Abstract

Os adenovírus são altamente imunogênica e estão sendo examinados como potenciais vetores na imunoterapia. A infecção por adenovírus oncolítico é seguido por autofagia massiva em células cancerosas. Aqui, nós supomos que a autofagia regula o processamento de proteínas adenovirais pela apresentação de antígenos. Para testar esta hipótese, examinamos primeiro a apresentação de antigénios virais pelas células infectadas, utilizando um cocktail de anticorpos de proteínas da cápside viral. Descobrimos que antígenos virais foram processados ​​por autofagia mediada por JNK, e que a autofagia foi necessário para a sua apresentação. Consistente com estes resultados, os esplenócitos isolados a partir de ratinhos imunizados com vírus foram activados por células infectadas de um modo dependente de MHC II. Em seguida, a hipótese de que este mecanismo pode ser utilizado para gerar uma vacina contra o cancro eficaz. Para este fim, construímos um vírus oncolítico abrangendo um epitopo específico do cancro EGFRvIII na fibra de adenovírus. A infecção de células cancerosas com este adenovírus modificado com fibra resultou no reconhecimento de células cancerosas infectados por um anticorpo anti-EGFRvIII específico. No entanto, a inibição da autofagia diminuiu drasticamente a capacidade do anticorpo específico para a detecção do epitopo relacionada com o cancro em células infectadas. Nossos dados sugerem que a combinação de adenovírus com indutores autofagia pode aumentar o processamento e apresentação de antígenos específicos do cancro incorporados nas proteínas do capsídeo

Citation:. Klein SR, Jiang H, Hossain MB, Fan X, Gumin J, Dong Um, et ai. (2016) papel crítico da autofagia no processamento de Adenovirus Capsid-Incorporated Antígenos Cancer-específicas. PLoS ONE 11 (4): e0153814. doi: 10.1371 /journal.pone.0153814

editor: Maria G. Castro, da Universidade de Michigan School of Medicine, Estados Unidos

Recebido: 25 Janeiro, 2016; Aceito: 04 de abril de 2016; Publicação: 19 de abril de 2016

Direitos de autor: © 2016 Klein et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi financiado por doações do NIH (P50CA127001; R01NS069964; Cancer Support Center Grant P30CA016672-sequenciação e facilidade de Microarray e investigação animal suporte), o Rose Foundation Marnie, a Fundação Will Power, a Fundação Schissler, ea Legião americana auxiliar. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. JF, CG-M, e HJ tem a propriedade intelectual sobre Delta-24-RGD , licenciado para DNAtrix, Inc. (patente depositado US 14 /148.259; infecciosidade-enhanced adenovírus condicionalmente-replicativo e usos dos mesmos). J. F. e C.G-H. são fundadores e consultor de DNATrix, Inc. Isso não altera a adesão dos autores para PLOS ONE políticas de dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

adenovírus Oncolíticos, como Δ24-RGD (Delta -24-RGD), [1, 2] são altamente imunogénicas. [3] a hipótese corrente para explicar o mecanismo anti-tumoral em pacientes tratados com adenovírus oncolíticos é que o principal efeito é conseguido através do gatilho de uma resposta imunitária anti-tumoral. [4 ] autophagy é uma característica reconhecida de células infectadas com adenovírus [5, 6] e é um componente importante do processo de lise. [7] Xenophagy [8] e derivados do agente patogénico processamento do antigénio [9, 10] são funções fundamentais da autofagia em as células infectadas com o vírus. Autophagy degrada conteúdo intracelular, o processamento de epitopos de ser carregado numa complexo principal de histocompatibilidade (MHC) para apresentação na superfície de células imunitárias. [9-11] No entanto, o modo pelo qual as células cancerosas processar antigénios derivados de adenovírus é actualmente desconhecido.

a modulação da autofagia em células de mamíferos é melhor descrito em células que sofrem de inanição. [12-14] Além da via canonical, [12-14], a c-Jun N-terminal quinase (JNK) de transdução de sinal via é activada em células que sofrem autofagia. [15] por outro lado, a activação de JNK foi observada em células infectadas com vírus. [16] Apesar do papel claro que JNK desempenha na regulação das respostas imunológicas inata e adaptativa, [17], incluindo a capacidade para potenciar a resposta imunitária aos agentes patogénicos virais por cima-regulação da expressão de citoquinas pró-inflamatórias, [18-20], a função directa da JNK no processamento de antigénios derivados de agentes patogénicos e a apresentação não foi ainda definido.

temos relataram recentemente que a expressão de JNK e a activação por phoshporylation é necessária para a indução de autofagia produtiva em células infectadas com adenovírus. [16] neste estudo, verificou-se que as proteínas estruturais adenovirais interagir com as proteínas do receptor de carga autofagia levando a sua degradação nos autophagolysosomes . Autophagy parece ser essencial para os antigénios derivados de adenovírus de apresentação, porque a inactivação da JNK regulador autofagia ou inactivação directa da autofagia drasticamente limitada ao reconhecimento de células infectadas com cancerosas por células imunitárias activadas e anticorpos contra a cápside ou epitopos ectópicas específicos de cancro codificados pela fibra de adenovírus.

material e Métodos

cultura celular

U87 MG glioma, cancro cervical HeLa, e linhas celulares de cancro do pulmão A549 foram todos obtidos a partir de ATCC. As células HeLa foram cultivadas em DMEM (1X), e as células A549 foram cultivadas em DMEM /F-12 50:50 médio (Invitrogen). células de U87 MG (ATCC) foram cultivadas em MEM com FBS a 10% e de aminoácidos essenciais a 1%. Do tipo selvagem e

JNK1 /2 – /-

fibroblastos de embrião de ratinho (MEFs) foram fornecidos por Roger Davis (University of Massachusetts Medical School, MA). Do tipo selvagem e knock-out Atg5 MEFs (

Atg5 – /-

) são uma generosa doação de Noboru Mizushima (Tokyo Medical and Dental University, Tóquio, Japão). Do tipo selvagem e MEFs knock-out p62 (

p62 – /-)

foram uma generosa doação de Jorge Moscat (Instituto de Pesquisa Médica Sanford-Burnham, La Jolla, CA). MEFs foram cultivadas em DMEM /F12 50:50 médio. As células foram cultivadas com 10% de FBS a 37 ° C em 5% de CO

2 no ar.

de produtos químicos e anticorpos

O SP600125 inibidor de cinase de JNK e bafilomicina A1 foram adquiridos da Sigma- Aldrich, St Louis, MO, EUA). A rapamicina foi comprada a Calbiochem (San Diego, CA, EUA). Interferão gama recombinante de proteína humana (IFN-γ) foi adquirido a partir de Prospec (East Brusnwick, NJ, EUA). Os anticorpos para a LC3, beclin 1, e ubiquitina foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technologies (Beverly, MA, EUA). Anti-p62 e anti-actina foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, Texas, EUA). fibra anti-adenoviral foi obtido a partir de ThermoScientific (Waltham, MA, EUA). EGFRvIII foi detectado com um anticorpo monoclonal (L8A4) obtido como uma oferta generosa do Dr. Bigner (Duke University, NC, EUA). Aloficocianina (APC) -conjugated anticorpos secundários anti-ratinho e de isotiocianato de fluoresceína (FITC) -conjugated anticorpo secundário foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology.

produção e infecção adenoviral

adenovírus

e Δ24RGD AdWT foram produzidos tal como descrito anteriormente. [1] Δ24FvIII foi construído por inserção do epitopo EGFRvIII (LEEKKGNYVVT) [21] para o circuito de HI de proteína de fibra de entre os aminoácidos 543 e 544. [22] em primeiro lugar, a sequência de codificação para o epitopo EGFRvIII foi incorporada o gene da fibra no vetor PXK-F contendo o

Xba

I-

Kpn

Eu fragmento do pVK503C [23] através de mutagénese dirigida ao local. Em seguida, o fragmento XbaI-KpnI do vector resultante PXK-FVIII foi co-transduzido com o

Swa I-

linearizado pVK500C.delta-24 em

E

.

coli BJ5183 por recombinação homóloga, como descrito anteriormente. [24] O vírus resgatado foi, em seguida, em células 293 e propagados em células A549, conforme descrito anteriormente [24]. Os adenovírus foram adicionados ao meio de cultura celular na multiplicidade indicada de infecção (MOI).

análise Western blot

As células foram lisadas com tampão de lise RIPA. As concentrações de proteína foram determinadas com a utilização de um ensaio de proteína Bio-Rad. As amostras de proteína (25 ug) em tampão de carga de SDS 1X foram fervidas e carregadas em géis de Tris-glicina de sódio dodecil sulfato de electroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). As amostras foram separadas utilizando electroforese. Os géis foram então transferidos para membranas de fluoreto de polivinilideno, os quais foram bloqueados usando leite não gordo a 5% em 1X TBS-T (0,025% de Tween) durante 1 h à temperatura ambiente e, em seguida, incubadas durante a noite a 4 ° C em anticorpo primário em apropriado diluições. As membranas foram lavadas três vezes com TBS-T (Tween a 0,05%) e, em seguida, incubadas à temperatura ambiente durante 1 h com anticorpos secundários adequados (Santa Cruz Biotechnology, 1: 4000), preparado no leite não gordo a 1% em TBS-T. SuperSignal Oeste Femto substrato quimioluminescente (ThermoScientific) e cinema autoradiografia HyBlot CL (Denville Scientific Inc., South Plainfield, NJ, EUA) foram usados ​​para visualizar as bandas de proteína.

RNA de interferência

de tipo selvagem células MEF foram semeadas em placas de 6 poços 24 h antes do pequeno-ARN interferente (siRNA) transfecção. INTERFERin (Polyplus Transfecção (Illkirch-Graffenstaden, França) foi utilizada para inserir os ARNic em células de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, 50 oligonucleótidos nM de ARNsi foram combinados com 10 mL de reagente de transfecção e adicionou-se as células após 15 min de incubação a temperatura ambiente. oligonucleotídeos siRNA para rato MHC classe I, classe II do MHC, e as regiões não codificantes foram adquiridos de Santa Cruz Biotechnology.

Co-imunoprecipitação

As células foram infectadas com AdWT ou Δ24RGD para até 48 h. flutuante e as células ligadas foram recolhidas e lisadas com imunoprecipitação (IP) de tampão de lise (NaCl 100 mM, Tris-HCl 50 [pH 7,4], EDTA 2 mM, 10% de glicerol, 1% de Igepal CA-630) . as amostras de proteína foram pré-limpo com G esferas de agarose com proteína a e proteínas de anticorpos de fibras ou anti-p62 anti-adenovirais foram adicionados aos lisados ​​a uma diluição de 1:. 100, e complexos de proteínas foram imobilizadas com a proteína a e proteínas L (1: 1). esferas de agarose de amostras imunoprecipitadas, grânulos pré-limpa, e 5% de entrada foram analisados ​​por transferência de Western. anticorpo secundário de detecção de IP foi usado para detectar proteínas ligadas por todos os IgGs primários anti-coelho e anti-rato.

A citometria de fluxo

As células foram tratadas para os respectivos pontos de tempo, tripsinizadas e recolhidas em solução salina tamponada com fosfato (PBS) com 1% de albumina de soro bovino (BSA). As células foram tratadas quando indicado com IFN-γ (300 unidades /ml) e bafilomicina A1 (Sigma-Aldrich). As células vivas foram coradas para antigénios adenovirais utilizando uma combinação de anti-adenovírus (mistura) de revestimento de ratinho (1:75; Millipore, Billerica, MA, EUA) e anticorpos de ratinho anti-fibra de adenovírus (1:75; ThermoScientific) durante 30 min a 4 ° C. Depois as células foram lavadas, que foram corados com anticorpos de APC-anti-ratinho conjugada secundárias (1,75; Santa Cruz Biotechnology) durante 30 min a 4 ° C. Para a detecção do epitopo EGFRvIII (LEEKKGNYVVT), as células foram coradas com um anticorpo monoclonal (L8A4) seguido por coloração com anticorpo secundário conjugado com FITC. As células vivas foram analisadas com o uso de um BD FACSCalibur (Becton-Dickenson, Franklin Lakes, Nova Iorque, EUA). As células mortas foram excluídos usando iodeto de propídio ou homodímero de etídio-1 coloração, antes da análise. Os dados representam pelo menos quatro experiências independentes.

activação esplen�ito

Todos os estudos com animais foram realizados nas instalações de Veterinária da Universidade do Texas MD Anderson Cancer Center, em conformidade com as diretrizes institucionais e do Guia para o Cuidado e Uso de animais de Laboratório. O estudo foi aprovado pelo The Cancer Center Care Institucional Universidade MD Anderson Animal e Comitê de Uso (IACUC). Murganhos C57BL /6 (10-12 semanas de idade) foram infectados por via intracraniana com duas injecções (dias 0 e 3) de 1 × 10

8 pfu /ratinho Δ24RGD através do sistema de guia-grupo, como descritos anteriormente. [1] O os animais foram eutanizados com o uso de um co

2 câmara; Os baços foram removidos andsmashed calha 100 micrómetros coador; [25] e os esplenócitos foram lavados com PBS. Os glóbulos vermelhos foram removidos por meio de tampão de lise ACK (Lonza, Houston, TX, EUA). A de tipo selvagem e JNK MEFs knock-out foram semeadas a 1 x 10

5 as células em uma placa de 6 poços (em triplicado). As células foram infectadas com 100 MOI de Δ24RGD durante 24 h, tratadas com tripsina, e re-plaqueadas numa placa de 96 cavidades, com 5 x 10

4 culas por po em meio RPMI 1640 com 10% de FBS e 55 fiM, beta-mercaptoetanol . Os esplenócitos (1 × 10

6 células) foram incubadas com as MEFs em cultura durante 24 h. Para as experiências, incluindo anticorpos de bloqueio, as células MEF pré-infectadas foram incubadas com 2 ug de anti-ratinho de MHC de classe II (IA /IE), anti-ratinho de MHC de classe I (H-2Kd) (eBioscience, San Diego, CA), ou IgG de murganho (Santa Cruz) 2 h antes de co-cultura com os esplenócitos imunizados. Os esplenócitos foram então incubadas com as células MEF pré-infectadas e anticorpos de bloqueio durante 24 h. Um rato de IFN-γ ELISA Kit (ThermoScientific) foi usada para avaliar a concentração de IFN-γ em 50 mL de meios extraídos a partir da co-cultura. ELISA foi realizada de acordo com as instruções do fabricante, e absorção foi analisado através de um leitor de microplacas Omega (BMG Labtech, Ortenberg, Alemanha).

A análise estatística

A Student bicaudal

t

-test foi utilizado para determinar a significância estatística das amostras tratadas e as amostras infectadas em relação ao controlo. Os valores de P inferiores a 0,05 foram aceitos como estatisticamente significativo.

Resultados

autofagia mediada por JNK regula a apresentação de antígenos derivados de adenovírus

antígenos derivados de patógenos podem ser tratados no o compartimento autophagolysosomal através autofagia, [10], mas o papel da autofagia na apresentação de epitopos adenovirais ainda não foi determinada. Com a utilização de um cocktail de anticorpos anti-proteínas adenovirais, nós analisamos células infectadas quanto à presença de péptidos derivados de adenovírus na superfície de células vivas, nonpermeabilized, infectadas. Para estes estudos, tiramos vantagem do fato de que as células JNK nulo são deficientes por autofagia. [15, 16] Observou-se que enquanto que a maioria ( 77%) de

JNK wt

MEFs infectadas com AdWT expressa proteínas adenovirais na sua superfície, tal como detectado por FACS análises (Figura 1A), a genética ablação de

JNK1

e

JNK2

isoformas resultou em uma diminuição significativa na percentagem de células com teste positivo para proteínas adenovirais. Uma vez que a activação das células T, evidenciado pela síntese e secreção de IFN-γ, é o método de indicação para confirmar a apresentação de antigénio através de interacções entre as moléculas de MHC contendo epitopo e o receptor da célula T [26], que comprovou a relevância imunológica do nosso dados pela quantificação da secreção de IFN-γ por esplenócitos de ratinhos não infectados (naïve) ou ratos (activadas) tratados com adenovírus em co-cultura com

em peso de JNK

ou

JNK1 /2

– /- MEFs infectadas com adenovírus. Como esperado, a co-culturas de esplenócitos naive com infectadas com adenovírus

JNK em peso, ou

JNK1 /2

– /- células não provocou secreção significativa de IFN-γ. No entanto, MEFs de tipo selvagem infectadas com adenovírus solicitado a produção de IFN-γ quando co-cultivadas com esplenócitos sensibilizados (Figura 1B). Em contraste, as culturas de autofagia deficiente

JNK1 /2

– /- MEFs com esplenócitos preparado com adenovirus continha níveis de IFN-γ significativamente inferior segregadas (Fig 1B). Estes dados mostraram que as células deficientes autophagy são deficientes para a apresentação de antigénios derivados de adenovírus para o sistema imunológico.

(a)

em peso de JNK

e

JNK

1 /2 – /- MEFs foram falsamente infectadas ou infectadas com AdWT (MOI 100) durante 48 horas e incubadas com dois conjuntos combinados de anticorpos anti-adenovírus (uma mistura de proteínas de revestimento adenovirais e de fibra de adenovírus). Elas foram então incubadas com anticorpo secundário conjugado com APC e analisadas por citometria de fluxo. Isotipo IgG foi usada como controlo. iodeto de propidio foi utilizada para avaliar a viabilidade celular e a análise de células vivas. Os dados representam a percentagem de células positivas como média ± DP. ***

P Art 0.001 (AdWT-infectados

JNK

1/2 – /- MEFs contra AdWT-infectados

JNK peso

MEFs) (Student não emparelhado, bicaudal

t-test)

. (B) Os esplenócitos foram isolados de ingênuos e Δ24RGD infectados camundongos C57BL /6 e co-cultivadas com

JNK peso

ou

JNK

1/2 – /- MEFs que foram falsamente infectadas ou infectadas com adenovírus Δ24RGD (MOI 100) durante 24 h antes da co-cultura. Após 48 h de co-cultura, os níveis de IFN-y (pg /mL) no meio condicionado foram analisados ​​por ELISA. Os dados representam os níveis de IFN-y (pg /ml) como média ± DP de três co-culturas independentes. **

P Art 0,01 (não emparelhado, bicaudal Student

t-teste

). (C) células U87 MG foram pré-tratadas com DMSO, SP600125 (25 uM), ou bafilomicina A1 (BA1, 10 nM) 30 minutos antes da infecção com adenovírus Δ24RGD (MOI 50) durante 48 h. As células vivas foram incubadas com anticorpos criados contra as proteínas da cápside adenoviral, ou isotipo de IgG como controlo, e analisadas por citometria de fluxo. A percentagem de células APC-positivos foram quantificadas e representados como a média ± DP (

N

= 3). *

P Art 0,05 (percentagem de células positivas após o tratamento com AdWT e SP600125 vs. AdWT e BA1) (não emparelhado, bicaudal Student

t-teste

). (D) Aumento significativo na apresentação de antigénios adenovirais em células infectadas com Δ24RGD quando a rapamicina foi adicionado às culturas. células U87 MG foram falsamente infectadas, infectadas com Δ24RGD, ou infectados com Δ24RGD e rapamicina (100 nm /48 h) durante 48 horas e depois examinados para antígenos adenovirais por citometria de fluxo.

Além disso apoiar o papel de JNK e autofagia no processamento de antigénios derivados de adenovirus, observou-se que o tratamento de culturas infectadas autophagy-proficiente com inibidores da JNK (SP600125) inibidores de [27] ou de fluxo autofagia (bafilomicina A1 [28]) diminuiu significativamente a percentagem de infectados células vivas apresentam em suas proteínas adenovirais de superfície nas análises de FACS (Fig 1C). De acordo com estes dados, a experiência mostrou que o tratamento prévio de frente de células infectadas com o indutor autofagia-rapamicina [29] resultou em um aumento na percentagem de células que testaram positivo para epitopos adenovirais na triagem por FACS (Figura 1D). Combinados, todas estas observações sugerem fortemente que a autofagia pode desempenhar um papel na apresentação de antigénios derivados de agentes patogénicos em células infectadas com adenovírus.

de MHC de classe II é necessário para antigénios adenovirais

Autophagy está envolvido no processamento de péptidos para apresentação principalmente através de moléculas MHC de classe II, [10, 11], assim, decidimos para determinar se o bloqueio à base de anticorpo da classe II do MHC impediu o reconhecimento de células infectadas pelos esplenócitos preparado com adenovirus. Para este fim, quantificados a produção de IFN-γ em co-culturas de esplenócitos preparado por adenovírus com MEFs infectadas com vírus pré-incubadas com anticorpos de bloqueio para o MHC de classe I ou II. Observou-se que as células tratadas com anticorpos contra as proteínas de MHC de classe II apresentaram uma inibição significativa da produção de IFN-γ em comparação com as células tratadas com anticorpos contra as proteínas de MHC de classe I ou controlos tratados com IgG (Fig 2A). Para confirmar estes dados que desafiou a apresentação de antígenos de adenovírus usando classe siMHC específica II (Fig 2B). Observou-se que para baixo-modulação de MHC de classe II ARNm resultou na diminuição do número de células que apresentam epítopos adenovirais (Fig 2C). Indicando o papel predominante da classe II do MHC no processo, mostraram que o baixo-modulação de MHC de classe I tinha um efeito muito menor sobre a apresentação de antigénios derivados de adenovírus que fez a sub-regulação de MHC de classe II. Estes dados indicam que os antigénios derivados de adenovirus são apresentados predominantemente através de MHC de classe II, a via predominante de apresentação epitopo para as proteínas processadas através autofagia. [10, 11]

(a) wild- Mock- ou Δ24RGD-infectados digita MEFs foram pré-incubadas com anticorpos contra MHC de classe I, classe II MCH, ou isótopo IgG e depois co-cultivadas com esplenócitos obtidos a partir de ratinhos infectados por Δ24RGD. A dobra-alterações dos níveis de IFN-γ (pg /mL) no meio de co-cultura é exibida em relação ao controlo e apresentados como média ± DP. **

P Art 0,01 (não emparelhado, bicaudal Student

t-teste

). (B) células MEF de tipo selvagem foram transfectadas com uma piscina de sinc, siMHCI, siMHCII, ou combinadas quantidades iguais de siMHC I e siMHC II durante 48 h e, em seguida, infectadas com o adenovírus Δ24RGD a uma MOI de 10 durante um adicional de 48 h . lisados ​​de células inteiras foram analisados ​​usando anti-MHC de classe I e anti-MHC de classe II anticorpos. O efeito de cada tratamento sobre o siARN nível de proteína de moléculas de MHC é ilustrado. (C) MEFs de tipo selvagem foram transfectadas com uma piscina de sinc, siMHCI, siMHCII, ou combinadas quantidades iguais de siMHCI siMHCII e durante 48 horas, e, em seguida, infectadas com o adenovírus Δ24RGD a uma MOI de 10 durante mais 48 h. Em seguida, as células foram coradas para a detecção de antigénios adenovirais. Iodeto de propidio foi utilizada para avaliar a viabilidade celular. Os dados são apresentados como percentagem de células positivas (média ± DP). A diminuição na percentagem de células, siMHCII-transfectadas infectadas com adenovírus positivos em comparação com as células de Sinc-transfectadas infectadas com adenovírus foi estatisticamente significativa. **

P Art 0,01 (não pareado, de Student bicaudal

t-test)

.

proteínas estruturais adenovirais interagir com p62 e são degradados no autolysosome

Em seguida, procurou examinar se as proteínas adenovirais estruturais foram degradadas nas autophagolysosomes. Uma vez que a proteína p62 liga-se a proteínas de chaperona ubiquitinadas para a sua sequestração e degradação em autophagolysosomes, [30] analisou-se a interacção potencial entre p62 e proteína da fibra realizando experiências de co-immunoprecipitaton. Mostrámos que a proteína de fibra de adenovírus foi ubiquitinadas durante a infecção por adenovirus e interagiu com p62 (Figura 3A). Consistente com um papel da autophagolysosome na degradação da proteína de fibra de adenovírus, as interacções de proteína p62 e da fibra eram mais evidentes em

Atg5

– /- MEFs, que são deficientes para autofagia induzida por adenovírus [7] ( Figura 3A). Na verdade, o exame detalhado dos níveis da proteína da fibra em vários pontos de tempo após a infecção adenoviral revelou níveis extraordinariamente elevados destas proteínas na autofagia deficiente

Atg5 – /-

células MEFs em comparação com o tipo selvagem

Atg5

MEFs (

Atg5 peso

) infectados com quantidades iguais de adenovírus do tipo selvagem (Fig 3B). Além disso, observamos também que após a infecção adenoviral houve uma diminuição significativa na percentagem de células que apresentaram proteínas adenovirais no

Atg5 – /-

MEFs culturas em comparação com

Atg5wt

MEFs (Fig 3C ). Como esperado, resultados semelhantes foram observados com

p62 viajantes – /- MEFs infectadas com adenovírus, confirmando que a falta de

p62

expressão resultou em uma redução significativa da percentagem de células do revestimento positivo adenovirais com respeito à infectadas com adenovírus de tipo selvagem

p62

MEFs (Fig 3D), provavelmente devido ao transporte mediado por p62 deficiente de proteínas adenovirais ao autophagosome. Estes dados sugerem ainda que as proteínas adenovirais foram degradadas nas autophagolysosomes fluxo durante autophagic activa resultando na apresentação de epitopos derivados de adenovírus na superfície da célula hospedeira.

(A) Os lisados ​​celulares de

Atg5wt ou

Atg5 – /-

MEFs infectadas com AdWT (50 MOI) foram analisadas para fibra /ubiquitina e complexos de proteína /fibra de p62. níveis de conversão e de expressão de p62 LC3-I lc3-II foram analisadas numa amostra de entrada (5%). A actina é mostrado como um controlo de carga. (B) Os lisados ​​celulares de

Atg5wt

e

Atg5

– /- MEFs foram falsamente infectadas ou infectadas com AdWT (MOI 50) durante os tempos indicados e analisados ​​para a expressão fibra de adenovírus. Actina foi utilizado um controlo de carga. (C)

Atg5wt

e

Atg5 – /-

MEFs foram falsamente infectadas ou infectadas com adenovírus AdWT (MOI 50) durante 48 h e depois coradas com anticorpos para proteínas de revestimento adenovirais, incubadas com APC conjugada com o anticorpo secundário, e analisadas por citometria de fluxo. Isotipo IgG foi usada como controlo. Iodeto de propidio foi utilizada para avaliar a viabilidade celular. Os dados são apresentados como percentagem de células APC-positivo (média ± DP) de três experiências independentes. ***

P Art 0,001 (percentagem da APC-positiva em AdWT-infectados

Atg5wt

células vs. AdWT-infectados

Atg5 viajantes – /- células) Student (não emparelhado, bicaudal

t-test

). (D)

p62wt

e

p62 – /-

MEFs foram infectadas com adenovírus AdWT (100 MOI) durante 48 horas e depois coradas com anticorpos contra proteínas de revestimento de adenovírus, incubadas com APC-secundário conjugado anticorpos, e analisadas por citometria de fluxo. Isotipo IgG foi usada como controlo. Iodeto de propidio foi utilizada para avaliar a viabilidade celular. Os dados são apresentados como percentagem de células APC-positivo (média ± DP) de três experiências. ***

P Art 0,001 (cento das células APC-positivos em AdWT-infectados

p62 viajantes – /- vs. AdWT-infectados

p62wt

células) Student (não emparelhado, bicaudal

t-test

).

Geração de Δ24FvIII adenovírus

Modificação do capsids adenovirais por inserção de sequências de antigénios é uma tecnologia promissora para o desenvolvimento de vacinas e vacinas anti-câncer, [31] e, portanto, procurou-se determinar se a autofagia foi o principal mecanismo para o processamento de epitopos específicos do cancro ectópicas codificadas por fibras adenovirais. Em seguida, gerado um modelo experimental que nos permite determinar se uma sequência específica na fibra de adenovírus pode ser detectada nas células infectadas com adenovírus. Para este fim, concebidos e construídos de uma fibra de adenovirus quimérico compreendendo a sequência de um epítopo humano bem caracterizado (Figura 4A). A construção resultante foi denominado Δ24FvIII, e usado o esqueleto de adenovírus-tumoral selectiva Δ24 [32] e codificou a LEEKKGNYVVT epitopo inserido no HI-circuito da sequência de fibra de adenovírus. Este péptido é derivado a partir da sequência de junção da proteína truncada gerado na variante mutante III do EGFR mutante e tem sido mostrado previamente para ser altamente imunogénica [21] (Figura 4A).

(a) Representação esquemática da geração da fibra VIII quimérico. mutagénese baseada em PCR foi utilizada para inserir a sequência do epitopo LEEKKGNYVVT na região hipervariável do loop HI. Um local de restrição EcoRV único foi incorporada para permitir a inserção da sequência ectópica entre glicina-ácido aspártico e 543-544. (B) Expressão da fibra quimérico compreendendo o péptido LEEKKGNYVVT foi avaliada em células A549 infectadas com Δ24FvIII (MOI 40). Os lisados ​​de proteína foram sujeitos a análise de Western blot, 72 h após a infecção utilizando ambos os anticorpos anti-fibra e anticorpos anti-LEEKKGNYVVT L8A4. (C) ao vivo de tipo selvagem

Atg5

Atg5 Comprar e – anticorpos secundários MEFs foram infectados com Δ24FvIII a uma MOI de 150 por 48 horas e, em seguida coradas com L8A4, seguido por FITC conjugados – /para análises de citometria de fluxo. Homodímero de etídio-1 coloração foi utilizado para excluir as células mortas. Percentagens de células vivas FITC-positivos são indicados no canto superior direito de cada gráfico. A diminuição do número de células positivas em Δ24FvIII-infectados

Atg5

– /- em comparação com Δ24FvIII-infectadas de tipo selvagem

Atg5

células foi estatisticamente significativa. Os dados são apresentados como a média ± DP de três experiências. ***

P Art 0.001 (não emparelhado, bicaudal Student

t-teste

). (D) As células HeLa foram infectadas com Δ24FvIII a uma MOI de 40. IFN-γ (300 unidades /ml) ou /e bafilomicina A1 (BA1; 100 nM) foram adicionados ao meio de 6 h ou 24 h após a infecção, respectivamente. As células vivas foram coradas com L8A4 de 48 h após a infecção e, em seguida, incubadas com anticorpos secundários conjugados com FITC para visualizar as células positivas com um citómetro de fluxo. Homodímero de etídio-1 coloração foi utilizado para excluir as células mortas. O gráfico representa valores médios de três experiências ± desvio padrão. *

P Art 0,05; **

P Art 0,01 (não emparelhado, bicaudal Student

t-teste

).

células infectadas com F_21 “\\ o” Humphrey, 1990 # 149 “epitopo específico do cancro thEGFRvIII derivado

Usando um anticorpo altamente específico gerado contra o péptido EGFRvIII [21], documentaram que a expressão da fibra quimérico foi facilmente detectado em células Δ24FvIII-infectadas (Fig 4B). a hipótese que a sequência ectópica do humano epitopo inserido na fibra de adenovírus foi processada através de autofagia e apresentados na superfície de células infectadas Portanto, depois de tipo selvagem e deficientes em autofagia

Atg5

-. /- MEFs foram infectadas com Δ24FvIII, as superfícies de células vivas foram examinados para a presença de LEEKKGNYVVT com a utilização do anticorpo específico [21] e análises FACS. Mostramos que uma elevada percentagem de tipo selvagem

Atg5

MEFs foram positivamente identificados pelo anticorpo anti-LEEKKGNYVVT (Fig 4C .) no entanto, a percentagem de células positivas foi significativamente diminuído em autofagia deficiente

Atg5

– /- MEFs infectadas com adenovírus Δ24FvIII (Figura 4C). Dados semelhantes foram obtidos quando as células HeLa foram infectadas com adenovirus e Δ24FvIII o fluxo autofagia foi bloqueada com bafilomicina A1. Assim, a percentagem de células HeLa que apresentam o péptido LEEKKGNYVVT diminuiu dramaticamente quando as culturas infectadas foram tratadas com bafilomicina A1 (Fig 4D). Sugerindo fortemente a activação específica das máquinas de processamento de antigénio durante a infecção, a apresentação do péptido LEEKKGNYVVT aumentaram após a adição de IFN-γ, que transcricionalmente activar MHC, [33] a culturas infectadas com adenovírus Δ24FvIII (Fig 4D). Finalmente, o que demonstra ainda mais o papel da autofagia no processamento de LEEKKGNYVVT, bafilomicina A1 de pré-tratamento induziu um efeito de bloqueio que antagonizou e diminuiu significativamente a modulação positiva de apresentação de antigénio mediada por IFN-γ (Fig 4D).

Discussão

Nossos dados fornecem evidência para a primeira vez que a inibição da autofagia em células infectadas com adenovírus impede apresentação eficiente de epitopos específicos de cancro derivadas de adenovírus e de fibra incorporados. Nós também demonstraram que as proteínas adenovirais interagir com a proteína p62 do receptor de carga autofagia, sugerindo fortemente que a p62 pode desempenhar proteínas da cápside adenovirais para o autophagosome. Curiosamente, tem sido proposto p62 para trabalhar como um sensor de potencial de infecção por vírus e a ligação entre as proteínas de vírus e autofagia. [34] O facto de que p62 se liga fibra adenoviral fortemente sugerido que a autofagia foi envolvida na degradação da proteína adenoviral.