Abstract

A recombinação homóloga (HR) é necessário para o reinício da replicação do DNA recolhido garfos e reparação livre de erros de DNA quebras de cadeia dupla (DSB). No entanto, HR não programadas ou hiperativo pode levar à instabilidade genômica e promover o desenvolvimento do câncer. Os fatores celulares que restringem os processos de RH em células de mamíferos estão apenas começando a ser elucidado. O supressor tumoral p53 tem sido implicado na supressão de HR embora tenha permanecido claro por p53, como o guardião do genoma, prejudicaria um processo de reparação livre de erros. Aqui, demonstramos pela primeira vez que a p53 regula negativamente a formação de focos RAD51 da recombinase em resposta ao estresse replicativo em células de cancro do pulmão H1299 de uma forma que é independente do seu papel como um factor de transcrição. Nós achamos que esta regulação negativa de RH não só é completamente dependente do sítio de ligação de p53 com a proteína de replicação A, mas também serina 15 sítio de fosforilação da ATR /ATM. A análise genética sugere que a ATR, mas não ATM quinase modula a função do p53 em RH. A supressão do HR por p53 pode ser contornado em condições experimentais que causam DSB, directa ou indirectamente, em linha com o papel da p53 como um guardião do genoma. Como resultado, a p53-transactivação inactivo não comprometer a resistência das células H1299 com o agente de ligação cruzada intercadeias mitomicina C. No seu conjunto, os nossos dados suportam um modelo no qual a p53 desempenha um papel anti-recombinogénico no ponto de verificação de replicação de mamífero ATR-dependente, mas faz não prejudicar a capacidade de uma célula para usar HR para a remoção de DSB induzida por agentes citotóxicos

Citation:. Sirbu BM, Lachmayer SJ, Wülfing V, Marten LM, Clarkson KE, Lee LW, et al. (2011) ATR-p53 Restringe homóloga recombinação em resposta ao estresse replicativa, mas não limitar DNA intercadeias Crosslink reparo em células de câncer de pulmão. PLoS ONE 6 (8): e23053. doi: 10.1371 /journal.pone.0023053

editor: Janine Santos, da Universidade de Medicina e Odontologia de New Jersey, Estados Unidos da América

Recebido: 06 de maio de 2011; Aceito: 05 de julho de 2011; Publicação: 12 de agosto de 2011

Direitos de autor: © 2011 Sirbu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo NCI concede R01 CA58985 (SNP) e R01 GM076388 (LZ), o NCI Dana-Farber /Harvard Cancer Center SPORE em Lung Cancer P50 CA090578 (HW, LZ), Departamento de Defesa W81XWH-06-1-0309 (HW ), Federal Participação em lucros programa ganhou pelo Massachusetts general Hospital em C06 CA059267, Proton Therapy Centro de Pesquisa e Tratamento (HW) e Deutsche Krebshilfe (Câncer Aid alemão) 10-1843-da (JDD). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

trocas genéticas mediadas por sequências de DNA homólogas deve ser rigidamente controlado para manter a estabilidade genômica [1]. Uma recombinação (HR) via homóloga ativa é necessária para a reparação e reinício de garfos de replicação de DNA em colapso [2]. As células com defeitos de RH são prejudicados na sua capacidade de remover ligações cruzadas intercadeias de ADN (ICL) como produzido por exemplo, mitomicina C (MMC). DNA quebras de cadeia dupla (DSB) que ocorrem em fase S pós-replicação ou no G2 são reparados pelo RH de uma maneira tipicamente livre de erros, porque sequência de DNA homólogo no chromatid irmã pode servir como um modelo exato para o reparo. Em contraste, as trocas de ADN espontâneas entre sequências homólogas em células mitoticamente crescimento tem de ser limitado e as actividades de RH em garfos de replicação paralisadas pode não ser sempre desejável [1], [3], [4]. Os factores anti-recombinog�icas que restringem RH em células de mamífero só agora começam a ser elucidados.

O supressor de tumor p53 desempenha um papel fundamental na manutenção da estabilidade do genoma e a supressão de transformação celular [1], [5] . Como consequência, a função da p53 de tipo selvagem é perturbado por mutações genéticas ou de outros mecanismos, na maioria, se não todos, os cancros humanos [5]. p53 tem emergido como um regulador multifuncional, o qual está no centro de várias vias envolvidas em apoptose, controlo do ciclo celular, e a reparação do ADN. Muitas funções de p53 são mediados pela activação da transcrição de genes alvo a jusante [6]. Nós e outros estabeleceram um papel independente de transactivação adicional da p53 na supressão de processos de RH através de uma variedade de sistemas celulares e ensaios de [7], [8], [9], [10], [11], [12] , [13]. Por exemplo, várias mutações do gene p53, como L22Q /W23S (p53QS), A138V, ou V143A, a capacidade que prejudicam de p53 transativar genes-alvo, incluindo p21, não comprometem a capacidade da p53 para regular negativamente HR [10], [14]. p53 parece afectar RH através de várias proteínas e DNA interacções directas [8], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22], [23 ]. A interação direta com o single-stranded (ss) de ligação ao DNA Replication Proteína A (RPA) parece inibir HR em um passo inicial, e as interações adicionais com BRCA2 e RAD51 podem servir a mesma finalidade [9], [10], [ ,,,0],24]. Regulação negativa do RH é dependente de domínios do núcleo e tetramerização de p53 intactas [7], [8], [12], enquanto que a extremidade C-terminal aparece dispensável [12], [13]. Os factores a montante que regulam a supressão HR mediada por p53 permanecem largamente desconhecidos [25].

Multiple observações ligação p53 diretamente para a replicação do DNA. p53 co-localiza com os locais de replicação [26], [27], é expresso em paralelo com a síntese de DNA quando as células reentrar no ciclo celular [28], e migra para dentro do núcleo na fase S [29], [30] . A replicação do DNA danificado está bloqueada por p53

in-vitro

[31]. Na sequência da inibição da replicação por alongamento hidroxiureia (HU), transcricionalmente inactivo p53 acumula na fase S [32]. De acordo com estes dados, p53 regula negativamente HR se alongamento replicação é bloqueada [11], [33]. O que permaneceu desconhecido é se a atividade de transativação de tipo selvagem de p53 é necessário para o seu papel supressiva em RH associada à replicação.

P53 é fosforilada direta ou indiretamente pela ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated) e ATR (ATM e Rad3 -relacionados) cinases [34], [35], mas as consequências funcionais destas modificações no que respeita à regulação da FC não foram estabelecidas. ATM responde principalmente a LAP e fosforila uma rede de substratos [36]. ATM afeta tanto HR, bem como propenso a erros e livre de erros não-homóloga-end juntar [37], [38], [39]. O ATR quinase desempenha um papel central na resposta ao stress replicativa, e a fosforilação de substratos de ATR colectivamente inibe a replicação e mantém garfos de replicação, impedindo assim a instabilidade genómica [40], [41]. É importante ressaltar que HR é usada para re-iniciar a replicação, mas também pode causar inadequados eventos de troca de Strand em garfos paralisadas se não for devidamente regulamentado [40], [42]. Em comparação com levedura, as funções anti-recombinog�icas do ponto de verificação de replicação em células de mamíferos são mal compreendidos [40], [42].

Aqui, demonstramos pela primeira vez que a p53 transactivação deficiente em RH regula negativamente em resposta ao stress replicativo. Nós estabelecemos que a supressão HR por p53 ocorre dentro de apenas algumas horas de estresse replicativo e é dependente tanto, o site da RPA ligação e ATR sítio de fosforilação de serina 15, colocando assim p53 no posto de controle de replicação de mamífero. Em contraste com o papel de p53 na resposta ao estresse replicativo, a supressão de reparação mediada por homologia de DSB induzido direta ou indiretamente parece relaxado, de acordo com o papel da p53 como um guardião do genoma.

Resultados

regulação diferencial de HR pela deficiência de transativação p53

foi previamente mostrado que p53 suprime HR após a indução de estresse replicativo [11], [33]. No entanto, não se sabia se a actividade de transactivação da p53 é necessária para esta função. Para resolver esta questão, utilizamos as células sem p53 estavelmente transfectadas com um mutante p53 previamente caracterizado deficiência transativação, p53QS [10]. Nós induzida a formação de focos RAD51 subnuclear por tratamento de células com inibidores da replicação de alongamento, timidina e HU (Figura 1A, e dados não mostrados). Em resposta a ambas as drogas, houve uma supressão significativa da formação de focos RAD51 em células p53QS-expressam, em comparação com os controlos sem p53 (Figura 1BC, Figura S1A). Como um controlo, a magnitude deste efeito foi semelhante à capacidade de suprimir RH endógena p53 de tipo selvagem, embora esta experiência foi realizada numa linha celular diferente, A549 (Figura S1B). Em contraste, a Figura 1D mostra que p53QS não modular a indução focos RAD51 em células expostas à radiação (IR), que produz ORL durante todo o ciclo celular ionizante, com irmã cromatídeos ORL ocorrendo pós-replicação e no G2 reparado por HR.

(a) imagens representativas da formação de focos RAD51 subnuclear em H1299 células que expressam de forma estável p53QS ou células sem p53 tratadas com timidina 5 mM (TdR) durante 24 horas. (B) Impacto do estado de p53 (null contra QS) na formação de focos RAD51 em células H1299 tratadas com TdR 5 mM durante 24 horas. Barras representam a média com desvio-padrão com base em 3 repetições independentes. (C) Efeito de estado de p53 sobre a formação de focos RAD51 em células H1299 tratadas com hidroxiureia 1 mM (HU) durante 24 horas. Barras representam a média com desvio-padrão com base em 5 repetições independentes. (D) Impacto do estado de p53 sobre a formação de focos RAD51 em células H1299 6 ou 16 horas (h) após o tratamento com 2 Gy de radiação ionizante (IR). Barras representam a média com o erro padrão com base em 2-5 repetições independentes. Todos os eixos y indicam percentagem de células tratadas com, pelo menos, 10 focos RAD51 por núcleo depois de subtrair a percentagem de células não tratadas com níveis de focos RAD51 fundo. P-valores são baseados no teste t de Student (de duas caudas).

Para modelar o reparo DSB em substratos que assemelham-se cromátides irmãs alinhados, modificamos um ensaio de recombinação usado anteriormente que torna as células resistentes ao ácido micofenólico em cima de RH bem sucedida. O

gpt

gene bacteriano no pDT219 substrato recombinação foi inactivada por inserção de um local de reconhecimento de I-Scel no sítio Kpnl (Figura 2A). Adaptar um modelo murino caracterizada anteriormente para estudar as propriedades independente de transativação de p53 [13], que expressa-transativação prejudicada p53-A135V em fibroblastos de rato embrionárias (MEFs) que transporta o substrato pDT219 que abriga um sítio de reconhecimento para os raros de corte de site- dirigida da meganuclease I-Scel (dados não mostrados). Anteriormente mostrou que este mutante p53 é capaz de suprimir acontecimentos RH espontâneas, analogamente ao p53QS em células humanas [10], [13]. O primeiro avaliou o efeito deste mutante para suprimir RH ORL-induzida utilizando a sequência homóloga pΔ2 doador, que é co-transfectado um vector de expressão da meganuclease I-Scel. Neste sistema, reparação mediada por homologia é mediada pela trechos de homologia ininterrupta de 202 pb e 2333 pb a montante e a jusante do local I-Scel, respectivamente. Nós não detectar uma diferença estatisticamente significativa na frequência de RH induzidas DSB entre as células com e sem p53-A135V (Figura 2B). Não houve diferença na eficiência de transfecção entre os diferentes clones (dados não mostrados). Em seguida, nós modificamos o plasmídeo dador para reduzir o comprimento de homologia de sequência compartilhada com apenas 188-250 pb (pKEB1). Com esta modificação, o efeito supressivo de p53 foi estatisticamente significativamente aumentada a 10 vezes (p 0,01). Da mesma forma, em um substrato utilizada baseada em GFP recombinação, PDR-GFP, em que RH é mediada por, aproximadamente, 400 pb de partilhada homologia de sequência ininterrupta que flanqueia o local I-Scel, humano auditivos-transactivação ou p53 murina suprimida HR-induzida ORL pela várias vezes (Figura S2).

(a) o plasmídeo pDT219 substrato possui uma cópia do gene gpt bacteriana inactivada por inserção de um local de reconhecimento de I-Scel no local Kpnl única de pSV2-gpt. eventos de RH foi induzida em fibroblastos de embrião de ratinho 10,1 transportando pDT219 por co-transfecção de um vector de expressão de I-Scel e um doador homóloga. pΔ2 é caracterizado por 202 pb e 2333 pb de homologia de sequência ininterrupta compartilhado com pDT217, enquanto pKEB1 contém apenas 188 pb e 250 pb de homologia flanqueando o local da fractura. Após a co-transfecção de pKEB1 pΔ2 ou em conjunto com um vector de expressão de I-Scel, os recombinantes foram marcados num ensaio de formação de colónias. (B) I-Scel-induzida frequências RH obtidos com pDT219 cromossomicamente integrados são representados graficamente contra o estado de p53, (-) indicando p53 nulo, (+) indica a transactivação de p53 deficiente-A135V mutante que é funcionalmente análogo ao p53QS. As barras representam a média geométrica com SEM de 3-6 experiências independentes. A supressão relativa de RH na presença de p53-A135V em comparação com as células sem p53 é indicado para cada um dos dois plasmídeos dadores. A supressão relativa de RH foi comparada usando o teste t não pareado (bicaudal).

Em conjunto, estes dados sugerem que o p53 com deficiência transativação regula negativamente HR em resposta ao estresse replicativo mas não afeta homologia reparação mediada de LAP se o comprimento de homologia partilhada excede 250-400 bp como seria típico para o intercâmbio entre cromátides irmãs. A supressão observada de HR-induzida DSB na presença de homologias curtas pode não estar relacionado com o papel de p53 na regulação HRR associada à replicação e não foi aprofundada.

supressão de RH exige o site serina 15 de p53

Em resposta à replicação estagnação garfo, p53 é fosforilada na serina 15 (Figura S3A, B) [34], [43]. No entanto, as consequências funcionais desta modificação eram desconhecidos. Foi criado um mutante de fosfo-p53QS através da introdução de uma mutação de serina 15 para alanina (S15A-p53QS) (Figura 3A). Nós também gerado um mutante de ligação de APR de p53 (p53QM) por mutação, adicionalmente, os aminoácidos 53 e 54, que foram mostrados anteriormente ser importante para a supressão de AR [10]. Quando expresso de forma estável em células sem p53 (Figura S4), todos estes mutantes foram associados com perfis semelhantes do ciclo celular em resposta ao tratamento timidina (Figura 3B). Como previsto, p53QM foi capaz de suprimir a formação de focos RAD51 nas células tratadas com timidina, e isto foi observado em vários subclones (Figura 3C, e dados não mostrados). Surpreendentemente, bloqueando serina 15 de fosforilação também anulou completamente a capacidade de regular negativamente a p53QS focos RAD51.

(A) Ilustração de mutações do gene p53 de terminal-N introduzidas por mutagénese dirigida ao local. As construções mutantes foram expressos estável a partir de um local comum de integração cromossómica em células H1299 (ver Materiais e Métodos). distribuições (B) do ciclo celular H1299 para clones expressando estavelmente um mutante p53 de terminal-N. TdR, 5 mM de timidina durante 24 horas. (C) Efeito de estado de p53 em timidina induzida a formação de focos RAD51, de forma análoga às experiências mostradas na Figura 1. p-valor, resultado do teste t (bilateral) comparando p53QS para células sem p53.

para avaliar como no início da resposta ao estresse replicativo é necessário o local S15 de p53, estudámos a cinética de formação de focos. A Figura 4 mostra que a formação de focos RAD51 já foi prejudicada no prazo de 6 horas de tratamento de timidina em p53 e p53QS S15A-células que expressam. Consistente com esta observação, S15 fosforilação em células que expressam p53QS foi observada dentro de 6 horas de tratamento (Figura S3C). Além disso, p53QS suprimiu a acumulação local de RPA em 6 horas, consistente com os dados anteriores sobre a capacidade da p53 para inibir RPA ligação ao DNA de cadeia simples, que é um passo necessário para a iniciação de HR (Figura S5).

O tempo de focos RAD51 induzida em timidina tratada H1299 clones foi medida de modo análogo aos experimentos mostrados na Figura 1.

Dependência de supressão HR mediada por p53 em ATR

O S15 local de p53 é modificado por quinases ATM e ATR [34], [44], [45], e ambas as quinases foram mostrados para promover a AR, em células com função de p53 de tipo selvagem prejudicada ou perdida [39], [46], [47]. Como esperado, após tratamento com cafeína, que inibe a ATR, bem como ATM, a capacidade das células para formar focos RAD51 em resposta a timidina foi muito diminuída (Figura 5A). Surpreendentemente, a capacidade de reduzir a formação de p53QS para RAD51 comparação com as células sem p53 ou p53QS-S15A foi revogada. Para distinguir entre a função da ATM contra ATR, que trataram células com o KU55933 inibidor da ATM. Neste cenário, o efeito HR supressiva da p53QS foi preservada, indicando uma dependência da ATR, em vez de ATM. Para confirmar esta conclusão, nós tratamos as células com siRNA contra ATR como nenhum inibidor ATR específica está disponível. depleção de proteína suficiente ATR foi atingida após a transfecção dupla de siRNA, e as células mantidas crescimento normal durante a duração de 48 horas da experiência (Figura 5B, e dados não mostrados). Tal como observado anteriormente, houve uma redução independente de p53 de RH em ATR siRNA células tratadas, a percentagem de células sem p53 positivas RAD51 focos foi reduzida em 16% em comparação com células transfectadas com ARNsi de controlo, ou seja, de 40% a 24% (Figura 4C). Em comparação com células de controlo transfectadas de siRNA, a supressão mediada por p53 relativa de RH em células transfectadas ATR ARNip foi menos pronunciado, embora não completamente revogada o que é consistente com a função p53QS residual. No seu conjunto, estes dados sugerem que a ATR regula RH através p53-dependentes e independentes de mecanismos.

(A) H1299 clones foram tratadas com timidina (5 mM durante 24 horas) com ou sem cafeína concorrente (5 uM) ou KU55933 (20 uM) de tratamento. (B) Western blot que ilustra o esgotamento siRNA mediada de ATR na H1299 células. sc, mexidos controle de siRNA. (C) Efeito do estado p53QS e exaustão ATR na indução RAD51 focos, medida de modo análogo à Figura 1.

p53 não compromete a resposta RAD51 a DSB após timidina ou MMC

HR é utilizado para o reparo forquilha de replicação e reiniciar [2], um processo que não deve ser contestado por p53, uma vez que é necessário para a manutenção da estabilidade genômica e sobrevivência celular. Após a libertação a partir de uma incubação de 24 horas com timidina (como mostrado na Figura 4), observou-se um aumento na γ-H2AX focos, consistente com a ocorrência de DSB em garfos de replicação colapsadas (Figura 6A). Houve um aumento relativo semelhante em focos RAD51 que era independente do estado de p53 e consistente com mediada por AR forquilha reinicialização (Figura 6B). Assim, neste cenário, p53QS não exerceu um efeito supressor sobre a formação de focos RAD51.

(A) Coloração para γ-H2AX como um marcador de formação de DSB, ilustrando aumento DSB em ambos os clones H1299 dentro de 4 horas após a libertação de timidina (5 mM durante 24 horas). (B) Tempo de indução curso RAD51 focos, de forma análoga à Figura 4, a seguir à remoção de timidina. Para ilustrar o aumento semelhante na indução de focos RAD51 independentemente do estado de p53, a percentagem de células com focos foram normalizados para 0 no tempo 0 horas (h), isto é, no momento da remoção da timidina. (C) Efeito de estado de p53 em focos RAD51 induzida 4 horas após o tratamento com mitomicina C (MMC) (0,5 ug /ml durante 1 hora). Eixo Y indica percentagem de células com, pelo menos, 10 focos RAD51 induzida por núcleo. Resultados semelhantes foram observados após 24 horas (dados não mostrados). (D) Impacto do status de p53 na formação de focos γ-H2AX 24 horas após o tratamento com MMC. Eixo Y indica percentagem de células com, pelo menos, 20 focos induzidos por núcleo. (E) a sobrevivência clonogênica de clones H1299 com diferentes status de p53. Todos os pontos de dados são baseados em 2-3 experiências repetidas independentes.

Nós células também expostas ao MMC agente de reticulação, o que leva à geração de DSB de garfos de replicação em colapso. Consistente com os dados da Figura 6B, p53QS não suprimem a formação de focos RAD51 em resposta a MMC (Figura 6C). Mais importante, não houve diferença na residual focos γ-H2AX em p53 nulo e p53QS células expressando 24 horas após a exposição a MMC, sugerindo que o p53 não compromete a reparação de DSB (Figura 6D). Finalmente, a expressão de p53QS não prejudicar a sobrevivência das células tratadas com MMC consistentes com os RAD51 e γ-H2AX níveis focos semelhantes -expressing células (Figura 6E). Pelo contrário, houve um ligeiro mas robusto aumento na resistência ao MMC após a expressão de qualquer das formas de p53 mutantes. Curiosamente, um resultado semelhante foi observado quando expressando o mutante p53-A135V em fibroblastos de rato embrionário (Figura S6). Os mecanismos pelos quais p53 transativação-inativa pode promover a sobrevivência MMC continuam a ser determinado (ver discussão).

Discussão

Enquanto o papel do p53 como um fator de transcrição que controla a apoptose celular e progressão do ciclo está firmemente estabelecida, uma miríade de estudos sobre o passado 15 anos tem atribuído um grande número de funções bioquímicas e celulares adicionais à p53 [1], [6]. Um papel independente de transativação de p53 na regulação baixa de HR foi reprodutível descrito por vários laboratórios, incluindo o nosso próprio [7], [8], [10], [14], [48]. Dado que o controlo cuidadoso das actividades de RH é importante para a resposta de garfos de replicação estagnadas ou colapsadas, elucidar a função de p53 em RH é crítica para uma melhor compreensão da iniciação e progressão do tumor.

Mostramos aqui pela primeira vez que a p53 regula negativamente FC em resposta ao estresse replicativo de uma forma que é independente do seu papel como um factor de transcrição (Figuras 1, 2, 3). Nossos dados são consistentes com a ideia de que o papel do p53 em RH é dependente de interacções com RPA e ATR-quinase, implicando, assim, p53 no posto de controle de replicação ATR (Figura 3, 5). No geral, as funções anti-recombinogênicas do posto de controle de replicação continuam a ser plenamente estabelecida [40], [49]. Em levedura de fissão, o homólogo de Chk1 inibe a função Mus81 e Rad60, evitando assim a recombinação indesejada [50], [51]. Em eucariotas superiores, a ATR fosforila BLM, um factor conhecido anti-recombinogénico [52], [53]. Por outro lado, a ATR foi mostrado para promover RH [46], [47]. Consistente com estes dados, os nossos resultados implicam que tanto ATR e ATM promover a formação de focos RAD51 em resposta ao stress replicativa de um modo independente de p53 (Figura 5). Assim, pode existir uma regulação positiva e negativa (via p53) de HR pela ATR.

No que diz respeito a possíveis limitações do nosso trabalho, uma limitação inerente de estudos de focos é que eles não podem medir directamente as actividades de proteína em replicação garfos (Figura 1, 3, 4). No entanto, os terminais focos são amplamente utilizados na literatura para determinar os mecanismos moleculares e determinantes genéticos de RH [15], [46], [54]. Em segundo lugar, uma limitação similar aplica-se ao nosso sistema de plasmídeo (Figura 2), o que pode não constituir uma medida exacta de eventos fisiológicos RH que estão sob o controlo de p53. Em terceiro lugar, enquanto todos os nossos e outros dados sugerem que os p53QS humanos mutante e rato p53-A135V (ou homólogo humano) são funcionalmente equivalentes em termos de supressão de RH de uma forma independente de transativação (por exemplo, a figura S2) [7], [10], [12], [13], não podemos excluir a possibilidade de que podem existir diferenças desconhecidas. Por último, nós também alertam que os resultados obtidos com uma linha de células, tais como células de câncer de pulmão H1299 neste estudo, não podem ser facilmente generalizado para outras linhas celulares.

Quais são os mecanismos moleculares pelos quais S15 fosforilação de p53 poderia suprimir RH? Em um modelo publicado anteriormente, o sequestro da RPA de ssDNA vai inibir o carregamento subsequente de RAD51, e, portanto, é um meio pelo qual p53 suprime HR [10]. O terminal N de p53 compete com ADNcs para o domínio de OB vezes de N-terminal do RPA1 [55]. Assim, especula-se que os mecanismos pelos quais podem existir N-terminal de fosforilação de p53 promove a ligação a RPA1, afectando assim a afinidade de ligação de ADNcs dos domínios de ligação de ADN de RPA. Por exemplo, alterada ssDNA-RPA ligação poderia levar a liberação programada de RPA de ssDNA prejudicando com carga RAD51 adequada, ou p53 pode prender RPA em ssDNA e atrasar o carregamento RAD51. Existem fortes interdependências entre os locais de fosforilação da p53 de terminal-N [56], [57]. Em células H1299, S15 mutação conduz a fosforilação reduzida S37 após irradiação [57]. Curiosamente, Lowry et al. Recentemente, encontrou evidências de uma região em colapso no domínio p53 intrinsecamente não estruturadas com uma estrutura de loop centrado em torno resíduos 34-36 [58]. Estes autores sugeriram que a fosforilação S37 pode levar a uma conformação aberta deste domínio e, assim, promover a ligação a RPA1. Assim, a mutação de S15 prejudicaria RH indirectamente através de um efeito inibitório sobre a fosforilação S37 adjacente.

A noção de que a p53 pode suprimir a reparação de DSB veio a partir de uma série de estudos olhando para o efeito de p53 no local dirigida ORL em substratos plasmídeo integrado no cromossoma [7], [12], [59]. Descobrimos que a magnitude do efeito supressor p53 está correlacionada com o comprimento da sequência de homologia presente (Figura 2, S2). Postulamos que o sistema pDT219 /pΔ2 (Figura 2) é representativo da irmã reparação chromatid por causa da extensão da homologia da sequência disponível é na faixa quilobases. Embora reconheçamos que a comparação entre os diferentes sistemas de recombinação tem ressalvas, uma dependência do efeito supressor de p53 em comprimento homologia está em excelente acordo com um estudo prévio por Wiesmüller et al. [12]. Estes autores, que utilizaram um painel de substratos à base de EGFP cromossómicas, demonstraram que a infra-regulação de eventos de conversão de genes por p53 foi particularmente pronunciado quando o comprimento de homologia partilhada foi reduzida para 168-233 pb. É possível que a p53 cria um limiar entre homologias curtas e longas, que podem ajudar na prevenção da reparação propensa a erros e rearranjos prejudiciais pelo desalinhamento de ADN repetitivo. Esse modelo seria consistente com a observação de que o estado de p53 celular não tem efeito direto sobre segmentação de genes e trocas cromátides irmãs, que normalmente são mediados por longos homologias da ordem de kilobases [60]. Este modelo também prevê que o p53 não vai afectar negativamente a reparação de DSB de cromatídeos causados ​​por radiação ou outros agentes ionizantes, o que está de acordo com os dados de sobrevivência de células [61]. Nossos dados também sugerem que a proficiência HR medidos com um sistema plasmídeo baseado em I-SCEI, como PDR-GFP (Figura S2) nem sempre é um bom marcador substituto para o reparo dependente de HR de danos no DNA exógeno. Além disso, dados recentes sugerem que o reparo de RH da cromossômica I-SCEI induzida DSB é dependente do ciclo celular e sujeito a regulação transcricional pelo p53 (Rieckmann et al., Não publicado de 2011). Assim, é possível que as actividades de RH em resposta ao stress ou replicação Frank ORL são diferencialmente regulados pelo do tipo selvagem e variantes de p53 mutantes. Também não se pode descartar que os efeitos regulamentares podem variar entre linhagens celulares.

Por fim, p53 não comprometer a resposta RAD51 focos e sobrevivência das células após a exposição à MMC agente de reticulação (Figura 6). Ao contrário, houve até um ligeiro aumento na sobrevivência das células após a expressão de mutantes de p53 transactivação deficiente (Figura 6E, S6). O mecanismo subjacente continua a ser determinado, mas pode estar relacionada com uma possível estabilização dos complexos de multi-proteínas ao garfo de replicação pelo p53 (LMM, HW, dados não publicados). O aumento observado na resistência da MMC é consistente com outros relatórios mostrando que, na ausência de apoptose, a presença de p53 está associada com resistência a cisplatina [62], [63], [64]. Em contraste, em sistemas celulares ou ensaios sensíveis à apoptose, a resistência a agentes que danificam o ADN é tipicamente causada pela perda de p53 de tipo selvagem [65], [66]. Em geral, a função de p53 para determinar a sobrevivência da célula em resposta ao dano de ADN é claramente complexo e um reflexo de múltiplas funções da p53 na apoptose, o controlo do ciclo celular, e recombinação de DNA. O estudo dessas questões em sistemas de células definidas é um caminho promissor de investigação com potencial relevância clínica para o tratamento de tumores malignos a maioria dos quais perderam a função da p53. Além disso, o significado biológico da função do p53 na regulação da FC, especialmente no que diz respeito ao seu papel na supressão do tumor, continua a ser estabelecida.

Materiais e Métodos

As linhas celulares

células de cancro do pulmão NCI-H1299 (sem p53) foram obtidas da ATCC e a sua utilização tem sido publicado anteriormente [10]. células de cancro do pulmão A549 também foram obtidas da ATCC. Fibroblastos de rato embrionárias (BALB /c 3T3 10,1 clone, sem p53) foram uma oferta do Dr. Arnold Levine e seu uso foi publicado [14], [61]. Os clones H1299 /FRT que transportam diferentes mutantes de p53 foram gerados de acordo com as instruções do fabricante (Flp-In, Invitrogen). Resumidamente, as células foram H1299 com pFRT /LacZ seguido de zeocina (100? G /ml, Invitrogen) selecção para estabelecer integrantes cromossómicos transfectadas com electro. -Integrantes de cópia única com a actividade de transcrição baseado em baixo o repórter β-galactosidase co-integrados foram seleccionados para a transfecção com construções de várias pcDNA5 /FRT-p53, concorrentemente com pOG44 para integração dirigida ao local DRF aceitador. A seguir à selecção com 400 ug /ml de Higromicina (Invitrogen), as colónias foram expandidas e os lisados ​​de células inteiras obtidos para avaliar a expressão da proteína. Para algumas experiências, as células H1299 carregando um p53QS integradas aleatoriamente construção (pRc /CMV L22Q /W23S, gentilmente cedido pelo Anindya Dutta) foram utilizados. MEFs foram transfectadas com um vector de expressão de p53-A135V e seleccionado com 500 ug /ml de G418 (Fisher Scientific), como descrito anteriormente [13]. Todas as linhas celulares testados livre de micoplasma.

RNA de interferência

ATR foi alvo de um oligonucleotídeo siRNA anteriormente utilizado e validado, 5′- CCUCCGUGAUGUUGCUUGAtt -3 ‘(Applied Biosystems) [67]. Exponencialmente o crescimento de células H1299 foram plaqueadas 16 horas antes da transfecção. ATR siRNA ou um controlo scrambled foi diluída em 100 uL de Opti-MEM (Roche) para se obter uma concentração final de 100 nM, e misturou-se com 10 mL de reagente de transfecção X-tremeGENE (Roche) em 100 uL de Opti-MEM. A formação do complexo foi deixada prosseguir durante 20 minutos à temperatura ambiente antes da adição gota a gota às células. complexos de siRNA foram incubados com as células durante 4 horas, altura em que as células de tempo foram mudadas para meio de crescimento normal. A transfecção foi realizada duas vezes, 24 horas de intervalo, para atingir knockdown óptima. Os lisados ​​celulares totais foram obtidas às 24 e 48 horas. Os lisados ​​foram desnaturadas e reduzidas, e, em seguida, executar sobre gel de 3-8% de Tris-Acetato (Invitrogen) durante 2,5 horas a 150 V. As amostras foram transferidas para uma membrana de PVDF com um aparelho meio-seco (BioRad) durante 1 hora a 12