Abstract

O papel do c-Crk (CRK) na promoção da metástase é bem descrita no entanto o papel da fosforilação CRK e os eventos de sinalização correspondentes não são bem explicado. Temos observado CRK-II serina 41 fosforilação é inversamente correlacionada com p120-catenina e expressões E-caderina em células de câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC). Por conseguinte, foram investigados o papel de CRK-II serina 41 fosforilação na sub-regulação de P120-catenina, a mobilidade celular e capacidade invasiva de células em células NSCLC. Para este fim, expressamos phosphomimetic e phosphodeficient serina CRK-II 41 mutantes em células NSCLC. células NSCLC expressando phosphomimetic CRK-II seine 41 mutante apresentaram menor nível de p120-catenina, enquanto CRK-II seine 41 phosphodeficient expressão mutante resultou em maior p120-catenina. Além disso, as células A549 que expressam CRK-II serina 41 mutante phosphomimetic demonstraram comportamento mais agressivo em ensaios de cura de feridas e a invasão e, pelo contrário, a expressão de phosphodeficient CRK-II serina 41 mutante em células A549 resultou na motilidade e invasividade celular reduzida. Nós também fornecemos evidências de que PAK1 medeia CRK-II serina 41 de fosforilação. ARNi silenciamento mediado de PAK1 aumento do nível de p120-catenina em células A549 e H157. Além disso, PAK1 silenciamento diminuição da motilidade celular e invasão em células A549. Estes efeitos foram revogadas em células A549 que expressam phosphomimetic serina CRK-II 41. Em resumo, estes dados fornecem evidências para o papel de PAK1 na promoção da motilidade celular, invasão celular e na regulação para baixo dos p120-catenin através CRK serina 41 fosforilação em células NSCLC

Citation:. Rettig M, Trinidad K, Pezeshkpour G, a Frost P, Sharma S, Moatamed F, et al. (2012) PAK1 Kinase Promove a motilidade celular e invasão através CRK-II Serina fosforilação em não-pequenas células do cancro do pulmão de células. PLoS ONE 7 (7): e42012. doi: 10.1371 /journal.pone.0042012

editor: Frederic Andre, Universidade de Aix-Marseille, França |

Recebido: 07 de março de 2012; Aceito: 29 de junho de 2012; Publicado: 27 Julho 2012 |

Direitos de autor: © Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade legal. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O desenvolvimento de lesões metastáticas em tumores mais sólidos resultar em uma doença incurável por modalidades de tratamento de hoje. Portanto, a compreensão dos eventos que promovem a invasão tumoral e metástase nos ajudará a prevenir a propagação de tumores malignos, especialmente em caso de fase precoce e doença talvez oligometastatic. Como membro de conexão aderente, p120-catenina (p120ctn) desempenha um papel importante em adesões célula-célula e a perda de resultados de expressão p120-catenina em desestabilização do complexo caderina-catenina promovendo assim a invasão tumoral e metástase [1], [2 ], [3], [4],. Considerando downregulation de p120-catenina no cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) é transcrição mediada [11], uma investigação nos eventos de sinalização a montante que poderia resultar na repressão da transcrição da

p120-catenina (CTNND1),

levam-nos ao adaptador CRK proteína e o seu papel na repressão de p120-catenina [12].

C-Crk (CRK) pertence a uma família de proteínas adaptadoras amplamente expressos que estão envolvidas na transdução de sinal a partir de uma variedade de receptores e oncoproteínas (por exemplo, Bcr-Abl, Tel-Abl, receptor de eritropoietina, EGFR, GM-CSF, do substrato do receptor da insulina, PDGF e VEGFR [13], [14]). CRK, interage com vários efectores a jusante, incluindo SOS1, DOCK1 JNK1 e SP1. Nossos dados mostram que CRK regula negativamente

p120-catenina (CTNND1)

transcrição em células NSCLC através da interação com fator de transcrição SP1 [12]. A posição central do CRK em cascatas de sinalização torna provável que CRK afeta diversos alvos a jusante, com excepção do

p120-catenina (CTNND1)

promotor, promovendo assim a progressão do tumor, invasão e metástase.

Além CRK sobre-expressão como um proto-oncogene e o seu papel na transformação celular, CRK fosforilação também é capaz de contribuir para a sua actividade bioquímica. Como uma proteína adaptador, CRK não contém um domínio catalítico tirosina no entanto ambas as actividades e de serina-quinase tem sido associada com CRK [15]. Proteínas com tirosina fosforilada, serina ou treonina eram detectáveis ​​no imunoprecipitado da CRK em células do vírus de sarcoma aviário (CT10) infectadas [15]. Neste estudo, o produto do vírus CT10 (p47

gag-CRK

) em si também foi altamente fosforilada principalmente na serina e cerca de cinco por cento em resíduos de tirosina. Diversas vias de sinalização intracelulares contribuir para CRK fosforilação. Por exemplo, c-Abl tirosina fosforila Crk em 221 causando a dissociação de Crk do substrato Crk-associado (CAS), inibindo assim a migração de células e promovendo a apoptose em células normais e malignas [16], [17]. Abl tem uma função fundamental na formação e manutenção de junções aderentes tal como foi demonstrado em fibroblastos embrionários de rato [18], [19]. Este efeito de Abl em junções aderentes parece ser mediada pela via da Crk e Rac1, que regulam a adesão complexo caderina-catenina. Estas descobertas estão apontando para o fato de que CRK fosforilação desempenha um papel importante na motilidade celular e promoção metástase

Com relação à CRK fosforilação serina, dois serina /treonina quinases, [isto é, hematopoiéticas progenitoras quinase 1 (HPK1.; MAP4K1) e quinase homóloga a SPS1 /STE20 (KHS; MAP4K5)], os membros de PAK serina /treonina-quinase de super família, são conhecidos para mediar a fosforilação de membros da família CRK e, eventualmente, participam no CRK mediada por activação de JNK, [20], [21] . quinases activadas por p21 (Paks) são reguladores conhecidos da remodelação do citoesqueleto e a motilidade celular e parece que quinases PAK desempenhar um papel na promoção metastático nos tumores malignos [22]. Por exemplo, PAK endógeno é activada constitutivamente em certas linhas celulares de cancro da mama [23] e a expressão ectópica de PAK1 constitutivamente activada em células MCF-7 de carcinoma da mama não-metastáticos aumento da motilidade de células [24]. Além disso, a sobre-expressão de PAK1 foi recentemente relatado em NSCLC, principalmente na histologia de células escamosas [25]. O acima indicado sugerem fortemente um papel para CRK fosforilação serina na promoção metastática de tumores malignos. vias bioquímicas que regulam CRK fosforilação serina e o papel de CRK fosforilação serina na promoção da metástase não são bem estudadas até hoje. Aqui nós fornecemos evidências de que PAK1 quinase medeia CRK-II serina 41 fosforilação promovendo assim a motilidade celular e invasão em células NSCLC.

Resultados

CRK-II Serina 41 fosforilação é inversamente correlacionada com

p120-catenin

Expressão

Nós informou recentemente que CRK medeia a repressão transcricional de

p120-catenina (CTNND1)

em células NSCLC. CRK pode ser fosforilada em ambas as tirosina e serina resíduos, que então influencia sua interação com alvos a jusante [15], [16], [26], [27]. Por isso, procurou-se investigar se o status CRK fosforilação, como um substituto de sinais a montante ativados, possivelmente está desempenhando um papel na CRK mediada

p120-catenina (CTNND1)

transcricional repressão. Uma correlação estreita de qualquer das serina ou tirosina fosforilação CRK com expressão p120-catenina que indicaria a presença de uma serina a montante /treonina ou uma tirosina-quinase que seja um mediador CRK fosforilação, assim, a regulação negativa de p120-catenina. Para este efeito, examinou-se o nível de fosforiladas CRK-II tanto na tirosina 221 e serina 41 e correlacionado com os níveis que p120-catenina em um painel de células NSCLC e BEAS-2B (Figura 1). No caso de tirosina 221, fosforilação deste resíduo por c-Abl é relatado para resultar em inibição da migração celular. Observou-se uma correlação inversa entre a fosfo-serina 41 CRK-II com a de p120-catenina e E-caderina níveis de proteína por western blot. Curiosamente, a fosforilação de CRK-II em Y221 não se correlacionou com a expressão p120-catenina. Estes resultados sugerem que os eventos de sinalização que envolvem serina /treonina estão envolvidos em

p120-catenina (CTNND1)

regulação negativa da transcrição através da fosforilação de serina da proteína adaptadora CRK.

B- Quantificação de CRK- II, fosfo-tirosina 221 CRK-II e fosfo-serina 41 CRK-II intensidade do sinal entre as linhagens de células NSCLC e células BEAS-2B.

CRK-II serina 41 fosforilação Regula

p120- catenin

Expressão

a fim de avaliar melhor o papel da CRK serina 41 fosforilação na regulação transcricional de

p120-catenina (CTNND1)

, decidimos analisar se CRK-II serina 41 manipulações pode ter qualquer efeito sobre o nível de expressão p120-catenina. Assim, procedeu-se a preparar CRK-II serina 41 phosphodeficient e mutantes phosphomimetic. A reacção de mutagénese dirigida ao local foi utilizado para substituir CRK-II serina 41 com glicina [Ser41Gly (phosphodeficient)] ou ácido aspártico [Ser41Asp (phosphomimetic)]. Um construto CRK-II fundido com um marcador myc foi utilizado como a espinha dorsal do local dirigida reacções de mutagénese, por conseguinte, todos os mutantes resultantes continham uma etiqueta Myc bem. Todas as construções foram verificadas por sequenciação. Posteriormente, A549, células Rh2 e H157 foram transitoriamente transfectadas com os mutantes CRK-II resultantes e medimos a

p120-catenina (CTNND1)

atividade do promotor, bem como o nível de proteína p120-catenin por western blot na transfectadas células. Os níveis de mutantes CRK-II endógeno e o CRK-II de expressão são apresentados na (Figura S1). Em comparação com células que expressavam tipo selvagem CRK-II, um aumento significativo na

P120-catenina (CTNND1)

actividade do promotor foi observada em células que expressam phosphodeficient CRK-II. Por outro lado, uma diminuição na

P120-catenina (CTNND1)

actividade do promotor foi observada em células que expressam phosphomimetic CRK-II serina 41 mutante (Figura 2). nível de proteína p120-catenin também mudou seguinte expressão de mutantes CRK-II concordantes com as alterações observadas em alterações na atividade do promotor

p120-catenina

em todas as linhas celulares. Estes resultados reforçam ainda mais no papel de CRK serina 41 fosforilação na regulação da transcrição da

p120-catenina (CTNND1)

(t-teste 2 do aluno cauda:. * P 0,05; ** P 0,01; barras de erro representam ± desvio padrão). B- Western blot mostrando mudanças no nível de proteína p120-catenina nas linhas celulares acima mencionadas seguintes transfecção transiente de mutantes CRK-II e CRK-II.

CRK-II Serina 41 fosforilação está envolvido em NSCLC motilidade celular e celular Invasion

Mesmo que observamos CRK-II serina 41 fosforilação está envolvida em

p120-catenina (CTNND1)

transcricional regulamento, não está claro se a fosforilação de CRK-II em serina 41 tem qualquer outro relevância biológica significativa. Uma vez que a expressão de CRK tem sido associada com tumores NSCLC mais agressivos [28], decidimos analisar as propriedades invasivas e com motilidade de células A549 seguintes manipulação de CRK-II serina 41 fosforilação. Assim, procedeu-se células A549 preparadas que expressam de forma estável o nosso serina CRK-II 41 mutantes. As células A549 foram escolhidos para esta experiência uma vez que expressam nível relativamente baixo de endógena CRK-II. Tal como descrito em Materiais e Métodos, células A549 foram transfectadas com CRK-II serina 41 phosphodeficient e mutantes phosphomimetic e foram seleccionadas na presença de G418. As células seleccionadas reunidas foram utilizados para os ensaios de cicatrização de feridas e a invasão de células subsequentes. O nível das proteínas mutantes expressão foram verificadas em um ensaio de western blot (Figura S2). Em seguida, utilizou-se as células A549 resultantes que expressavam estavelmente CRK-II serina 41 e phosphodeficient phosphomimetic mutantes na cicatrização de feridas e ensaios de invasão Matrigel de células, tal como explicado na secção Materiais e Métodos (Figura 3). Como esperado, comparam às células A549 expressar vector vazio, células do tipo selvagem CRK-II expressando mostrou um comportamento mais agressivo. Curiosamente, as células A549 que expressam CRK-II phosphodeficient (Ser41Gly) mutante tinha uma propriedade menos móveis, quase semelhante ao grupo vector vazio e células que expressam phosphomimetic mutante (Ser41Asp) teve o comportamento mais agressivo na ferida ensaios de cura. Nós silenciados o CRK endógena por siRNA em todas as condições, a fim de reduzir a interferência da CRK endógeno com proteínas mutantes CRK-II (Figura S2). O siARN que foi utilizada para silenciar a CRK endógena foi dirigido contra uma sequência fora da grelha de leitura aberta de CRK, por conseguinte, este siRNA não teve efeito sobre a expressão de mutantes CRK por construções de plasmídeos. Uma visão mais ampla deste cura ensaio ferida e as membranas Matrigel são apresentados em (Figuras S3, S4). Semelhante à ferida ensaios de cura, as células A549 que expressam CRK-II serina 41 phosphodeficient mutante tinha o menor grau comparado com as células que expressam o vector vazio e células que expressam CRK-II serina 41 phosphomimetic mutante tinha a propriedade mais invasivo em 24 horas. Mesmo que o endógena CRK-II foi incompletamente silenciados entre os grupos, a proporção de mutantes CRK-II do endógena CRK-II foi aumentada após o silenciamento do CRK endógena. Vale a pena mencionar estes efeitos biológicos não foram vistos se o CRK endógena não foi silenciado.

Endógeno CRK é silenciada em todas as condições de siRNA. B- Medição da área de superfície da ferida 24 horas após o estabelecimento da ferida entre os grupos acima mencionados. A média é calculada de acordo com medida de três experiências separadas. (Teste t de Student bicaudal 2: ** P 0,01; *** P 0,001; barras de erro representam ± desvio padrão) ensaios de invasão .C- após a incubação de células A549 transfectadas de forma estável que expressam qualquer pCMV vector; tipo selvagem CRK-II (TP); CRK-II (Ser41Gly) ou CRK-II (Ser41Asp) mutantes. 1 × 10

5 as células foram incubadas durante a noite, como descrito na secção de Métodos e corado em 24 horas após a incubação. D- Determinação quantitativa das células invadidas. Cinco secções separadas das células invadidas foram contadas. (T-teste 2 do aluno cauda: ** P 0,01; *** P 0,001; barras de erro representam ± desvio padrão)

A fim de examinar se as mudanças na proliferação celular estão contribuindo para. o comportamento biológico observado das linhas de células mutantes com CRK-II, a taxa de proliferação de células das linhas celulares resultantes foram medidos (Figura S5). Após plaqueamento número igual de células A549 transfectadas com mutantes CRK-II-II e CRK, as células foram contadas em intervalos de 24 horas. Não houve diferença significativa nos números de células foram observadas entre os grupos. Estas observações corroboram o envolvimento de CRK-II serina 41 fosforilação na motilidade e invasão de células NSCLC.

PAK1 quinase Medeia CRK-II Serina 41 fosforilação

Considerando o papel da CRK-II serina fosforilação no

p120-catenina (CTNND1)

transcricional repressão e também a promoção da motilidade e invasão em células NSCLC, buscou-se identificar a quinase a montante (s) que possam mediar CRK-II serina 41 de fosforilação. CRK fosforilação de serina tem sido relatada por vários membros da família de PAK serina /treonina cinases de [20], [21]. Por exemplo, progenitoras hematopoiéticas Quinase 1 (HPK1; MAP4K1) e Kinase homóloga a SPS1 /STE20 (KHS; MAP4K5) são relatados para fosforilar membros da família CRK em resíduos de serina. Portanto, decidimos analisar se CRK-II serina 41 fosforilação pode ser mediada pela família PAK de quinases. Para este fim, optou-se por silenciar PAK1 por siRNA em H157 e células NSCLC A549 e examinar CRK-II serina 41 fosforilação por western blot. Em comparação com as células tratadas com não-silenciamento siRNA, PAK1 silenciamento drasticamente reduzida chumbo para fosfo-serina 41 CRK-II em ambos H157 e células A549 (Figura 4C). Além disso, a sequência de aminoácidos de CRK-II dentro da vizinhança de serina 41 partidas com as sequências conhecidas de consenso de fosforilação de PAK1 [29] (Figura 4D). Notavelmente, a sequência de aminoácidos em RDSS CRK-II é idêntica à sequência de fosforilação Pak1 em Raf. Estes resultados estabelecem o papel de PAK1 quinase como uma das quinases que medeiam CRK-II serina 41 fosforilação.

B- quantitativa em tempo real a medição de PCR de ARNm de PAK1 e PAK2, a fim de determinar a eficiência de silenciamento de ARNsi. borrões C-ocidental mostrando fosfo-serina 41 CRK-II e p120-catenin expressão seguintes silenciamento PAK1 siRNA mediada em células A549 e H157. sequência Pak1 D- fosforilação consenso em vários substratos PAK1. Resíduos que são fosforilados por Pak1 são destacadas em cinza. Circulou são os resíduos de arginina a montante que são importantes para a fosforilação alvo Pak1.

Suprime

PAK1 quinase

p120-catenina (CTNND1)

Promotor atividade e expressão Nível

Considerando o envolvimento de PAK1 quinase na mediação fosforilação CRK-II na serina 41 e também o papel de CRK-II serina 41 fosforilação em

p120-catenina (CTNND1)

transcricional repressão, nós perguntado se quinases PAK são, de facto, envolvidos em

p120-catenina (CTNND1)

repressão. Para verificar essa noção, nós silenciados PAK1 e PAK2 por siRNA e mediu o

p120-catenina (CTNND1)

atividade do promotor em um ensaio de luciferase dupla e também mediram o nível de proteína p120-catenin por western blot (Figura 4 ). Seguindo siRNA silenciamento mediado de PAK1 em células A549, foi observado um aumento superior a 100% na actividade da luciferase de

P120-catenina (CTNND1)

repórter promotor comparativamente com as células transfectadas com (Figura 4A) não silenciamento siARN. Além disso, um aumento no nível da proteína p120-catenina foi detectada em células H157 e A549 seguinte siRNA silenciamento mediado PAK1 (Figura 4C). Nós não notar qualquer mudança significativa no

p120-catenina (CTNND1)

atividade do promotor seguinte silenciamento PAK2 siRNA mediada. Estes dados instituir mais um papel para PAK1 na regulação da transcrição do

p120-catenina (CTNND1).

Efeitos de PAK1 Kinase no

p120-catenina (CTNND1)

Promoter atividade é mediada através CRK-II serina 41 fosforilação

para estabelecer ainda uma relação causal entre PAK1 e fosforilação CRK-II na expressão p120-catenina, decidimos examinar o efeito de PAK1 simultânea e CRK-II serina 41 manipulações no

p120-catenina (CTNND1)

transcricional regulação. Consequentemente, nós silenciados PAK1 em células A549 que expressam estavelmente CRK-II serina 41 phosphomimetic e mutantes phosphodeficient (Figura 5). Nós também silenciou o CRK endógeno, através de siRNA para reduzir as interações indesejadas do CRK endógeno. Como esperado, as células A549 que expressam tipo selvagem CRK-II mostrou aumento do nível de

p120-catenina (CTNND1)

atividade transcricional seguinte silenciamento PAK1. Este efeito da PAK1 em

p120-catenina (CTNND1)

atividade transcricional foi revogada em células que expressam tanto phosphomimetic ou phosphodeficient CRK-II serina 41 mutantes que sugerem que a incapacidade de CRK-II para alterar o seu estado de fosforilação na serina 41 (como resultado de mutações inseridas) suprime o efeito de PAK1 em

P120-catenina (CTNND1)

transcrição. Estas descobertas mais apoia o papel de CRK-II serina 41 fosforilação em PAK1 mediada

p120-catenina (CTNND1)

transcricional regulamentação. As pequenas mudanças no

p120-catenina (CTNND1)

atividade do promotor que são observados em CRK-II serina 41 células mutantes expressando phosphomimetic (estatisticamente não significativa) poderia ser como resultado da fosforilação endógena CRK-II alteração seguinte silenciamento PAK1. Vale ressaltar que o silenciamento RNAi mediado do CRK endógena não resulta é uma batida completa para baixo do endógena CRK-II (Figura S2).

Endógeno CRK é silenciada em todas as condições de siRNA. (T-teste 2 do aluno cauda: * P 0,05; barras de erro representam ± desvio padrão)

PAK1 Kinase afeta motilidade celular e invasão celular através CRK-II Serina 41 fosforilação

Considerando (i) CRK-II serina 41 fosforilação promove motilidade celular e invasão e (ii) PAK1 medeia CRK-II serina 41 fosforilação, estávamos perante ele questionar se PAK1 é realmente promove a motilidade celular e invasão através da fosforilação seine CRK-II. Para responder a esta questão foi examinada a motilidade e invasão das células A549 seguindo manipulações simultâneas de PAK1 e CRK-II serina 41 fosforilação (Figura 6). Como esperado, observou-se uma maior motilidade e invasividade de células A549 que expressam CRK-II serina 41 phosphomimetic mutante em comparação com células que expressam tipo selvagem CRK-II. Seguindo siRNA silenciamento mediado de PAK1, as células que expressam tipo selvagem CRK-II mostrou uma diminuição da motilidade e invasividade. Curiosamente, PAK1 silenciamento não tem qualquer efeito sobre a motilidade e invasão de células que expressam CRK-II serina 41 mutante phosphomimetic. Semelhante a outros ensaios, a CRK endógena foi silenciados por ARNsi em todas as condições, a fim de reduzir a interacção de CRK endógeno com CRK-II mutante phosphomimetic. Portanto, podemos concluir que efeito PAK1 na promoção da motilidade celular e invasão é mediada através CRK-II serina 41 de fosforilação.

Endógeno CRK é silenciada em todas as condições de siRNA. B- Medição da área de superfície da ferida 24 horas após o estabelecimento da ferida entre os grupos acima mencionados. A média é calculada de acordo com medida de três experiências separadas. (Teste t de Student bicaudal 2: ** P 0,01; *** P 0,001; barras de erro representam ± desvio padrão). ensaios C- Invasão seguintes incubação de células A549 transfectadas estavelmente expressando tipo selvagem CRK-II (Ser41Asp) mutante CRK-II (WT) ou. Cada linha celular foi tratada com PAK1 siRNA ou sequência mexidos siARN. 1 × 10

5 as células foram incubadas durante a noite, como descrito na secção de Métodos e corado em 36 horas após a incubação. D- Determinação quantitativa das células invadidas. Cinco secções separadas das células invadidas em cada membrana de Matrigel foram contadas.

Discussão

Compreender os eventos de sinalização que: (barras de erro representam ± desvio padrão P ;; 0,001 ** P 0,01 t-teste 2 do aluno cauda). promover metástases em tumores sólidos nos ajudará a fixar o ponto alvos terapêuticos, a fim de intervir no processo de metástase. Perda de adesões célula-célula em células epiteliais é um dos primeiros passos da disseminação do tumor. Portanto, a perda da integridade da junção aderentes e os seus membros (isto é, as caderinas e cateninas) desempenha um papel fundamental na promoção da metástase. Um dos eventos observados frequentes em tumores NSCLC é o downregulation p120-catenina. Desde a repressão p120-catenina em NSCLC é transcrição mediada [11], decidimos investigar mais profundamente os eventos de sinalização a montante que eventualmente levaria a repressão da transcrição da

p120-catenina (CTNND1)

. Através da análise detalhada do

p120-catenina (CTNND1)

promotor, o papel dos fatores de transcrição FOXC2 e SP1 no

p120-catenina (CTNND1)

downregulation foram reconhecidos. Uma análise posterior dos parceiros de ligação SP1 de levar-nos a identificar o papel de proteínas CRK adaptador nesta via [12] (Figura 7). Desde CRK recebe a entrada a partir de várias vias de sinalização, é provável que os oncogenes que transmitem a montante respectivo sinal através CRK ter um impacto significativo sobre a infra-regulação de P120-catenina, a promoção da motilidade celular /invasividade e promoção da metástase de tumores. Portanto, como um substituto de sinais a montante ativados, investigamos o estado de fosforilação de CRK-II e notou CRK-II serina 41 fosforilação tem uma correlação inversa com o nível de expressão p120-catenina em um painel de células NSCLC. De nota, esta correlação não foi observada com a fosforilação de CRK-II na tirosina 221. Como uma proteína adaptador, CRK não contém um domínio catalítico tirosina no entanto ambas as actividades e de serina-quinase tem sido associada com CRK [15]. Nossos dados mostram CRK-II serina 41 fosforilação manipulação altera o

p120-catenina (CTNND1)

atividade do promotor, o nível de expressão e também a propriedade invasiva de células NSCLC.

Em relação CRK- I, parece que a maior expressão de oncoproteínas CRK-I por si só, está correlacionada com a tumorigénese. Esta observação está em contraste com CRK-II, onde fosfo-CRK-II estabelece uma forte associação com a tumorigênese. Um aumento significativo na CRK I-oncoproteínas nível e isoforma fosforilada (CRK-II) foram observados em NSCLC [28]. Da mesma forma, aqui observamos uma correlação estreita e inversa entre a expressão CRK-I, bem como fosfo-serina 41 CRK-II com a de p120-catenina e E-caderina em nosso painel de células NSCLC (Figura 1).

fosforilação CRK serina não está bem estudada, embora existam relatos sobre o papel da família PAK de serina /treonina quinases na fosforilação serina CRK [20], [21]. Aqui nós relatamos o papel da quinase activada por P21 1 (PAK1) em CRK-II serina 41 fosforilação assim downregulation p120-catenina e também a promoção da motilidade celular e invasão em células NSCLC. família PAK de cinases são alvos de proteínas de ligação GTP Cdc42 e Rac1 [30] e também estão envolvidos na reorganização do citoesqueleto. O envolvimento de quinases PAK na promoção da motilidade celular e a forma da célula são também bem conhecido [31], [32]. quinases PAK são classificadas em dois grandes grupos, o Grupo I (PAK1-3) e do grupo II (PAK4-6). Esta classificação baseia-se principalmente na presença de uma região autoinhibitory no grupo I Pak membros [33]. O papel da PAKs grupo I é mais claramente demonstrado na progressão do cancro como superexpressão PAK1 é visto é de vários tipos de tumores. PAK1 é sobre-expresso nos cancros da mama, do ovário, do pulmão e da cabeça e pescoço cancros [25], [34]. Além disso, a expressão PAK1 é declaradamente elevados em progressão maligna do carcinoma colo-rectal humano [35]. Curiosamente, PAK1 também está envolvida na cicatrização de feridas e a regulação da inibição por contato em células epiteliais. Após expressão de PAK1 activado em células epiteliais MDCK, observou-se uma falta de paragem do crescimento em cima do fecho de feridas [36]. Aqui, nós examinamos o papel de PAK1 e PAK2 no CRK mediada regulação da transcrição da

p120-catenina (CTNND1) Comprar e só poderia identificar PAK1 como um regulador do

p120-catenina (CTNND1)

. PAK1 silenciamento reduzida CRK-II serina 41 fosforilação em células A549 e H157 e melhorado

p120-catenina (CTNND1)

nível de atividade do promotor e proteína em células NSCLC. Além disso, PAK1 silenciamento reduzida motilidade celular e invasão via CRK-II serina 41 de fosforilação.

PAK1 tem um número de alvos a jusante que regulam a organização da actina e polimerização, a proliferação celular e apoptose. Por exemplo, Pak1 interage com filamina A e LIM-quinase [24], [37], que inactivar a proteína cofilina desestabilizador F-actina, conduzindo a agregação de fibras de F-actina [38]. Além de regular o citoesqueleto, PAK1 tem um papel importante na regulação da activação de vias de sinalização MAPK. Pak1 ativa diretamente Raf-1, por fosforilação serina 338 [39] Além disso Pak1 ativa diretamente MEK1, fosforilação serina 298 [40]. Para além de activar a ERK MAPK, PAK1 sobre-expressa tem sido relatado para activar MAPK p38 [41], [42], embora os detalhes desta interacção não são bem compreendidos. PAK1 também parece estar relacionado com a actividade de JNK. Superexpressão de Pak1 por diferentes investigadores produziu diferentes relatórios que indicam ambos [30], [41], [43] e deficientes [44], [45] a actividade de JNK reforçada. Além disso, PAK1 tem sido relatada como sendo um membro de uma rede de sinalização anti-apoptótica através das suas interacções com Bad [46], [47], [48], [49]. Dados fornecidos aqui introduzir CRK-II como outro alvo a jusante de PAK1. Considerando CRK-II serina 41 é parte de uma sequência de consenso de fosforilação PAK1 (Figura 4D), é provável que fosforila directamente PAK1 CRK-II na serina 41.

Em resumo, estes dados descrevem um dos metastático promover percursos em células NSCLC envolvendo quinase PAK1, CRK-II, SP1 e p120-catenina. Em outras palavras, CRK-II fosforilação parece desempenhar um papel na transmissão de sinais a jusante da PAK1. Em conjunto com outro relatório que destaca PAK1 superexpressão em células escamosas NSCLC [25], [46], parece inibição PAK1 pode fornecer uma estratégia viável para interromper o comportamento pró-metastático de certos subtipos de NSCLC.

materiais e Métodos

Cell Cultures

A549, H157, H358 Rh2 e as células foram rotineiramente cultivadas em RPMI suplementado com antibióticos e inactivado pelo calor 10% de FBS (Omega Scientific, Tarzana, CA). células epiteliais humanas normais imortalizadas (BEAS-2B) foram cultivadas em meio suplementado com BEBM todos os aditivos (Lonza /Clonetics Corporation, Suíça; Catalog No. CC-3170).

Medição da actividade de luciferase por p120ctn promotor duplo ensaio

p120ctn

construção do promotor foi transfectado em linhas celulares de NSCLC por Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Vinte e quatro horas após a transfecção as células foram lavadas com PBS e lisadas usando um sonicador Branson em 1x tampão de lise passiva (Promega), à temperatura ambiente (TA). a expressão do gene repórter foi avaliada utilizando o kit de luciferase dupla Reporter Assay System (Promega) de acordo com as instruções do fabricante num TD-20/20 (Luminómetro Turner Biosystems, Sunnyvale, CA). Nós normalizada para a eficiência de transfecção transiente (atividade ou seja, um vaga-lume luciferase) por co-transfecção de um

Renilla

luciferase expressando vetor de controle (PRL-SV40). Todas as experiências foram realizadas em triplicado e foram relatados como médias ± desvio padrão (DP), e cada experiência foi realizada pelo menos duas vezes.

siARN Mediada por silenciamento de genes

células A549 e H157 foram transfectada com siRNA contra CRK, PAK1 e PAK2. As transfecções foram realizadas com Lipofectamina 2.000 (Invitrogen). As sequências duplex de siRNA que usamos para silenciar os genes acima mencionados são os seguintes:

CRK:. 5′-CUGCUUACCCUGAUUUAUUdtdt-3 ‘

5′-AAUAAAUCAGGGUAAGCAUdtdt-3′

PAK1 : 5′-GAAAGAGCGGCCAGAGAUUdtdt-3 ‘

5′-AAUCUCUGGCCGCUCUUUCdtdt-3′

PAK2:.. 5′-GGAUUUCUUAAAUCGAUGUdtdt-3 ‘

5′-ACAUCGAUUUAAGAAAUCCdtdt-3′