Abstract

ACETOGENINA, uma grande família de polyketides que ocorrem naturalmente isolado de várias espécies da planta genus

Annonaceae

, foram encontrados para exibir citotoxicidade significativa contra uma variedade de células cancerosas. Estudos anteriores mostraram que estes compostos poderiam agir sobre as mitocôndrias complexo-I e bloquear a cadeia de transporte electrónico correspondente e encerrar a produção de ATP. Contudo, mais pormenores dos mecanismos de acção permanecem ambíguas. Neste estudo testámos os efeitos de um conjunto de miméticos de acetogenina Annonaceous em algumas linhas celulares de cancro, e relatam que entre eles AA005 exibe a actividade anti-tumoral mais potente. AA005 esgota ATP, ativa a proteína quinase ativada pela AMP (AMPK) e inibe complexo mTOR 1 (mTORC1) via de sinal, levando a inibição do crescimento e autofagia de células cancerígenas do cólon. inibidores da AMPK composto C e reprimir inosina, enquanto AMPK ativador AICAR aumenta, de supressão de proliferação causou-AA005 e subsequente autofagia de células cancerígenas do cólon. AA005 aumenta a depleção de ATP e a activação da AMPK causada por 2-desoxiglucose, um inibidor da respiração mitocondrial e glicólise. AA005 também inibe agente quimioterapêutico cisplatina-desencadeada a sobre-regulação de mTOR e sinergiza com esta droga na supressão da proliferação e indução da apoptose de células de cancro do cólon. Estes dados indicam que AA005 é um novo inibidor metabólico que apresenta potenciais terapêuticos no cancro do cólon

citação:. Liu Y-Q, Cheng X, Guo L-X, Mao C, Chen Y-J, Liu H-X, et al. (2012) Identificação de um Annonaceous acetogenina mimético, AA005, como um ativador da AMPK e Autophagy Indutor em células de cancro do cólon. PLoS ONE 7 (10): e47049. doi: 10.1371 /journal.pone.0047049

editor: Xiaolin Zi, University of California Irvine, Estados Unidos da América

Recebido: 31 de janeiro de 2012; Aceito: 11 de setembro de 2012; Publicação: 08 de outubro de 2012

Direitos de autor: © Liu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pelo Programa Key Nacional de Pesquisa básica (2012CB910800, 2010CB833200 e 2009CB940900), o National Natural Science Foundation (No. 81071930, 81171925, 20972160 e 21172220), a Fundação especial do Presidente e do Projeto chave de Programa de Inovação Conhecimento da Academia chinesa de Ciências (KSCX1-YW-R-26 e-R-235 YW KSCX2) Programa, e o major científica nacional e tecnológico para Drug Discovery (2009ZX09103-101). Sem financiamento externo adicional recebida para este estudo. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

nas células tumorais há um aumento da enzimas da via glicolítica e transportadores de glicose, mesmo na presença de um elevado o

concentração 2, em última análise, leva a uma taxa de produção de ATP elevada [1]. evidência clínica tem ligado o metabolismo das células com os resultados do câncer, e metabolismo energético reprogramação foi aprovado para ser uma característica emergente de câncer [2]. Estas observações têm levantado interesse em segmentação metabolismo energético para a terapia do cancro, tanto para hipóxico (glicolítica) e tumores oxidativos [1], se bem que também se refere a estas terapias que teria efeitos inaceitáveis ​​sobre as células normais. Curiosamente, algumas das primeiras terapias contra o câncer orientados para as necessidades metabólicas específicas de células cancerosas permanecem eficazes na clínica hoje, os esforços de re-inspiração para direcionar dependências metabólicas das células cancerosas como uma estratégia anticancerígeno seletiva [3].

AMP- proteína quinase activada (AMPK), que existe em células como um complexo heterotrimérico composto por uma subunidade catalítica de cinase (α) e duas subunidades reguladoras (p e y), é um sensor do estado de energia que mantém a homeostase de energia celular. É activado por uma queda em ATP (concomitante com um aumento em ADP e AMP) ou estímulos que aumentar a razão celular de AMP /ATP, resultando na activação de vias catabólicas e a inibição de vias anabólicas [4], [5]. Essencial para a ativação da AMPK é sua fosforilação na Thr-172 por um quinases AMPK a montante (AMPKKs) [6] e LKB1 supressor de tumor [7], que é uma serina /treonina quinase associada à polipose gastrointestinal e [8] e câncer de pulmão câncer [ ,,,0],9]. AMPK fosforila dois enzimas limitantes da velocidade de ácido gordo e da síntese de colesterol: acetil-CoA carboxilase (ACC) e HMG-CoA redutase, bem como outros alvos a jusante, que culmina na inibição de vias anabólicas e a activação das vias catabólicas [5] . activação AMPK limita directamente de iniciação da tradução e a síntese proteica [10], através da inibição do factor de elongação 2 (EF2) [11], e indirectamente através TSC2, levando a supressão de alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) [12], que pode fosforilar e activar p70 S6 quinase e proteína de ligação a 4E (4EBP) [13].

activação AMPK pela AMP analógico ribonucleótido 5-aminoimidazol-4-carboxamida (AICAR) acumula ciclina dependente da cinase p21 e os inibidores da p27 e sub-regula a ciclina D1 em células de carcinoma hepatocelular humano, conduzindo à paragem do ciclo celular na fase G1 [14]. Estudos populacionais fornecer indícios de que o uso de metformina, que é um activador de AMPK, podem ser associados com uma incidência reduzida e melhor prognóstico de certos tipos de cancro [15], [16]. No cancro da mama, a metformina exerce efeitos inibidores via inibição da iniciação da tradução dependente de mTOR [17], [18]. A metformina inibe a proliferação, ciclo celular diminui a viabilidade celular e blocos em fase G1 em células de cancro da próstata, e tratamento in vivo com metformina leva a uma redução significativa do crescimento do tumor em ratinhos portadores de xenoenxertos de células de cancro da próstata [19]. A metformina e AICAR induzir apoptose e suprime o crescimento de tumores de p53 do cancro do cólon HCT116 linha (- /-) xenoenxertos, e desencadear autofagia de células [20] p53 HCT116 (+ /+). AICAR e proteína dobrar inibidor de 17-AAG, especialmente quando combinados, mostram eficácia contra linhas celulares de cancro humano aneuploides [21]. Estes resultados indicam que a AMPK poderia ser um alvo racional de fármacos e compostos de chumbo deveriam ser identificados ou concebidas para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para cancros.

ACETOGENINA representam uma classe de policetidos de ocorrência natural isolados a partir de várias espécies da planta genus

Annonaceae

[22]. Estes compostos apresentam diversas bioactividades, incluindo cytotoxicites promissoras e actividades antiparasitas [23]. Embora estudos mostram que ACETOGENINA pode interromper a função mitocondrial através do bloqueio mitocôndrias I complexa e NADH oxidase Ubiquinona-unido, [23], e vincular a terceira alça do lado da matriz da subunidade ND1 em oxidorredutase NADH-ubiquinona mitocondrial [23], [24], os mecanismos de ação destes compostos no combate ao câncer permanecem largamente desconhecidos. O grupo de química de nossa equipe tinha concebido e sintetizado uma série de miméticos acetogenina annonaceous [25] – [28]. Neste trabalho foi testada a actividade biológica de alguns dos novos análogos e investigados os mecanismos subjacentes citotoxicidades ‘ACETOGENINA, e relataram que um AA005 mimético que mostraram actividades inibidoras potentes e selectivos contra uma variedade de células cancerosas, foi capaz de ativar a AMPK e induzir células parada do ciclo seguido por autofagia, demonstrando suas potencialidades terapêuticas

Materiais e Métodos

produtos químicos e reagentes

Annonaceous acetogenina miméticos (Tabela 1) foram dissolvidos em DMSO e armazenado a. – 20 ° C. O 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT) foi comprado de Amresco Inc. (Solon, OH). Composto C, rapamicina, rotenona, inosina, rodamina 123, 2-DG e AICAR foram adquiridos da Sigma. MitoTracker Deep Red FM foi adquirido de Invitrogen. ATP Assay Kit foi comprado de Beyotime Instituto de Biotecnologia (Haimen, Jiangsu, China)

Os anticorpos

Os anticorpos utilizados neste estudo foram os seguintes:. Anti-β-actina ( Sigma); anti-p-AMPKα1, anti-P-ACC, anti-P-mTOR, anti-P-S6K, anti-AMPKα1, anti-ACC, anti-mTOR, anti-S6K, anti-PARP, de cabra anti-coelho IgG e HRP de cabra anti-IgG de ratinho-HRP de anticorpo (Cell Signaling Technology); anti-CyclinD1 (Abcam), anti-CDK4 (Santa Cruz Biotechnology) e anti-LC3 (Sigma).

Cultura de Células e Transfecção

O pulmão linha de células de câncer de A549, células de câncer de mama a linha MCF-7, linha celular de cancro cervical HeLa, linhas celulares de cancro do cólon LOVO, SW480, HCT116 e HT29, e células HEK-293T de rim embrionário humano foram obtidas da American Tissue Culture Collection (ATCC). Humana de fibroblastos embrionárias de pulmão MRC-5, linha de células de câncer gástrico SGC7901, ea linha de células de cancro hepático BEL7402 foram adquiridos a partir do celular Resource Center, da Academia Chinesa de Ciências Médicas (Beijing). As células normais humanas epiteliais brônquicas (HBEpiC) foram adquiridos a ScienCell (ScienCell Research Laboratories, San Diego, Califórnia). O 293T, A549, BEL7402, HeLa, MCF-7, SGC7901 e as células brônquicas humanas normais epiteliais BEAS-2B [29] As células foram cultivadas em Dulbecco modificado por meio Eagle (DMEM) contendo soro fetal bovino a 10% (FBS; Gibco /BRL , Grand Island, NY), 100 U /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina. LOVO, SW480, as células HCT116 e HT29 foram cultivadas em DMEM /F12 suplementado com 10% de FBS, 100 U /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina. células MRC-5 foram cultivadas em meio MEM /EBSS suplementado com ácidos aminados não essenciais, 10% de FBS, 100 U /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina. HBEpiC células foram cultivadas num meio de células epiteliais brônquicas isento de soro (ScienCell Research Laboratories) contendo suplemento de crescimento de célula epitelial brônquica (ScienCell Research Laboratories). Os plasmídeos pQCXIP-GFP-LC3 e pQCXIP-GFP [30] foram usados ​​para transfectar células LOVO usando o Lipofectamine 2000 (Qiagen) de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante.

A viabilidade celular, a proliferação celular e ensaios clonogénicos

As células cancerosas (5 × 10

3) foram semeadas em cada poço de placas de 96 poços de cultura de tecidos (copos, Charlotte, NC) e tratou-se com miméticos acetogenina annonaceous durante 48 h a 37 ° C numa 5% de CO

2 atmosfera. ensaio de MTT foi realizado como descrito [31], e o IC

50 valores foram calculados usando o software CalcuSyn (versão 2.0, Biosoft, Cambridge, Reino Unido). A viabilidade celular foi estimada por exclusão do corante azul tripano. O potencial sinérgico, aditivo ou efeito antagônico entre AA005 e 2-DG ou cisplatina foi cuidadosamente avaliada usando o Software CalcuSyn (Biosoft, Cambridge, UK) como descrito [32]. As curvas dose-efeito do tratamento medicamentoso simples ou combinados foram analisadas pelo método do efeito mediano [33], onde os índices de combinação (CI) inferior a, igual a, e maior do que 1 indicam, aditivos e efeitos antagónicos sinérgicos, respectivamente .

Para a formação de focos, HT29, LaVO ou HCT116 tratado com AA005 foram semeadas em triplicado em placas de 35 mm (200 células por placa). Após 8 dias de cultura, as células foram coradas com Giemsa e os clones contendo mais de 50 células foram contadas [29].

Análise do ciclo celular e apoptose

Para detectar a distribuição do ciclo celular, cólon as células cancerosas foram sincronizadas para G1 /S fronteira por um bloco duplo de timidina [31] e, em seguida, expostos a AA005 nas concentrações indicadas, durante 24 h. As células foram colhidas, fixadas com etanol frio a 70% em 4 ° C durante a noite. As células foram centrifugadas e lavadas com PBS, seguido de incubação com RNase e iodeto de propídio (PI) (Sigma-Aldrich). a distribuição do ciclo celular foi analisada por citometria de fluxo (BD FACS Vantage diva, EUA). apoptose celular foi medida utilizando o kit PE anexina V /PI Detecção de apoptose (BD Biosciences, San Jose, CA) de acordo com as instruções do fabricante.

Análise de células com GFP-LC3 Vesículas

As células foram transfectadas com pQCX-IP-GFP-LC3 e pQCX-ip-GFP expressando plasmídeos, durante 24 h, e depois tratou-se com várias concentrações de AA005 durante mais 24 h. As células foram fixadas com paraformaldeído a 4% /PBS durante 15 min à temperatura ambiente e analisadas utilizando microscopia confocal a 63 × ampliação. A percentagem de células positivas para GFP vesículas foi avaliada [30].

medida de potencial mitocondrial transmembranar teor de ATP e NAD

+ /NADH Rácio

As células foram tratadas com diferentes concentrações de miméticos acetogenina annonaceous por 24 h. O potencial transmembranar mitocondrial foi examinada como descrito [34], teor de ATP foi medida utilizando um ATP bioluminescência Assay Kit (Beyotime Instituto de Biotecnologia), e proporção de NAD

+ /NADH foi medido utilizando Amplite ™ Colorimétrico NAD /NADH Assay Kit ( AAT BioQUEST, Inc., Sunnyvale, CA) de acordo com as instruções do fabricante.

Análises Microscopia confocal

as células foram cultivadas sobre lamelas e fixados em paraformaldeído a 4%. Após uma breve lavagem em PBS suplementado com 100 mM de glicina, as lâminas foram bloqueadas com albumina 5% de soro de bovino (BSA; Sigma) e 0,3% de Triton X-100 em PBS durante 30 min à temperatura ambiente, e corou-se para microscopia de fluorescência, tal como descrito [ ,,,0],31]. As células em cima AA005-gripe foram examinados por utilização de um microscópio Zeiss LSM 510 META equipado com uma objectiva de imersão em óleo 63 ×. processamento e análise de imagens foram feitas com a versão Zeiss LSM 510 software 3.2, ImageJ Versão 1.42 (National Institutes of Health), e Adobe Photoshop Versão 7.0 (Adobe Systems).

Western Blotting

Os sedimentos celulares foram lisadas em tampão RIPA contendo Tris-HCl 50 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, 0,1% de SDS, 1% de desoxicolato, 1% Triton X-100, EDTA 1 mM, NaF 5 mM, vanadato de sódio 1 mM, e inibidores de protease ( Sigma). As células foram lisadas em gelo durante 30 min em tampão RIPA, os lisados ​​foram centrifugados, extractos de proteínas foram quantificadas e carregada em 10% de gel de poliacrilamida de sulfato de dodecilo de sódio a 15%, a electroforese e transferidas para uma membrana de nitrocelulose (Whatman). A membrana foi incubada com o anticorpo primário, lavadas, e incubadas com peroxidase de rábano (HRP) -conjugated anticorpo secundário. A detecção foi realizada utilizando um kit de quimioluminescência ocidental detecção (Cell Signaling Technology) [35].

Análise estatística

Todas as experiências foram repetidas pelo menos três vezes e os dados são apresentados como a média ± SD, a menos que indicado de outra maneira. Diferenças entre grupos de dados foram avaliadas para significância usando Student

t

-teste de dados desemparelhados ou one-way análise de variância e Bonferroni pós-teste.

valores P Art 0,05 foram considerados estatisticamente significativos

Resultados

atividade estrutura de relacionamento (SAR) Análise de Annonaceous acetogenina miméticos

A Annonaceous série acetogenina miméticos. tinha sido sintetizado por substituição de ambos tetrahidrofurano (THF) anéis de bullatacin natural com uma unidade de éter dietileno glicol simples por parte do grupo de química da nossa equipa [25] – [28]. Nove novos análogos foram sintetizados neste trabalho, e verificou-se que o miméticos AA005 [25] e AA093, um composto com a introdução de um grupo 10-hidroxi para AA005, representado os dois compostos que tinham os valores mais baixos de CI50 neste contexto ( Tabela 1). A observação de que AA090 e AA091 composto falta a unidade lactona direita e à esquerda da cauda 11-carbono exibiu uma 17 a 170 vezes menor citotoxicidade em células cancerosas sugeriu que estes grupos são essenciais para a citotoxicidade de AA005. AA101 com uma unidade de lactona adicional incorporado na cadeia de hidrocarboneto parte esquerda exibiu uma 23-142 vezes menor citotoxicidade em células de cancro, o que confirma adicionalmente a importância da cauda hidrófoba longa e a lactona terminal direito no mimetismo. A adição de uma unidade de éter do meio para os miméticos (compostos AA102-105) ligeiramente reforçado a sua actividade anti-proliferativa, em comparação com AA101, sugerindo que uma unidade de dietileno-glicol éter é essencial para a actividade anti-proliferativa. A actividade biológica diversa destes miméticos indica que os análogos estruturais podem não ser análogos funcionais.

efeitos inibitórios de AA005 sobre as células cancerosas

Porque AA005 foi o agente citotóxico mais potente entre estes miméticos, nós testado ainda mais os seus efeitos em 11 linhas de células cancerosas humanas e 4 linhas de células não cancerosas (HBEpiC, MRC5, HLF e 293T), e descobriu que AA005 mostrou efeitos diversos sobre as células cancerosas em que teve efeito inibidor potente sobre dois pontos (HCT116, HT29, LaVO e SW480), gástrica (SGC7901), hepática (BEL7402), pulmão (A549) e mama (MCF7) linhas de câncer, e fraco efeito sobre as células cancerosas cervicais (HeLa) (Figura 1A). AA005 exibiu efeitos inibidores sobre HCT116 (Figura 1B), HT29 (Figura 1C) e células LOVO (Figura 1D) de uma dose e forma dependente do tempo. Curiosamente, AA005 apresentaram uma actividade ainda mais fraca contra células não cancerosos (HBEpiC, MRC5, HLF, BEAS-2B e 293T) (Figura 1A e Tabela 1). Estes resultados indicam que os efeitos inibidores selectivos relativas de AA005 sobre células cancerosas garante mais investigação.

(A) IC

50 valores de AA005 (em 48 horas) para vários cancros humanos e linhas celulares não cancerosas. IC

50 valores (média ± DP, ^ M) foram calculados a partir de 3 experiências independentes. (B a D) ensaios MTT de HCT116 (B), HT29 (C) e LaVO (D) células em cima AA005 em pontos de concentração e hora indicadas.

AA005 suprime a proliferação celular e Formadoras de Colônias Atividade de as células do cancro do cólon

Foram analisados ​​ainda os efeitos da AA005 em células cancerígenas do cólon. Ao utilizar a exclusão com azul de tripano análises, que mostrou que o tratamento com AA005 a 50 a 200 nm durante 24 a 48 h marcadamente inibiu a proliferação de HT29, LOVO e HCT116, mas não HBEpiC ou células BEAS-2B (Figura 2, A e B) . ensaio de formação de focos mostrou efeitos inibidores potentes da actividade AA005 na colónia de células cancerígenas do cólon (Figura 2C) formando. Foram analisados ​​os efeitos de AA005 no ciclo celular e descobriram que AA005 causou um aumento substancial na percentagem de células de cancro do cólon em fase G1 numa forma dependente da dose (Figura 2D).

(A, B) Indicado As células foram tratadas com ou sem AA005 durante 48 h ou pontos de tempo indicados, e analisada por ensaio de exclusão de azul de tripano. ensaio de formação de (C) para a actividade Colony clonogénico de células cancerígenas do cólon tratadas com ou sem AA005. (D) As células do cancro do cólon foram tratados com AA005 nas concentrações indicadas, durante 24 h. distribuição do ciclo celular foi determinada por citometria de fluxo.

Metas AA005 mitocôndrias, esgota ATP e ativa AMPK em células cancerígenas do cólon

AA005 fluoresceína marcado (AA005-gripe, Figura 3A) foi realizada com sucesso por um protocolo auxiliado por avaliação da atividade biológica depois de examinar um número de posições possíveis derivados em paralelo [36]. AA005-gripe exibia selectividade celular similar à sua molécula parental, e acumulam-se nas mitocôndrias de cancro hepático, mas não as células normais [36]. Usando imunofluorescência análise de microscopia confocal, demonstramos que AA005-flu poderia co-localizar com mitocôndrias em HT29, HCT116 e células LOVO (Figura 3B). No entanto, o sinal de AA005-gripe era muito fraco em mitocôndrias de células HBEpiC ou 293T (Figura 3B). Enquanto AA005-gripe inibiu a proliferação de LOVO, HT29 e células HCT-116 de uma forma dependente da dose, o seu efeito citotóxico sobre HBEpiC foi fraca (Figura 3C). Além disso, informou que AA005 poderia aumentar Rodamina frações 123-negativos em HT29 e LaVO mas não células HBEpiC (Figura 3D). Estes resultados sugerem que AA005 pode moléculas alvo mitocondrial e, portanto, perturbar caminho energético das células cancerosas.

(A) Estrutura química de AA005-fluoresceína. (B) A localização intracelular de AA005. As células foram co-incubadas com AA005-gripe a 100 nM durante 12 h, e analisadas por microscopia confocal utilizando uma MitoTracker (vermelho) a contra-coloração mitocôndrias. (C) Ensaio de MTT de LOVO, HT29, HCT116 e células HBEpiC sobre AA005-gripe em concentrações indicadas, durante 48 h. (D) AA005 diminui o potencial transmembranar mitocondrial de células cancerígenas do cólon revelados pelo aumento de células Rodamina 123-negativas. As células foram tratadas com AA005 na concentração indicada durante 24 h e analisadas por coloração com rodamina 123 e citometria de fluxo. (E) As células foram tratadas com ou sem AA005 na concentração indicada durante 24 h, NAD + /NADH

foi medida utilizando um AmpliteTM Colorimétrico NAD /NADH Assay Kit. (F) As células foram tratadas com ou sem AA005 na concentração indicada durante 24 h, e teor de ATP foi medida utilizando um Kit de Ensaio de ATP bioluminescência. (G) As células foram tratadas com AA005 em pontos de concentração e de tempo indicados, lisadas, e a análise Western blot foi efectuada utilizando anticorpos indicados.

mitocôndrias segmentação agentes (mitocans) são propensos a perturbar via de fosforilação de oxidação e reduzir NAD

+ /NADH, resultando na inibição da produção e activação de AMPK ATP que é reflectida pela fosforilação e a inactivação de acetil-CoA Carboxilase (ACC) (Ser79), que é um indicador para a actividade da AMPK [37]. Testou-se o efeito de AA005 em celular NAD

+ rácio /NADH e teor de ATP, e descobriram que, em células HT29 e LOVO, o tratamento com AA005 de 50 a 200 nM durante 24 h reduzida NAD

+ /NADH ( Figura 3E) e empobrecido de ATP de um modo dependente da dose (Figura 3F), enquanto que, curiosamente, AA005 não pode diminuir significativamente NAD

+ rácio /NADH e teor de ATP em células HBEpiC (Figura 3E e F). Além disso, AA005 acentuadamente regulada para cima P-AMPK e p-ACC em uma dose e forma dependente do tempo (Figura 3G). No entanto, estes fenómenos não foram observadas em células HBEpiC (Figura 3G).

mostrou que AA005, bem como os mitocans AICAR e rotenona causada depleção de ATP em células HT29 e LOVO, enquanto inibidores da AMPK composto C e inosina atenuada este efeito (Figura 4A). AA005, AICAR e rotenona-regulada P-AMPK e p-ACC, enquanto o composto C e inosina reduzida AA005-desencadeada a sobre-regulação de as duas moléculas (Figura 4B). Além disso, enquanto AA005 inibiu a proliferação de células HT29 e LOVO, o composto C e inosina reduzido este efeito (Figura 4C). Estes resultados sugerem que a activação da AMPK é necessário para a citotoxicidade induzida por AA005 de células cancerígenas do cólon.

As células indicadas (A) foram tratados ou só com combinatória AA005 (100 nM), a AICAR (AA, 1 mM), retenone (1? M), o composto C (CC, 10 uM), ou inosina (20 mM) durante 24 h, e teor de ATP foi medida. (B) As células LOVO HT29 e foram tratados com o protocolo indicado, lisadas, e transferência de Western foi realizada utilizando os anticorpos indicados. (C) HT29 e células LOVO foram tratadas com diferentes regimes de tratamento durante 48 h, e a viabilidade celular foi detectada por ensaio MTT.

induzida por AA005 medeia a AMPK Activation mTOR Complexo 1 Inibição (mTORC1) in vitro

AMPK activado fosforila TSC2 na Thr-1227 e Ser-1345 e aumenta a actividade de TSC1-TSC2 para inibir complexo mTOR [12]. Foram testados os efeitos de AA005 em mTORC1, e relataram que AA005 diminuiu p-mTOR e p-S6K (p85 e p70 S6K) em LOVO e HT29 mas não células HBEpiC (Figura 3G). AICAR e rotenona também sub-regulada P-mTOR em HT29 e células LOVO (Figura 4B). No entanto, induzida por p-AA005 de mTOR sub-regulação pode ser parcialmente reprimido por inosina e composto C (Figura 4B). Composto C e inosina também ciclina D1 parcialmente atenuada para baixo-regulação causada por AA005 (Figura 4B).

AMPK /mTOR sinalização está envolvido em AA005 Induced Autophagy in vitro

ativação da AMPK pode induzir autofagia via inibição de mTOR (49). Testou-se se poderia induzir AA005 autofagia em células de cancro do cólon ou não através da detecção das alterações de forma citosólica (LC3-I) e a forma lipidada (LC3-II) da LC3 autofagia marcador. Curiosamente, verificou-se que AA005 induziu acumulação de LC3-II em células LOVO num tempo e dependente da dose da forma (Figura 5A). O plasmídeo pQCXIP-GFP-LC3 foi transfectado em células LOVO, que foram em seguida tratados com AA005 a 100 nM durante 24 h, seguido por avaliação microscopia confocal. Mostrámos que, enquanto as células de controlo apresentaram uma coloração difusa, células LOVO sobre AA005 rapamicina ou mTOR inibidor (100 nM) exibiu um padrão de coloração fluorescente salpicado, indicando a redistribuição de LC3 para autofagossomas (Figura 5B). Curiosamente, inosina atenuada formação de autofagossomas LC3 (Figura 5B) e acumulação de LC3-II (Figura 5C) AA005-causado. Estes resultados indicam que induz AA005 autofagia de células cancerígenas do cólon através de via de sinalização AMPK /mTOR. No entanto, o tratamento com AA005 a 50-200 nM durante 24 h ou 100 nM para 12-48 h não resultou em apoptose marcada de células LOVO, reflectido através de coloração de anexina V /PI e citometria de fluxo de avaliação (Figura 5D) ou análise de mancha de Western de clivagem de PARP, um substrato de activado casp-3 (Figura 5E).

(a) análise de imunotransferência de níveis LC3-II LC3-I e em células LOVO tratados com AA005. células (B) LOVO transfectadas com pQCXIP-GFP ou plasmídeo pQCXIP-GFP-LC3 foram tratadas durante 24 h com AA005 (100 nM) e /ou inosina (20 mM), e rapamicina (100 nM), e avaliada por análises de imunofluorescência. (C) Células LOVO foram tratados com os protocolos indicados, lisadas, e ensaio Western blot foi efectuada utilizando anticorpos indicados. (D) As células foram tratadas com LOVO AA005 ou cisplatina (20 uM) durante 24 h, ou AA005 a 100 nM para os pontos de tempo indicados. As células foram então analisadas pela coloração de anexina V /PI e citometria de fluxo. (E) análises de Western blot de lisados ​​de células LOVO tratados com AA005 ou cisplatina (20 mm para 24 h).

AA005 synergizes com 2-Desoxiglucose e cisplatina na inibição da proliferação de células cancerígenas do cólon por uma modificação do AMPK e mTOR

2 desoxiglucose (2-DG) é um análogo sintético da glicose capaz de inibir a glicólise e a produção de ATP [38]. Foram testados os efeitos combinados de AA005 e 2-DG em células LOVO, e descobriram que o uso combinado dos dois agentes exercida sinergismo na inibição da proliferação das células (Figura 6A e B) e a supressão da geração de ATP (Figura 6C). AA005 em combinação com 2-DG levou a uma maior regulação positiva de p-AMPK e p-ACC, e a sub-regulação de p-mTOR e CDK4 (Figura 6D).

(B, A) As células LOVO foram tratados protocolos indicados durante 48 h, analisados ​​pelo ensaio de MTT (a), e os efeitos combinados foram avaliadas pelo método de Chou-Talay e software CalcuSyn (B). Os índices de combinação (CI) menor que, igual a, e superiores a 1 indicam, aditivo, e efeitos antagónicos sinérgicos, respectivamente. (C) Células LOVO foram tratadas com 50 nM de AA005 e /ou 5 mM de 2-DG durante 24 h, e teor de ATP foi avaliada tal como descrito acima. (D) as análises Western blot de lisados ​​de células tratados com LOVO AA005 e /ou 2-DG usando anticorpos indicados. Células LOVO (E, F) foram tratados protocolos indicados durante 48 h, analisados ​​pelo ensaio de MTT (E), e os efeitos combinados foram avaliadas pelo método de Chou-Talay e software CalcuSyn (F). (L) análises de Western blot de lisados ​​de células tratados com LOVO AA005 ou /e cisplatina utilizando anticorpos indicados. Células LOVO (H) foram tratados com AA005 e /ou cisplatina, e analisadas por coloração com anexina V /PI e citometria de fluxo. (I) As células foram tratadas com AA005 e /ou cisplatina durante 24 h, e teor de ATP foi medida utilizando um Kit de Ensaio de ATP bioluminescência. (J) As células foram tratadas com LOVO AA005 e /ou cisplatina durante 24 h, e a distribuição do ciclo celular foi determinada por citometria de fluxo.

quimioterapêutico agente cisplatina pode sobre-regular a via de sobrevivência de mTOR, que confere resistência à droga para câncer de células [39]. Mostrámos que, enquanto a cisplatina e AA005 causou efeito inibidor sinérgico sobre a proliferação de células LOVO (Figura 6E e F), AA005 cisplatina diminuiu-desencadeada a sobre-regulação de mTOR e S6K (Figura 6G). uso combinado de AA005 e cisplatina levou a efeito apoptótica aumentada em células LOVO, refletida pela coloração de anexina V /PI e citometria de fluxo de avaliação (Figura 6H) ou análise de Western blot da clivagem de PARP (Figura 6G). No entanto, a combinação destes dois agentes não causar sinergia na depleção do teor de ATP (Figura 6E), paragem do ciclo celular (Figura 6J), ou autofagia (reflectido pela expressão LC3-II, A Figura 6G) em células LOVO.

Discussão

ACETOGENINA representam uma série de C-35 /C-37 produtos naturais com THF hidroxilado e as estruturas de anéis γ-lactona [25], [26], [28]. Muitos membros desta atividade citotóxica exibição família por perturbação da etapa de transferência de elétrons terminal no complexo I da mitocôndria [40]. AA005 é um mimético de acetogenina Annonaceous em que ambos os anéis de THF são substituídos por uma unidade de etileno-glicol éter. AA005 mantém as funcionalidades essenciais das acetogeninas naturais e mostra mais potente atividade biológica [41]. Neste estudo, que relatam que AA005 é capaz de ativar a AMPK e mTOR inibe, portanto, prende ciclo celular na fase G1 e induz autofagia de células cancerígenas do cólon. AA005 sinergias com inibidor da glicólise 2-DG para bloqueio geração de ATP marcado, e antagoniza a cisplatina induzida por sobre-regulação de p-mTOR, que conduz à inibição da proliferação e indução de apoptose aumentada em células cancerígenas do cólon. Estes resultados indicam que AA005 carrega potenciais terapêuticos, pelo menos neste tipo de neoplasia maligna

Segmentação metabolismo das células de câncer, especialmente a inibição da glicólise, emergiu como uma nova estratégia promissora para combater o câncer [42] – [44].. Mitocôndria não só gerenciar a geração de energia através de ciclo de ácido cítrico (ciclo de ácido tricarboxylic, ciclo TCA), mas também desempenham um papel fundamental na regulação da apoptose através da liberação de citocromo C. Embora não tem muito debate sobre se as mitocôndrias têm defeitos na via de fosforilação oxidativa, ele poderia ser um alvo potencial para a terapia do cancro [42], [45]. Alguns mitocans tais como análogos metaformin e vitamina E que inibem o complexo I e II apresentam actividade selectiva e eficaz anti-cancro. Estes agentes induzir a morte de células cancerosas através da geração de superóxido e desestabilização mitocondrial [46]. ATP também pode ser empobrecido em certa medida mediante tratamento de mitocans [42], [45]. As mitocôndrias complexo I tem sido mostrado para ser alvejado por acetogenina Annonaceous [40]. Relatamos AA005 que podem co-localizam com mitocôndrias em cancro do cólon, mas não HBEpiC ou células 293T (Figura 3A), sugerindo que AA005 pode reduzir NAD

+ rácio /NADH e a produção de ATP em células cancerosas. Esta possibilidade é confirmada em LOVO, HT29 e células HCT116 (Figura 3C). No entanto, por mitocôndrias nas células cancerosas são mais propensas a ser alvo de AA005 permanece uma questão em aberto. A inibição da mitocôndria por metaformin e rotenona pode levar à activação da AMPK [42]. Mostramos que AA005 também podem suprimir a mitocôndria e ativar a AMPK (Figura 3).