Abstract
pacientes Serosa epiteliais de cancro do ovário (EOC), muitas vezes sucumbir à doença metastática agressiva, mas pouco se sabe sobre o comportamento e genética de metástase de câncer de ovário. Aqui, pretendemos compreender como metástases omental diferem dos tumores primários e como essas diferenças podem influenciar quimioterapia. Foram analisados os perfis de expressão de miRNA de tumores EOC primários e suas respectivas metástases do omento a partir de 9 pacientes que utilizam matrizes miRNA Taqman qPCR. Encontramos 17 miRNAs com expressão diferencial nas lesões do omento em comparação com tumores primários. miR-21, o miR-150 e miR-146a têm baixa expressão na maioria dos tumores primários com aumento significativo da expressão em lesões do omento, com concomitante diminuição da expressão de ARNm de alvos previsto com base na expressão do mRNA. Nós achamos que miR-150 e miR-146a mediato esferóide tamanho. Ambos miR-146a e miR-150 aumenta o número de células sobreviventes residuais por 2-4 vezes quando desafiados com concentrações de cisplatina letais. Estas observações sugerem que, pelo menos, dois dos miARNs, miR-146a e miR-150, sobre-regulada em lesões do omento, estimular a sobrevivência e aumentar a tolerância à droga. As nossas observações sugerem que as células cancerosas em tumores omental expressar miARNs chave de forma diferente do que os tumores primários, e que, pelo menos, alguns desses reguladores microARNs podem ser críticos do surgimento da doença resistente a medicamentos
citação:. Vang S, Wu HT , Fischer A, Miller DH, MacLaughlan S, Douglass E, et al. (2013) Identificação do cancro do ovário metastático miRNAs. PLoS ONE 8 (3): e58226. doi: 10.1371 /journal.pone.0058226
editor: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Estados Unidos da América
Recebido: 21 Setembro, 2012; Aceito: 31 de janeiro de 2013; Publicação: 12 de março de 2013
Direitos de autor: © 2013 Vang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Brown University centro de Biologia Molecular Computacional, prêmio SEED do centro Nacional Brown University of Excellence em Saúde da Mulher e National Institutes of Health center /Nacional de Pesquisa de Recursos conceder 5P41RR001395. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Serous epitelial do ovário (EOC) é uma doença agressiva para os quais existem poucos biomarcadores e terapias eficazes. EOC é muitas vezes diagnosticada depois que as células tumorais têm disseminado dentro da cavidade peritoneal [1]. Apesar do fato de que as metástases são responsáveis pela maioria das mortes relacionadas com a doença, a metástase do câncer de ovário permanece pouco compreendida [1].
O objetivo deste estudo foi identificar características que podem ser importantes para estabelecer metástases e determinar como esses fatores podem afetar as respostas de quimioterapia. doença metastática avançada continua a ser um desafio assustador para tratar, na maioria das vezes levando a recorrente, os tumores resistentes aos medicamentos. As metástases podem ser enriquecidos por um espectro mutacional distinta em comparação com tumores primários [2], [3], [4]. Comparando-se os tumores primários e metastáticos gerou informações importantes sobre a progressão da doença em ambos os modelos animais [5] e em pacientes [2]. Para melhorar o tratamento de doença metastática, é vital para compreender os genes e vias emergentes nas metástases que podem não estar presentes em tumores primários. Embora potencial metastático pode ser previsto com base no tumor primário [6], [7], essa observação não é mutuamente exclusiva com a possibilidade de que os principais recursos emergir em metástases que não são observados em tumores primários. Por exemplo, o novo microambiente podem induzir mudanças significativas fenotípicos para células cancerosas, incluindo alterações à atividade metabólica no omento [8], e aumento da resistência aos medicamentos [9].
Anteriores estudos de expressão de mRNA que examina combinado ovariana primária e tumores metastáticos do mesmo paciente, apoiar um modelo ‘predisposição do tumor primário “[6], [10], [11], [12]. dados de expressão de mRNA utilizando microarrays de início de geração sugerem que há poucas diferenças expressão significativa entre lesões do omento e tumores primários [13], [14], [15], expressão diferencial no entanto, vários estudos têm descrito de fatores reguladores fundamentais entre tumores primários e metástases, incluindo e-caderina [16], MMPs [17], [18] e integrinas [19]. Para resolver esta aparente discrepância e ganhar novos insights sobre o estado das células cancerosas em metástases, nós perfilado expressão miRNA em pares correspondentes de primária epitelial de ovário seroso (EOC) tumores e lesões do omento. miARN perfil de expressão identifica o miR-150 e miR-146a ser regulados positivamente em metástases omental. Descobrimos que o miR-150 e miR-146a promover a formação de esferóides e aumentar a fracção de células sobreviventes residuais após a exposição a cisplatina. Estas observações sugerem que maior expressão de miR-146a e miR-150 em lesões do omento pode levar a mais agressiva, a doença resistente à quimioterapia.
Resultados
Foram identificados 9 Estágio IIIC pacientes câncer epitelial de ovário seroso com pares de amostras de tumor metastático e omental (Figura S1, S1 Tabela). Todos os pacientes eram pós-menopausa ( 55 anos de idade no momento do diagnóstico) e tinha doença metastática no omento. Medimos expressão miRNA usando Taqman qPCR cartões de matriz nos 9 pares de tumores. Cada tumor tinha 70% células cancerosas, e boa qualidade de ARN (Agilent Bioanalyzer RIN 5). Nosso foco é entender as mudanças que se manifestam durante a progressão da doença e, portanto, temos focado na comparação das metástases dos tumores primários e não considerou células epiteliais ovarianos normais.
Identificação de miRNAs diferencialmente expressos entre tumores primários e metastáticos
Nós medimos 377 miRNAs usando matrizes ABI Taqman qPCR, específico para miRNAs maduros [20], em 9 tumores humanos primários e metastáticos combinados. 180 miARNs são expressas, pelo menos em dois tumores, sem para cima ou para baixo mundial-regulação destes miARNs entre os tumores primários e metastáticos. Figura 1A resume os miRNAs com grandes diferenças de expressão recorrentes identificados por um teste t pareado (Figura S2). Testamos a expressão de miR-146a e miR-150 em ensaios de segmentação apenas estes miARNs em dois pares de pacientes para confirmar que os ensaios Taqman são específicos para esses miARNs sem conversa cruzada de outros 376 ensaios (Figura S3).
A. miRNA expressão profiling por matrizes Taqman qPCR identifica 17 miRNAs diferencialmente expressos entre 9 pares de tumores primários e lesões do omento. Foram selecionados 0,05 (teste t pareado); miRNAs com p . E manchado células cancerosas, e realizou matrizes Taqman qPCR de dois casos. 11 dos 17 miARNs, identificado na triagem do tumor a granel (Figura 1A), são expressos em células de cancro de LCM enriquecido, e a expressão diferencial entre os tumores primários e lesões omental é qualitativamente o mesmo (Figura 2B, Figura S6). Estas observações sugerem que a mudança observada na expressão provável origina nas células cancerosas para estes 11 miARNs (Figura 2B). miARNs não expressa em células cancerosas, mas com grandes alterações de expressão no tumor a granel, tais como o miR-124 e miR-370, pode indicar a presença de tipos específicos de células do estroma, tais como fibroblastos ou células imunes. Nós inicialmente intrigados com miR-509-3-5p, miR-508-3p e miR-508-5p como estes eram os únicos miRNAs regulados negativamente em metástases nas medições do tumor em massa. No entanto, estas três miARNs não são expressos nas LCM enriquecido populações de células de cancro (Figura 2B), e não é significativamente expressa em linhas celulares de cancro do ovário testadas (Figura S7), e, assim, não foram considerados adicionalmente.
embora as células cancerosas LCM seleccionado não são 100% células cancerosas, estas observações sugerem fortemente que o miR-146a e miR-150 são provavelmente expresso em células cancerosas e que a sua expressão é sobre-regulada em metástases omental. É importante ressaltar que encontramos expressão destes miRNAs em H E manchado, LCM enriquecido células cancerosas em ambos os tumores primários e metastáticos, em consonância com a sua expressão provável em células cancerosas. TCGA descobriu que o miR-150 e miR-146a são expressos em baixos níveis na maioria dos tumores primários [21], de acordo com as nossas observações.
miR-150 e miR-146a promover a formação de esferóides
matrizes qPCR Taqman revelou que 8 dos 17 miARNs metastáticos (figura 1A) são expressos em células em proliferação OVCAR-8 e SKOV-3 (Figura S7) e em células cancerosas em tumores humanos (Figura 2B). miR-146a é expresso em níveis relativamente baixos e miR-150 não é expresso de forma significativa uma vez que só foi detectado acima do recomendado C
t limiares nas proliferação linhas celulares de cancro do ovário testadas.
Nossa hipótese é que miRNAs -regulada nas lesões do omento seria estimular o crescimento como parte de sua capacidade de promover a doença agressiva. Testamos miRNAs expressos em células cancerosas em tumores (Figura 2B), que também são expressas modestamente em linhas celulares de cancro do ovário para evitar o excesso de expressar miRNAs em concentrações supra-fisiológica, incluindo miR-150, miR-146a, miR-708 e miR -193a-5p. Para modelar a maior expressão miRNA observada em lesões do omento, nós ectopicamente expressa sintética pré-miRs e realizou ganho de telas de função da viabilidade celular e ensaios de sensibilidade cisplatina. A transfecção de pré-miRs levar a uma alta superexpressão de miR-146a (Figura S8, enquanto que o miR-150 é modestamente expressa em comparação com snRNA U6 (ôc
t ~ 3). A expressão ectópica de miR-150 aumentou ligeiramente o número de viável em células SKOV-3 e IGROV-1 ao longo de quatro dias, mas não em células OVCAR-8 (Figura 3). Nenhum dos outros pré-miRs induziu efeitos significativos e reprodutíveis para o crescimento de mais do que uma linha de células.
24 horas após a transfecção com 50 nM de pré-miRs, as células foram plaqueadas em placas de 96 poços e cultivadas durante 4 dias. As células viáveis foram determinados por WST-1 normalizado para células transfectadas com controlo negativo pré-miRs As barras de erro. (SEM) representam triplicados biológicos indendent Cada replicar consistes de que consiste em três poços de uma placa de 96 poços **, p .. 0,01, *, p 0,05 pelo teste t de Student
Spheroids modelo agregados multicelulares. nas ascites de doentes com cancro do ovário, que estabelecem as metástases [22]. os esferóides são uma representação mais precisa de tumores e aumentando a evidência sugere que as respostas de drogas são mais bem modelado em esferóides que em cultura em monocamada [23], [24], [25], [26]. formação esferóide tipicamente requer um número mínimo de células, seguido de agregação espontânea, a sobrevivência sob condições independente de ancoragem, e compactação para reforçar a sobrevivência do agregado [27]. Para avaliar a função miRNA em esferóides, formamos esferóides uniformes semeando células em micromolds agarose [28]. Curiosamente, todos os miARNs expressos são regulados positivamente em esferóides 3D em comparação com monocamada utilizando uma matriz de cartão de Taqman (Figura S4). Testamos miR-146a e miR-21 de expressão por Taqman qPCR, utilizando iniciadores de segmentação apenas estes dois miARNs, e de forma reprodutível observar-se-a regulação destes dois miARNs em esferóides (Figura 4A). Para testar se a sobre-regulação de miR-146a é importante para a formação de esferóides, que inibiu o miR-146a com um inibidor de Locked Nucleic Acid (LNA). inibição de miR-146a faz com que amorfas esferóides, mais livremente formadas em ambas as células SKOV-3 e OVCAR-8, após dois dias (Figura 4B), em comparação com os esferóides mais compactos formados nos controlos negativos. O efeito é mais dramático no SKOV-3 de OVCAR-8. Devido à natureza amorfa destes primeiros formando dia 2 esferóides, não foi possível determinar com fiabilidade as suas dimensões. Esta observação sugere que a formação esferóide precoce é impactado por uma redução da actividade miR-146a. Após 4 dias, quando esferóides de controlo têm mais totalmente formado depois de submetidos a compactação, a inibição de miR-146a com um inibidor de LNA reduz o tamanho do esferóide, em comparação com um LNA de controlo negativo, em SKOV-3, mas apenas de forma modesta em OVCAR-8 (Figura 4C ). 45 esferóides foram medidos em cada replicado, e três repetições independentes foram executadas. O tamanho de cada esferóide foi determinada por ImageJ e a distribuição do tamanho de esferóides é representado com diagramas de caixa (Figura 4C e 4D). formação esferóide pode ser um desafio devido a ligeiras diferenças no número de células utilizadas para semear cada esferóide. Com moldes de agarose, avaliamos um grande número de esferóides para superar as preocupações com erros no número de células utilizadas para semear os esferóides em cada poço permitindo as diferenças dependentes distintas miRNA a ser observado.
24 horas após a transfecção com anti- inibidores de miR LNA ou imita pré-miR como indicado, 700 /ul SKOV-3 ou de 600 /ul de células OVCAR-8 foram cultivadas em 35 micromolds bem agarose com um esferóide formando em cada poço. A. miR-21 e miR-146a são regulados positivamente em 4 dias Skov-3 e OVCAR-8 esferóides detectadas usando Taqman qPCR cartões de matriz em duas repetições. As barras de erro são S.E.M. B. Inibição de miR-146a com 10 nM de LNA atrasos formação esferóide a esferóides e leva formados mais amorfas e mais flexível em SKOV-3 e OVCAR-8, após 2 dias. barra vermelha é de 400 mm. C. Caixa de trama e suiça mostra que a inibição de miR-146a com LNA reduz significativamente o tamanho do esferóide após 4 dias em SKOV-3, e modestamente em OVCAR-8. Representante de expressão mostrado quatro repetições. D. A expressão ectópica de miR-150 e miR-146a aumenta significativamente a formação de esferóides, após 4 dias. As células SKOV-3 e OVCAR-8 foram transfectadas com 50 nM de pré-miR miR-150 e miR-146a pré-miRs antes da formação do esferóide. SKOV-3 OVCAR-8 ou as células foram transfectadas tal como indicado. esferóides representativos são mostrados. barra vermelha é de 400 mm. Box-Whisker da distribuição de tamanho de 45 esferóides de uma experiência representativa. Experimento foi reproduzido três vezes. Os valores de p determinado pelo teste t de Student.
De acordo com a expressão aumentada de miARNs em esferóides sendo crítica para a formação de esferóides, maior expressão de miR-146a miR-150 e promover esferóides maiores em células SKOV-3 e OVCAR-8 (Figura 4D). Introdução de miR-150 e miR-146a mostram os efeitos mais consistentes e maiores em esferóides em comparação com o controlo negativo e os outros pré-miRs testados. Para o miR-146a, observa-se esferóides menores quando o miR-146a é inibida (Figura 4C) e esferóides maiores após expressão ectópica (Figura 4D) após 4 dias de formação de esferóides. Juntas, essas observações, apoiar miR-146a promover a formação esferóide.
miR-150 e tolerância aumento cisplatina miR-146a
Uma vez que as metástases são estabelecidas, câncer de ovário é muito difícil de tratar como recorrente resistente tumores muitas vezes re-emergir após a quimioterapia inicial. Mudanças na expressão de miRNA pode indicar um estado fisiológico diferente para as células cancerosas nas metástases que afetam como essas lesões iria responder à quimioterapia. Testou-se o efeito de expressão aumentada de quatro miARNs, sobre-regulada em lesões do omento, na sensibilidade cisplatina. estudos utilizando ensaios dependentes da dose WST-1 revelam que a maior expressão de miR-150 aumenta modestamente a cisplatina IC
50 em SKOV-3, mas não OVCAR-8 e IGROV-1 (Figura 5A). Outros miRNAs, como miR-146a, afectada SKOV-3 ou IGROV-1, mas não tanto de forma estatisticamente significativa.
a. O tratamento de células com pré-miR-150 mímico modestamente aumenta o IC50 cisplatina em células SKOV-3 e IGROV-1, mas não células OVCAR-8. Os ensaios de WST-1 foram realizadas 48 horas após tratamento com cisplatina. Gráfico mostra média de 3 repetições biológicas. As barras de erro representam S.E.M. B. Diagrama esquemático do ensaio de sobrevivência de cisplatina. As células são tratadas duas vezes com altas concentrações de cisplatina levando a sobrevivência de cerca de 1% das células. C. miR-150 e miR-146a são regulados positivamente em células sobreviventes após 6 dias de 50 pM de cisplatina em células SKOV-3 e 7 dias de 30 pM de cisplatina em células OVCAR-8 em comparação com células não tratadas, em proliferação. Os dados estão em duplicado e de erro barras são �e.p.m A mudança de dobragem para miR-150 é muito grande, porque o miR-150 não foi detectável em células em proliferação. C
t foi definido como ciclo máxima testada, 40, para estimar a variação vezes. D. Inibição de miR-146a com 10 nM de inibidor de LNA reduz significativamente o número de células residuais na SKOV-3 e modestamente reduz as células sobreviventes em OVCAR-8, após 6 dias de 50 pM de cisplatina em células SKOV-3 e 7 dias de 30 uM cisplatina em células OVCAR-8. As células viáveis sobreviventes foram determinadas por ensaio de exclusão de azul de tripano. experiências em triplicado biológicas são mostrados. As barras de erro são S.E.M. E. A transfecção de 50 nM pré-miR-146a e pré-miR-150 aumenta a sobrevida a longo prazo após 6 dias de 50 � cisplatina em SKOV-3 e 7 dias de 30 � cisplatina em células OVCAR-8.
o exame cuidadoso das células em cultura em monocamada durante o tratamento com cisplatina sugeriu que as células saudáveis sobreviveram com maior expressão de miR-146a e miR-150 em concentrações elevadas de cisplatina. A gama dinâmica de células remanescentes seja inferior ao limite de detecção do ensaio de WST-1. Estudos recentes identificaram drogas células quiescentes tolerantes reversíveis que sobrevivem concentrações letais de drogas [29]. Assim, o exame de células sobreviventes representa um modelo alternativo para examinar como as células cancerígenas sobrevivem à quimioterapia. Para testar se os miARNs metastáticos promover a sobrevivência em doses letais de cisplatina, examinámos a expressão de miARN em sobreviver as células residuais em cultura em monocamada expostos a doses letais de cisplatina durante 6-7 dias. Descobrimos que o miR-150 e miR-146a estão significativamente sobre-regulada nas células sobreviventes em comparação com a população em proliferação (Figura 5C). miR-150 não é detectável em células OVCAR-8 e por baixo do limiar recomendado ABI em SKOV-3 (células C
sub ciclos t~36) nas células em proliferação, mas torna-se significativamente expresso em células sobreviventes residuais em ambas as linhas celulares, sugerindo um possível papel em sobreviver cisplatina. Para testar se o miR-146a afecta a capacidade das células de cancro do ovário para sobreviver tratamento com cisplatina a longo prazo, a inibição de miR-146a com LNA reduz o número de viável células sobreviventes residuais modestamente em OVCAR-8, e de forma mais significativa no SKOV-3 células (Figura 5D). Consistente com a sua expressão aumentada nas células sobreviventes, descobrimos que a maior expressão de miR-150 ou miR-146a aumenta significativamente o número de células sobreviventes viáveis por ensaio de exclusão de azul de tripano, seis (SKOV-3) ou sete (OVCAR-8) dias após a adição de concentrações letais de cisplatina (Figura 5E). Azul de tripano é um indicador do número de células viáveis e reflecte o aumento do número de células sobreviventes foi observado visualmente. Nem todos os miARNs ectopicamente expressas melhorar a sobrevivência sugerindo que os efeitos do miR-150 e miR-146a são específicos. Estas observações sugerem que o aumento da expressão de miR-150 e miR-146a promover a sobrevivência, ou, pelo menos, retardar a morte celular induzida por cisplatina, em células de cancro do ovário.
Discussão
Nossas principais descobertas demonstram que tumores metastáticos sobre-regular miARNs específicos em comparação com os tumores primários e que, entre estas miARNs, miR-146a e miR-150 promover a formação de esferóides 3D e aumentar a tolerância à cisplatina em células de cancro do ovário, sugerindo um papel para estas miARNs para a sobrevivência em específico condições. Observamos recorrência significativa comum de regulação diferencial de 17 miARNs, o que sugere que os requisitos para se adaptar ao omento são muito semelhantes na maioria dos pacientes de AOE. Em conjunto, estes dados suportam a ideia de que as lesões do omento são enriquecidas para as características de doença agressiva, que também medeiam a resposta do doente à quimioterapia. Algumas destas características, tais como miR-146a e expressão de miR-150 pode ser exclusivo para metástases, como eles são muito humildes expressa na maioria dos tumores primários em nosso conjunto de dados e, em TCGA [21]. Baixa expressão destes miARNs em tumores primários está associada com a sobrevivência do paciente pobre geral [21]. Porque estes miARNs são frequentemente regulados positivamente em lesões do omento e altamente correlacionada com a expressão em tumores primários (Pearson = 0,7 para miR-150 e 0,78 para miR-146a), prevemos que a expressão mais elevada em metástases vai ser associado com menor sobrevivência global e progressão da doença.
Um dos objetivos deste estudo foi compreender como semelhante ou tumores ovarianos primários diferentes são de metástases do omento. Esforços anteriores comparando estes tumores têm aplicado tecnologias de microarray para analisar os níveis de expressão de mRNA. Usando limites estritos, relativamente pequenas diferenças entre os tumores primários e metastáticos foram relatados [15]. No entanto, uma série de estudos relatam diferenças significativas por outros métodos, incluindo a imuno-histoquímica da caderina-E [19], as MMPs [17] e a recente descoberta de sinalização de adipócitos que afectam as células cancerosas no omento [8]. miARNs surgiram como reguladores chave do destino celular e numerosos estudos de perfis de miARN sugerem que miARNs podem ter uma gama dinâmica maior nas suas diferenças de expressão através de tecidos que permitam a identificação de tecido distintas e tumorais assinaturas de expressão específicos.
Porque o células do estroma diferem entre os dois tumores, algumas das grandes diferenças de expressão de miARN pode originam a partir destas células. Para identificar quais, se algum, as diferenças de expressão de miARN originam a partir de células de cancro, foram realizadas duas experiências. Fomos capazes de detectar miR-21 por ISH, que mostra aumento miR-21 expressão em H E as células cancerosas coradas (Figura 2A e Figura S5). Estes dados também mostram que algum aumento da expressão de miR-21 em alguns pacientes são originários a partir de células do estroma. Para realizar uma análise mais abrangente, combinamos matrizes Taqman qPCR com LCM para examinar uma população de células de câncer enriquecido. Estes dados revelam que alguns dos miARNs identificado na triagem grandes quantidades (de miR-370, o miR-124, o miR-508, o miR-509) são provavelmente não expressos em células de cancro por não terem sido facilmente detectado na população enriquecida LCM. Por outro lado, 11/17 dos miARNs, incluindo o miR-146a e miR-150, identificados no tumor grandes quantidades são expressas e manter as diferenças de expressão semelhantes nas células cancerosas LCM enriquecido.
perfil de expressão de grandes quantidades tanto tumor e LCM enriquecido populações de células cancerosas, bem como dados sugerem ISH significativa sobre-regulação de miR-21 em comparação com metástases de tumores primários. miR-21 é bem conhecido por ser um anti-apoptótica, pró-miARN sobrevivência em muitos cancros, incluindo ovário [30], e as nossas observações preliminares também apoiam o papel do miR-21 para promover a formação de esferóides (dados não mostrados). Estas observações suportam o conceito de que as metástases do omento pode ser seleccionado para ser mais resistente à quimioterapia tendo sobrevivido a fuga a partir do tumor primário.
miARNs frequentemente sub-regular a expressão por ligação da 3’UTR do ARNm. O efeito sobre a estabilidade do ARNm e os níveis de ARN total é muitas vezes modesto [31], [32], a avaliação de mudanças de expressão de ARNm pode ser difícil de observar. Para obter insights sobre como up-regulada miRNAs metastáticos são mediar a proliferação e resposta cisplatina, avaliamos os seus objectivos previstos. Nós achamos que miR-21, alvos de miR-146a e miR-150 de mRNA são significativamente regulada para baixo em comparação com conjuntos selecionados aleatoriamente equivalentemente porte gene (Figura S4), de acordo com estes miRNAs reprimir activamente mRNAs em tumores metastáticos.
miR-150 é a mais conhecida pelo seu papel na regulação da diferenciação de células-B e o momento de expressão é fundamental para o seu papel na promoção do desenvolvimento de células B [33], [34]. Relatórios recentes sugerem que miR-150 pode promover ou inibir a tumores [35], [36], [37], [38], com destaque para o tema comum das funções dependentes do contexto de miRNAs [39], [40]. Não observar correlação inversa com a expressão da anteriormente identificada P2RX7 miR-150 alvos [41] ou EGR2 [35] em nossos dados relativos aos tumores primários /metastáticas.
miR-146a tem sido identificada como um supressor de tumor através down-regulação da NFkB ativadores IRAK1 e TRAF6 [42], [43]. No entanto, descobrimos que IRAK1 e TRAF6 não são expressos em células SKOV-3 ou OVCAR-8 por qPCR (dados não mostrados). Em alguns contextos, o miR-146a é oncogénica, suprimindo BRCA1 [44] ou FAS [45]. Não foi observada redução significativa de BRCA1, BRCA2, ou a expressão da FAS sobre o miR-146a expressão ectópica (dados não mostrados). Supressão de BRCA1 não faria sentido com o aumento da sobrevivência, como a diminuição BRCA1 /funções de reparo de DNA BRCA2 mediada estão associadas com maior sensibilidade a cisplatina [46]. Assim, o miR-146a parece funcionar através de um novo mecanismo de células de cancro do ovário para aumentar a sobrevivência.
a hipótese de que as alterações na expressão de miARN em comparação com metástases de tumores primários pode indicar funções no ambiente metastático que diferem do ambiente do tumor primário. Para começar a modelar como estes miRNAs pode apoiar o crescimento sustentado ea sobrevivência de tumores metastáticos, que embarcou em uma série de experiências funcionais utilizando linhas celulares de cancro do ovário estabelecidos. Usamos ganho e perda de estudos de função em ensaios de viabilidade celular cisplatina para encontrar nenhuns efeitos significativos de miR-146a e miR-150 sobre a sensibilidade à droga ou crescimento de células de câncer de ovário. Estudos preliminares ensaios de migração não revelou efeitos significativos dependentes de miARN (dados não mostrados). No entanto, descobrimos que miR-146a e miR-150 mediar a formação eo tamanho de esferóides. Como as células cancerosas escapar ao tumor primário e entrar na cavidade peritoneal, que muitas vezes formar agregados de 50-750 uM de tamanho. Os esferóides são semelhantes a estes agregados isolados a partir de pacientes [47] e assemelham-se tumores de xenoenxerto melhores do que a cultura monocamada [48]. Algumas das alterações tais como um aumento da expressão das integrinas nas metástases estabelecidas visto também são observadas nestes esferóides (dados não mostrados), e pode reflectir o efeito comunidade mais reminiscente da doença humana [19], [47], [49]. Nossas observações que miR-146a é regulado para cima nas metástases do omento humanos, com uma diminuição concomitante na alvos de mRNA previsíveis, e esferóides em conjunto com ganho e perda de ensaios funcionais sugerem um papel importante para miR-146a na formação e manutenção de metástases . Estes dados também suporta um papel para miR-150, mas sem perda de dados da função, as conclusões com base nas experiências funcionais não são tão fortes. Juntamente com o teste de tolerância à cisplatina, estes dados apoiam a possibilidade de que o miR-146a e miR-150 são precisa de suportar a sobrevivência em condições de tensão tais como o crescimento de esferóides, concentrações elevadas de tratamento com cisplatina, e a adaptação às novas condições ambientais durante difusão em pacientes.
Uma advertência deste estudo é que essas linhas celulares podem não recapitular características-chave de células cancerosas em tumores, incluindo a expressão de miR-150 visto em tumores do ovário. Nossa incapacidade de modelar adequadamente cancro do ovário
in vitro
ou
in vivo
pode ser obscurecendo funções adicionais destes miRNAs-regulada nas metástases do omento. culturas a curto prazo das linhas de células derivadas ou recém-exame da função miARN em modelos animais pode ser necessária para identificar as funções adicionais destes miARNs na metástase. Estes dados ilustram algumas como miARN pode ser importante para a sobrevivência em condições específicas e são assim seleccionados para expressão aumentada nas metástases. Futuros estudos que examinam miR-146a e miR-150 usando
in vivo
modelos e sistemas de co-cultura pode ajudar a fornecer informações sobre as funções desses miRNAs.
Um dos maiores desafios no tratamento avançado