 4-6 semanas de idade, foram obtidas a partir de animal Resources Centre (Murdoch, Austrália). Os ratinhos foram implantados subcutaneamente no flanco com 1 x 10 7

HCT15 células de adenocarcinoma do cólon humano. O tratamento começou quando o tamanho do tumor atingiu um 100-200 mm

3 ou maior. Os animais foram tratados por via intraperitoneal (i.p.) com 20 mg /kg SRF /dose, em formulação de dosagem final ou um veículo de solução salina a 0,9%. Composto foi dado a ratos portadores de tumores nos dias 1, 4 e 7 após a encenação, e massa tumoral [(comprimento x largura

2) /2] foi determinada uma vez por três dias para 9 dias.

análise estatística

Todas as experiências foram repetidas, independentemente, um mínimo de três vezes. Todos os dados quantitativos são apresentados como médias ± SEM. As comparações entre os dois grupos foram analisados ​​por meio do aluno

t

de teste e valores de

P

. 0,05 foram considerados significativos

Resultados

Identificação da SRF como um romance pequena molécula de ligação à tubulina

para identificar novas moléculas anticancerígenos que actuam via ligação a tubulina, iniciamos um destino baseado em

in silico

rastreio de moléculas pequenas utilizando uma biblioteca ChemDiv . Os acertos iniciais identificados a partir da tela virtual foram testados quanto à sua capacidade de inibir tanto a proliferação celular e a polimerização da tubulina. De todos os compostos testados, um derivado de hidrazida indazol – ácido 4,5,6,7-tetra-hidro-1H-indazole-3-carboxílico [1- (3-hidroxi-4-metoxi-fenil) -met- (E) – ilideno] -hidrazida, foi encontrado para inibir potentemente polimerização dos microtúbulos (IC

50 = 0,77 uM). Para identificar adicionalmente os análogos com potências melhoradas, do relacionamento estudos estrutura-actividade (SAR) foram realizadas [Métodos S1] e uma biblioteca orientada de 72 foi sintetizado análogos e rastreados quanto à sua capacidade para inibir a polimerização de microtúbulos. Este esforço identificado o análogo 4,5,6,7-tetra-hidro-1H-indazole-3-carboxílico [1-

P-

tolil-met- (E) -ilideno] -hidrazida (análogo de 4; daqui em diante referido como SRF), como uma molécula potente (IC

50 = 0,38 ^ M) [Figura 1A].

(a) estrutura química de SRF. (B) Efeito da SRF sobre a polimerização dos microtúbulos

in vitro

. tubulina purificada foi incubada a 37 ° C na ausência (DMSO) ou na presença de fármacos, como o taxol (3 fiM), nocodazol (10 uM), SRF e a absorvância foi medida a 420 nm a cada 1 min ao longo de um período de 60 min. SRF inibida microtúbulos de polimerização de um modo dependente da concentração, tal como foi indicado por uma diminuição na absorvância com o tempo. (C) Micrografia confocal de células HeLa expostas à SRF, taxol e nocodazol. As células foram marcadas com anticorpo anti-tubulina conjugado com FITC. tratamento SRF destrói completamente a rede de microtúbulos intrincado. Barra de escala = 10 uM.

SRF inibe a proliferação celular de vários tipos de células de cancro

Foi utilizado um ensaio colorimétrico para avaliar o efeito anti-proliferativo de SRF em células de cancro de um derivado amplo espectro de tipos de tumores representativos – adenocarcinoma do colo do útero (HeLa, KB-3-1, KB-V1), o linfoma de células T (Jurkat), carcinoma gástrico (SNU-16), o cancro da mama (MDA-MB-231), pulmão cancro (A549), adenocarcinoma colorrectal (HCT-15) e neuroblastoma (SH-SY5Y) [Tabela 1]. Todas as linhas celulares tumorais testadas mostrou susceptibilidade à SRF com IC

50 valores na gama submicromolar (83-381 nM). Curiosamente, quando comparado com o taxol, SRF apresentaram maior potência para as HCT-15 linhas de células de neuroblastoma SH-SY5Y e adenocarcinoma colorretal. Além disso, nós também testou o efeito da SRF em células normais como linha de células de fibroblastos da pele CCL-116 e epitelial F10 linha de células primárias humanas. Ambos CCL-116 e F10 mostrou maior do que 80% de sobrevivência após uma exposição de 24 h à SRF, enquanto a sobrevivência de apenas 60% foi observada quando as mesmas células foram tratadas com taxol em condições idênticas [Figura S1]. Tomados em conjunto, nossos dados confirmam que a SRF visa seletivamente as células cancerosas e é eficaz contra vários tipos diferentes de câncer.

SRF pode ignorar a bomba de efluxo de drogas

da glicoproteína-p

O sucesso clínico de as drogas usadas no tratamento do cancro tem sido dificultada pelo desenvolvimento de resistência aos fármacos. O fenómeno de resistência a múltiplos fármacos é frequentemente associada com um aumento na expressão de

MDR1

gene, que codifica a P-glicoproteína (P-gp), uma bomba de efluxo dependente da energia. Para ser clinicamente relevante, SRF deve ser capaz de ignorar o efluxo de P-mediada-gp. Por conseguinte, determinado efeito de SRF sobre a proliferação de linha celular de carcinoma epidérmico KB-V1, uma sublinha resistente a vinblastina parental derivada da KB-3-1 células [16] [Tabela 2]. As células KB-V1 são altamente enriquecida no P-gp e que mostram a resistência cruzada a colchicina e a adriamicina [Figura S2]. Comparação do efeito anti-proliferativo mediado por SRF e o taxol revelado que SRF é 35 vezes mais potente do que o taxol contra a linha de células KB-V1, enquanto ambos os compostos demonstraram uma eficácia semelhante contra a KB-3-1 células, uma vez que estas células não são conhecidos superexpressarem P-gp [17]. A capacidade de SRF para ignorar a P-gp provavelmente explica porque é mais potente do que o taxol no neuroblastoma SH-SY5Y e HCT-15, células de adenocarcinoma colorectal como ambos estes tipos de células de cancro expressam níveis de proteína P-gp [17] elevados – [19].

SRF desestabiliza a montagem de microtúbulos através da ligação à colchicina de ligação local

para avaliar o modo de acção principal da SRF, nós perfilado seu efeito sobre a polimerização da tubulina

in vitro

[Figura 1B]. Os resultados mostram que o SRF inibe a polimerização da tubulina de um modo dependente da concentração com um valor de IC

50 de 0,38 jiM. Além disso, o efeito de perturbar microtúbulos de SRF foi comparado com as drogas orientadas dois microtúbulos diferente, taxol, Nocodazole, conhecidos como agentes anti-neoplásticas interferindo a polimerização da tubulina. Notavelmente, SRF afectado o início da polimerização (fase de nucleação) e a sua taxa (fase de alongamento) resultando em massa do polímero tubulina reduzida. Também estudaram o efeito da SRF na montagem de microtúbulos no nível celular utilizando imuno-histoquímica. células HeLa expostas à SRF durante 24 h foram fixadas e coradas com anticorpos microtúbulos a- ou p-tubulina. Em comparação com células de controlo não tratados, que mantêm uma rede de microtúbulos complexa e organizada, o tratamento SRF causou uma destruição completa da rede do citoesqueleto ea aparência de pacotes curtos abundantes, características que foram distribuídos por todo o citoplasma dessas células [Figura 1C]. perturbações dos microtúbulos semelhante foi observada com a exposição nocodazol enquanto tratamento com taxol produzido mais curto, mas os microtúbulos mais densas consistente com o seu papel como um agente de estabilização de microtúbulos [Figura 1C].

Os compostos que inibem a polimerização de tubulina se ligar, principalmente, ao distinta conhecida locais, ou seja, taxol, vinblastina, locais orcolchicine de tubulina. Um ensaio de proximidade de cintilação de ligação competitiva (SPA) foi usada para probeSRF local de ligação sobre a tubulina. SRF não reduzir a contagem SPA específicos estimulados por conjugar o tubulina marcada com biotina com [

3H] taxol ou com [

3H] vinblastina, mas fortemente competiu para a ligação de [

3H] colchicina à tubulina [Figura 2A e 2B]. Em seguida, estudos de modelagem e de docking molecular foram realizados para averiguar ainda mais o modo de ligação de SRF. Utilizando a estrutura cristalina da tubulina-colchicina: stathmin domínio semelhante a (APO 1SA0), ambos colchicina [Figura 2C] e SRF [Figura 2D] foram acopladas na bolsa de ligação de colquicina à tubulina. Apesar da divergência estrutural, SRF compartilha o mesmo espaço cartesiano como colchicina. Ao contrário de colchicina, SRF carece de interações de ligação de hidrogênio com Cys241 de cadeia β. Em vez disso, o anel de indazole de SRF forma interacção de ligação de hidrogénio com Asn349, Lys352 da cadeia β bem como Val181 e Thr179 da cadeia α enquanto que o grupo 4-metil das formas de anel fenil distais interacções hidrofóbicas com cadeia β Lys 254. Tomados em conjunto, os estudos revelam que embora de encaixe SRF e colchicina se ligam ao local idêntico na tubulina, SRF tem um modo de ligao ligeiramente diferente daquela da colchicina [Figura 2E].

(a) SRF compete com colchicina para a ligação a microtúbulos como foi determinada utilizando o ensaio de proximidade de cintilação de ligação de competição (SPA). Em comparação com o controlo (sem concorrente), SRF diminuição da ligação por 2,5 vezes a colchicina. Os dados são apresentados como médias ± SEM. *

P Art 0,05, **

P Art 0,01 versus controle. (B) SRF e vinblastina têm sítios de ligação distintos na tubulina como SRF não compete com vinblastina. Os resultados apresentados são a média (± DP) de três experiências independentes. Os dados são apresentados como médias ± SEM. *

P Art 0,05 versus controlo. (C-E) de modo a representação dos desenhos animados de colchicina (C) e SRF (D) de ligação à tubulina. O modo de ligação de drogas a tubulina foi examinado por estudos de docking usando molecular OURO programa de encaixe (otimização genética para Ligand Docking, Cambridge cristalográfica Centro de Dados, Reino Unido) [Métodos S1]. Os compostos (colchicina ou SRF) foram acopladas na bolsa de ligação de colquicina à tubulina usando a estrutura de cristal da tubulina-colchicina: stathmin-domínio semelhante [código PDB: 1SA0]. interacções de ligação-H entre o anel de indazole SRF e N349 e K352 de cadeia β (verde), bem como a T179 e V181 de cadeia α (azul) são realçadas. Painel E mostra overlay da SRF e colchicina destacando a diferença nos padrões de essas moléculas de ligação.

prisões SRF ciclo celular em G2 /M-fase

Desde dinâmica dos microtúbulos tem um papel importante na a progressão do ciclo celular, tenda mitótico pode levar a vários resultados quimioterapêuticos incluindo morte mitótica, saída mitótico, apoptose ou aneuploidia [11], [20]. Para estudar o efeito da SRF sobre a progressão do ciclo celular, as células HeLa foram tratadas com diferentes concentrações de SRF durante 24 h e o ciclo celular foi monitorizada por citometria de fluxo. tratamento SRF causou um colapso completo de todas as células no G

uma fase de uma forma dependente da dose e o aumento dramático na L

2 /população M das células tratadas com 10 pM de SRF [Figura 3A e Figura S3]. Efeitos similares foram observados no microtúbulos com nocodazole e taxol. a paragem do ciclo celular foi acompanhado pela falha do fuso mitótico para segregar em células que se dividem rapidamente [Figura 3B]. No entanto, não houve aumento significativo na L foi observada

2 /H de fase em linhas celulares normais (CCL-116, WI-38 e F10) mediante tratamento SRF [Figura S4]. Uma vez que a paragem do ciclo celular, invariavelmente, desencadeia a apoptose, realizou-anexina V-PI dupla coloração em células tratadas com SRF de modo a monitorização da exposição de fosfatidilserina, um sinal de apoptose precoce. Depois de uma breve exposição 7 h, a população de células apoptóticas precoces (anexina V

+ /PI

-) aumentou dramaticamente a partir de 2,4% a 21,7% [Figura 3C], indicando, assim, que SRF induz apoptose rápida nas células em proliferação .

(a) análise de citometria de fluxo do conteúdo em ADN de células tratadas com o SRF (10 uM), nocodazol ou taxol. Mostrados são representativos de histogramas de um parâmetro de células tratadas. Como taxol e nocodazol, a inibição mediada por SRF da dinâmica dos microtúbulos resultou em paragem do ciclo celular em G

2 /H de fase de transição. (B) micrografias de fluorescência de células mitóticas que tinha sido pré-tratados com os compostos indicados. Em comparação com as células tratadas veículo, SRF e outra formação inibida parteiras tradicionais e segregação do fuso mitótico. Os microtúbulos (verde) foram coradas com anticorpo anti-tubulina conjugada com FITC; núcleo (azul) foi corado com DAPI. As imagens foram adquiridas em 60X de ampliação. Barra de escala = 5 uM. (C) SRF-tratamento rápido induz a apoptose em células em proliferação. Depois de uma breve exposição SRF 7 h (10 uM), a progressão foi monitorizada por apoptose por células de dupla coloração com anexina V-FITC (FL-1) /PI (FL-2). Durante este período, o percentual de anexina V

+ /PI

– (indicando apoptose precoce) células aumentou de 2,4% (no controle) para 21,7%. A cinética desta incremento é semelhante à observada com o taxol e nocodazol. Ambos os compostos induziram a apoptose em, aproximadamente, 25,4% (nocodazol) e 33,2% (taxol) de células dentro deste período de tempo. Os experimentos foram realizados em triplicado (n = 3) e o valor dos dados foi em média.

SRF induz a apoptose através da fosforilação mediada por JNK de Bcl-2 e Bad

O Bcl 2 família dos proto-oncogenes é master reguladores da apoptose e como função reostatos moleculares para controlar a sobrevivência celular [21]. Desde que as drogas anti-mitóticas tais como paclitaxel, vincristina, vinblastina, induzir a Bcl-2 hiperfosforilação na região do loop [22] – [26], foi investigado o efeito da SRF em Bcl-2. Os extractos de células HeLa tratadas com o SRF 10 uM durante 24 horas foram analisados ​​por imunotransf erência com anticorpo monoclonal anti-Bcl-2. Os resultados mostram que, em conjunto com uma proteína Bcl-2, células tratadas com SRF têm banda adicional (s) que apresenta uma taxa de migração mais lenta em comparação com a Bcl-2 [Figura 4A, painel superior]. Em contraste com as células HeLa, as células tratadas com o veículo faltava completamente a banda extra. Da mesma forma, o estado de fosforilação de Bcl-2 na linha celular diplóide de fibroblastos de pulmão normais WI-38 permaneceram inalterados, mesmo após tratamento de 24 h SRF [Figura 4A, painel médio]. Para confirmar que a banda (s) são, de facto formas fosforiladas da proteína Bcl-2, manchas foram então sondadas com anticorpos específicos fosfo-Bcl-2. SRF induziu a fosforilação de Bcl-2 em vários resíduos (T56, S70 e S87), todas as quais se encontram dentro de uma região de ansa flexível [Figura 4B]. Em conjunto, estas observações reiteram ainda o facto de SRF células cancerosas alvos seletivos. Além de Bcl-2, um 24 h de exposição ao tratamento SRF também induziu a fosforilação da pró-apoptótica membro da família Bcl-2 – Bad [Figura 4C], enquanto a Bcl-x

L, Bak e Bax permaneceram inalterados [Figura S5].

(a) análise de transferência de Western de células HeLa e WI-38 extractos tratados com SRF 10? M, durante 24 h e sondadas com anticorpo monoclonal anti-Bcl-2. Uma banda mais lenta de migração correspondente à forma fosforilada da proteína Bcl-2 está presente em células HeLa extrai mas ausente do WI-38 lisados, demonstrando que SRF induz fosforilação selectiva de Bcl-2 em células cancerosas. (B) SRF medeia a Bcl-2 hiperfosforilação. Tratado com fármaco lisados ​​HeLa foram resolvidos em 12% SDS-PAGE e imunotransferência foi realizada utilizando fosfo-anticorpos específicos contra T56, S70 e S87 resíduos de Bcl-2; todos estes aminoácidos encontram-se na região de ansa flexível da proteína. análise de curso (C) Tempo de Bad fosforilação induzida pelo tratamento SRF. Os lisados ​​de células HeLa foram analisados ​​por imunotransf erência utilizando o anticorpo monoclonal anti-Bad. SRF (10 uM) tratamento alteração do estado de fosforilação de proteína Bad pro-apoptótica, tal como indicado pelo aparecimento de uma banda fosfo-Bad mais lento que migra a 24 h. A banda estava ausente do controlo (tratado com DMSO), as células, mesmo após 24 h.

As cinases de proteína activada por mitogénio (MAPK), expresso em todos os tipos de células, transdução de sinais a partir da membrana celular para o núcleo em resposta a uma variedade de estímulos e também regulam um vasto espectro de processos biológicos críticos para a homeostase celular [27]. Entre os diferentes percursos mediados por membros da família de MAPK, A quinase regulada por sinal extracelular 1 e 2 (ERK1 /2), c-Jun N-terminal quinase /tensão-activada proteína quinase (JNK /SAPK) e p38 MAPK, são conhecidos