Sumário

Fundo

anfirregulina, um ligando do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR), está associada com a eficácia de cetuximab, um anticorpo contra o EGFR, como tratamento para o cancro colo-rectal ( CRC). Em contraste, o ligando heregulina HER3 se correlaciona com a resistência cetuximab. Neste estudo, foi avaliada como os níveis combinados de amphiregulin circulando e heregulina afetar os resultados clínicos em pacientes que recebem cetuximab como terapia contra o CRC avançado.

Métodos

Plasma níveis de amphiregulin e heregulina foram medidos por enzyme-linked immunosorbent assay em 50 pacientes com CCR em uma coorte de formação, e em 10 pacientes de uma coorte de validação. A expressão combinada foi então avaliada com o resultado clínico após a análise características de operação do receptor.

Resultados

taxa de resposta global foi de 26%, ea sobrevida livre de progressão mediana foi de 110 dias no grupo de treinamento. Os pacientes com alta e baixa amphiregulin heregulina teve significativamente maior taxa de resposta objectiva em 58% e significativamente maior sobrevida livre de progressão de 216 dias. Este resultado foi confirmado na coorte de validação

Conclusão

Um subgrupo de pacientes com CCR com alta amphiregulin e baixa respondem heregulina ao cetuximab terapia melhor do que outros pacientes

Citation..: Yonesaka K, Takegawa N, Satoh T, Ueda H, T Yoshida, M Takeda, et ai. (2015) análise combinada de Plasma Amphiregulin e heregulina prevê a resposta para Cetuximab em câncer colorretal metastático. PLoS ONE 10 (11): e0143132. doi: 10.1371 /journal.pone.0143132

editor: Mariko Okada (Hatakeyama), Centro de RIKEN para Integrative Ciências Médicas, JAPÃO

Recebido: 06 de junho de 2015; Aceito: 30 de outubro de 2015; Publicação: 16 de novembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Yonesaka et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

financiamento:.. os autores não receberam qualquer financiamento específico para este trabalho

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

cancros colorretais (CRC), frequentemente sobre-expressam o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR), que está associada com a progressão do tumor e o prognóstico pobre [1]. Assim, o EGFR é um alvo terapêutico, não apenas contra o CRC, mas também contra outros tipos de cancro em que é expresso abundantemente. Os agentes terapêuticos que têm como alvo EGFR ou são inibidores de cinase de EGFR-tirosina ou anticorpos monoclonais [2]. inibidores de quinase tais como gefitinib e erlotinib são altamente eficazes contra cancros de pulmão de células não pequenas com mutações de EGFR constitutivamente activas [3]. Por outro lado, os anticorpos monoclonais, tais como cetuximab e panitumumab melhorar o prognóstico em pacientes com CRC e carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço que expressam tipo EGFR selvagem [4-7].

Estudos pré-clínicos mostram que alguns tipos de câncer sensíveis para a terapia anti-EGFR também abundantemente expressar ligandos de EGFR, especialmente anfirregulina [8]. Como resultado, EGFR é constitutivamente activada nestas células por forma autócrina. Notavelmente, os pacientes com CRCs que abundantemente expressa experiência amphiregulin resultados significativamente melhores com a terapêutica com cetuximab que pacientes com baixa expressão CRC de amphiregulin [9, 10]. Com efeito, níveis de anfiregulina no plasma estão associados com eficácia cetuximab [11].

heregulina, também ligando de HER3, também é altamente expresso em alguns CRCs e, em alguns pulmão, cabeça, pescoço e cancros [12 -15]. Fisiologicamente, heregulina se liga a HER3 e desencadeia heterodimerização entre HER2 e HER3, um evento que ativa ambos os receptores [16, 17]. Por sua vez, activa a AKT HER3, e, assim, previne a apoptose. Os dados publicados mostram que a sobreexpressão de heregulina provoca resistência cetuximab em CRC, embora a inibição simultânea de HER2 e HER3 supera esta resistência [13, 18]. Além disso, heregulina plasma está negativamente correlacionada com a progressão livre de sobrevivência e sobrevida global em pacientes submetidos a terapia CRC cetuximab.

Claramente, amphiregulin e heregulina significativamente impactar o prognóstico dos pacientes com CCR tratados com cetuximab. No entanto, os resultados clínicos não são sempre explicado por um factor ou outro. Alguns pacientes de CRC que expressam abundantemente anfirregulina, bem como outros com os baixos níveis de heregulina, não respondem ao cetuximab [11, 13]. Uma possível razão pode ser que essas moléculas interagem. De facto, estudos anteriores demonstram que, enquanto a linha de células de CRC DiFi expressa abundantemente anfiregulina e é sensível ao cetuximab, transfecção estável com heregulina faz com que a resistência [18]. Portanto, nós examinamos se o nível combinado de circular amphiregulin e heregulina poderia prever de forma mais confiável resultados clínicos da terapia de cetuximab em pacientes com CCR.

Materiais e Métodos

Pacientes e tratamento

o estudo incluiu pacientes tratados de câncer colorretal metastático em Kinki University School of Medicine entre setembro de 2010 e agosto de 2015. Os pacientes tinham recebido FOLFIRI (leucovorin, 5-fluorouracil, e irinotecano) ou FOLFOX (leucovorin, 5-fluorouracil e oxaliplatin) como primeiro- ou quimioterapia de segunda linha. A maioria dos pacientes tinha adicionalmente recebeu bevacizumab, mas não anticorpos contra EGFR. Como quimioterapia de terceira linha, os pacientes foram tratados a cada duas semanas com cetuximab, sozinho ou em combinação com irinotecano. A não ser ajustado pelo médico assistente, o cetuximab foi administrado a uma dose inicial de 400 mg /m

2 e, em seguida, a 250 mg /m

2 semanalmente. O estudo foi aprovado pelo Institutional Review Board de Kinki University School of Medicine. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes. Os pacientes foram divididos em um grupo de formação de 50, e uma coorte de validação de 10.

Medição da amphiregulin plasma e heregulina

As amostras de plasma foram retirados de pacientes antes do tratamento com anti-EGFR. Anfirregulina e níveis heregulina foram medidos usando comercialmente disponíveis kits de ensaio imunoenzimático (anfiregulina humana e Heregulina kits ELISA Quantikine, R D Systems, Minneapolis, MN, EUA) ligado a enzima, seguindo as instruções do fabricante. Resumidamente, uma microplaca de 96 poços foi revestida com anticorpo de captura, lavadas, e incubadas com as amostras e padrões. A placa foi lavada uma segunda vez, sondado com anticorpo de detecção, e marcadas com um cromogénio. Por fim, a absorvância a 450 nm foi medida utilizando um leitor de placas espectrofotométrico. concentrações Amphiregulin e heregulina foram determinados com base nas curvas padrão.

Avaliação do tratamento com cetuximab

Uma reação objetiva ao cetuximab foi avaliada de acordo com os Critérios de Avaliação de resposta em tumores sólidos, ver. 1.1 [19]. A resposta tumoral foi avaliada por um médico a cada 2 a 3 meses usando tomografia computadorizada. sobrevivência livre de progressão foi definido como o intervalo entre o início de terapia anti-EGFR para a progressão do tumor ou morte, sem evidência de progressão. A sobrevida global foi medido como o número de dias entre o início do regime de cetuximab e morte.

Análise estatística

O objectivo primário deste estudo é avaliar amphiregulin e heregulina como biomarcadores associados com a resposta objectiva taxa de terapia anti-EGFR. ROC (características de funcionamento receptor) curvas foram analisadas para determinar os pontos de corte para amphiregulin e expressão heregulina. Os pontos de corte óptimas foram definidos como a distância mínima a partir de (1 -specificity, sensibilidade) = (0, 1). As diferenças na distribuição das variáveis ​​foram avaliadas utilizando

t

teste para as variáveis ​​quantitativas eo teste exato de Fisher para as variáveis ​​qualitativas. Para grupos classificados de acordo com pontos de corte, taxa de resposta objectiva foi comparado pelo teste exato de Fisher, ao mesmo tempo livre de progressão ea sobrevida global foram comparadas por curvas de Kaplan-Meier e teste log-rank. Todos os testes estatísticos foram em frente e verso, e uma

p

valor 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. As análises estatísticas e visualização foram realizados no GraphPad Prism v.5.0 para Windows (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, EUA).

Resultados

As características dos pacientes

As características dos doentes estão resumidos na Tabela 1. Todos os pacientes tiveram de tipo selvagem

KRAS

. Dos 50 pacientes analisados, 39 receberam cetuximab e irinotecano como de terceira linha quimioterapia. No entanto, todos os outros pacientes receberam cetuximab somente por causa de má saúde geral ou retenção de líquidos. Treze pacientes apresentaram resposta parcial ao cetuximab. Assim, a taxa de resposta global foi de 26%. Dezoito pacientes tinham tumores estáveis ​​por mais de 8 semanas, enquanto 19 pacientes tiveram progressão do câncer de curto prazo. A taxa global de controlo da doença foi de 62%. Mediana livre de progressão ea sobrevida global foram 110 dias e 201 dias, respectivamente. O tratamento foi interrompido para todos os pacientes devido à progressão do câncer, com exceção de três pacientes que se mudaram para um hospital diferente. Toxicidade não foi aparente. Não houve diferenças significativas na taxa de resposta quando os pacientes foram estratificados por para cada variável, incluindo idade, sexo, local do tumor primário, ECOG PS, e regime (teste exato de Fisher,

p Art 0,05, S1 Table) .

Circulating anfiregulina e heregulina

concentrações anfiregulina e heregulina no plasma estão apresentados na Figura 1A e 1B, com mediana de 11,5 pg /ml (intervalo de 0-327 pg /ml) e 1,357.5 pg /ml (intervalo 0-18,045 pg /mL), respectivamente. Não foi observada correlação entre as concentrações destas moléculas (correlação de Pearson r = 0,067), e os níveis não foram significativamente correlacionados com as características do paciente, incluindo o sexo, idade, localização do tumor primário, performance status, e regime de tratamento (Tabela 2,

t

teste, p 0,05). nível Amphiregulin tende a ser maior em pacientes cetuximab-responsivo, enquanto o nível de heregulina é significativamente menor em pacientes resistentes (

t

teste,

p

= 0,001). Assim, foi realizada ROC análises para determinar pontos de corte em que amphiregulin e heregulina tem ótima sensibilidade e especificidade para prever a resposta ou não-resposta ao cetuximab, respectivamente (Fig 1C e 1D). Em 16,8 pg /mL, amphiregulin teve sensibilidade de 76,9% (IC 95%: 46,2% -95,0%) e especificidade de 67,6% (IC 95%: 50,2% -82,0%). Usando esse ponto de corte, 22 pacientes (44%) foram considerados amphiregulin positivo para previsão de resposta com taxa de resposta de 45% (10/22). Por outro lado, a expressão de heregulina em 1292 pg /ml apresentaram sensibilidade (95% CI: 44,8% -77,5%) 62,2% e especificidade de 69,2% (CI de 95%: 38,6% -90,9%). Com base neste ponto de corte, 27 pacientes (54%) foram considerados heregulina positivo para previsão de não-resposta com taxa de resposta é de 15% (4/27).

amphiregulin Plasma (A) e heregulina (B) foram medido por ensaio imunossorvente ligado a enzima. Cada barra representa uma única paciente. Receiver operating characteristic (ROC) são mostrados para a capacidade de amphiregulin (C) e heregulina (D) para prever a resposta e não resposta ao cetuximab.

Associação de amphiregulin e heregulina com resposta cetuximab

investigou-se se o nível combinado de anfiregulina plasma e heregulina foi associado com a resposta à terapia anti-EGFR (Tabela 3). Nós categorizados os pacientes em quatro classes, dependendo se a expressão de cada molécula foi alta ou baixa, com valores de corte estabelecidos por análise ROC (Figura 2). Assim, 15 pacientes foram considerados como tendo baixo amphiregulin e alta heregulina, enquanto 13 foram considerados como tendo níveis baixos de ambos. Dos pacientes restantes, 10 foram classificados como tendo altos níveis de ambos, e 12 foram descritos como tendo alta amphiregulin e baixa heregulina. taxa de resposta objectiva foi avaliada em cada classe. Em pacientes que expressam abundantemente anfirregulina mas não heregulina, a taxa de resposta objectiva de 58%. Notavelmente, esta taxa de resposta é significativamente diferente (

p

= 0,0069, teste exato de Fisher) da taxa de resposta de 16% em outros pacientes (n = 38). Além disso, a taxa de resposta foi de 7% em pacientes com baixa amphiregulin e alta heregulina, 15% em pacientes com baixa amphiregulin e baixa heregulina, e 30% em pacientes que expressam ambos os ligantes abundantemente.

Os pacientes foram classificados em quatro grupos com base nos níveis médios de anfirregulina (16,8 pg /ml) ou heregulina (1292 pg /mL). pontos vermelhos são pacientes que responderam à terapia anti-EGFR.

Associação de amphiregulin plasma e heregulina com a sobrevivência

Foram analisados ​​o impacto dos níveis de Amphiregulin e heregulina em progressão sobrevida livre e global. Consistente com melhores taxas de resposta, os pacientes que amphiregulin abundantemente expressa, mas não heregulina experientes sobrevida livre de progressão significativamente mais longa do que outros pacientes (-rank teste log,

p Art 0,05), com mediana de 216 dias e 81 dias, respectivamente (Figura 3). Os pacientes que expressam ambas as moléculas em níveis elevados experimentou uma mediana de 65 dias livre de progressão, enquanto que aqueles que expressam tanto em níveis baixos tiveram sobrevivência livre de progressão mediana de 119 dias. Finalmente, os pacientes que têm baixa amphiregulin e alta heregulina teve mediana de 76 dias sem progressão (Fig A em arquivo S1).

Os níveis plasmáticos de amphiregulin e heregulina foram medidos por ELISA. Os pacientes são divididos em subgrupos com base no anfirregulina (AR) ou abundância de heregulina (HRG), como se mostra na Fig 2. A curva vermelha representa a sobrevivência em pacientes com alto e baixo anfirregulina heregulina (n = 12), e a linha verde representa a sobrevivência em todos os outros pacientes (n = 38).

Estas tendências são refletidas na sobrevida global. Assim, os pacientes com níveis elevados de amphiregulin e baixos níveis de heregulina tenderam a experimentar sobrevivência global maior do que outros pacientes com mediana de 356 dias (Fig 4). Aqueles com níveis baixos ou altos de ambas as moléculas sobreviveram durante uma média de 231 e 164 dias, respectivamente. Finalmente, os pacientes que expressam heregulina abundantemente mas não amphiregulin teve sobrevida global mediana de 150 dias (Fig B no Arquivo S1).

Os níveis plasmáticos de amphiregulin e heregulina foram medidos por ELISA. Os pacientes são divididos em subgrupos com base no anfirregulina (AR) ou abundância de heregulina (HRG), como se mostra na Fig 2. A sobrevivência em pacientes com alto e baixo anfirregulina heregulina (n = 12) é representada graficamente em vermelho. Sobrevivência em todos os outros pacientes (n = 38) é representada em verde.

Amphiregulin

Plasma, heregulina, e a resposta cetuximab em uma coorte de validação

Nós validado a associação de ambos os ligantes com resposta cetuximab usando um conjunto independente de 10 pacientes. Três destes pacientes tiveram alta e baixa amphiregulin heregulina, enquanto três apresentaram baixo amphiregulin e alta heregulina. Dos pacientes restantes, três expressa ambos os ligantes em níveis baixos, e uma expresso tanto em abundância (Fig C no arquivo S1). Três pacientes foram responsivos à terapia anti-EGFR, os quais tiveram alta amphiregulin mas não heregulina (Tabela 4).

Discussão

Nós e outros autores relataram anteriormente que ligantes de EGFR, especialmente anfirregulina, estão associados com eficácia cetuximab [8-10]. Em contraste, a heregulina ligando HER3 foi significativamente correlacionado com a resistência cetuximab [13, 18]. Este estudo é o primeiro a examinar se a expressão combinada de amphiregulin e heregulina afeta o resultado da terapia anti-EGFR em pacientes com CCR. Descobrimos que pacientes com níveis elevados de amphiregulin e baixos níveis de heregulina responder significativamente melhor cetuximab, com 58% de taxa de resposta objectiva e 216 dias de sobrevida livre de progressão mediana. A resposta é marcadamente melhor do que a resposta global publicada na população em geral CRC [4, 20, 21]. Estes resultados foram validados em um, mas coorte independente menor, e sugere que a avaliação de ambos anfiregulina e heregulina no plasma podem prever mais precisamente resultado cetuximab, e pode, assim, proporcionar uma base para a optimização tratamentos CRC.

Em contraste , os pacientes que abundantemente expressam tanto amphiregulin e experiência heregulina resultados pobres. Esta observação clínica é consistente com experiências de laboratório usando o CRC linha de células DiFi [18]. De fato, as células DiFi com altos níveis de amphiregulin ter aumentado a sensibilidade para cetuximab, enquanto célula heregulina superexpressão são resistentes ao cetuximab

in vitro Comprar e em xenoenxertos do mouse. Assim, os doentes com estas características pode exigir tratamentos adicionais, novas ou alternativas para superar a resistência. Por exemplo, demonstrou-se que as células que sobre-expressam heregulina são sensíveis a uma combinação de cetuximab e patritumab, um anticorpo contra HER3, apesar de cada anticorpo por si só é ineficaz [18]. Alternativamente, combinando cetuximab com um inibidor jusante da HER3 pode revelar-se também revelar-se eficaz. Tais compostos incluem inibidores de PI3K e AKT.

Notavelmente, três pacientes com baixos níveis de anfiregulina também respondeu a cetixumab, sugerindo que o EGFR é activada por outros ligandos num pequeno grupo de pacientes. Com efeito, EGFR é conhecido por se ligar seis ligandos diferentes, incluindo EGF, factor de crescimento transformante-α, anfirregulina, betacelluline, EGF de ligação à heparina, ou epirregulina [8]. Destes, epirregulina expressão em tumores se verificou também se correlacionam com a eficácia cetuximab [9, 10]. No final, todos os ligantes de EGFR podem ter que ser avaliada para prever a resposta cetuximab.

No entanto, este estudo é limitado pelo pequeno tamanho das amostras, bem como a natureza retrospectiva da análise. Para resolver estas limitações, estamos agora a realização de um ensaio clínico prospectivo e randomizado da terapia anti-EGFR em pacientes avançados CRC, em que medimos o resultado clínico em função da amphiregulin plasma e heregulina. Acreditamos que este julgamento vai fornecer mais evidências do uso de amphiregulin e heregulina como biomarcadores.

Informações de Apoio

S1 Dataset. conjunto completo de dados

doi:. 10.1371 /journal.pone.0143132.s001

(XLSX)

S1 Arquivo. As curvas de Kaplan-Meier sobrevida livre de progressão (Fig A). As curvas de Kaplan-Meier de sobrevida global (Fig B). diagrama de dispersão de amphiregulin plasma e heregulina na validação de coorte, incluindo 10 pacientes com câncer colorretal (Fig C)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0143132.s002

(PDF)

S1 Table. taxa de resposta quando os pacientes foram estratificados por para cada variável

doi:. 10.1371 /journal.pone.0143132.s003

(PPTX)

Reconhecimentos

Agradecemos a todos os pacientes que estavam incluídos neste estudo.