Abstract

Objectivo

Para avaliar a confiabilidade da ressonância magnética (MRI ) para a detecção de câncer de esôfago no modelo Levrat de esophagojejunostomy end-to-side.

Fundo

o modelo Levrat provou utilidade em termos de sua capacidade de se replicar carcinogênese de Barrett por induzir o refluxo gastroduodenoesophageal (GDER). Devido à falta de dados sobre a utilidade dos métodos não-invasivos para a detecção de câncer de esôfago, estudos de eficácia de tratamento têm sido limitados, como adenocarcinoma histologia só foi validado post-mortem. Seria, portanto, de grande valor, se a validade ea confiabilidade da ressonância magnética poderia ser estabelecida neste cenário.

Métodos

refluxo GDER crónica foi induzida em 19 ratos Sprague-Dawley utilizando o Levrat modificado modelo. Com 40 semanas de pós-operatório, todos os animais foram submetidos à endoscopia, ressonância magnética e análise histológica post-mortem do esôfago e anastomose. Com pós-mortem histologia servindo como padrão-ouro, a avaliação da presença de câncer de esôfago foi feito por cinco especialistas esofágicas e cinco radiologistas sobre endoscopia e ressonância magnética, respectivamente.

Resultados

A precisão da RM e análise endoscópica para identificar corretamente o câncer vs. nenhum caso de câncer foi de 85,3% e 50,5%, respectivamente. Curvas ROC demonstrou que classificação MRI tinha uma AUC de 0,966 (

p Art 0,001) e classificação endoscopia teve uma AUC de 0,534 (

p = 0,804

). A sensibilidade e especificidade da RM para identificar câncer vs. sem câncer foi de 89,1% e 80%, respectivamente, em comparação com 45,5% e 57,5% para endoscopia. taxas de falsos positivos de MRI e endoscopia foram de 20% e 42,5%, respectivamente.

Conclusões

A ressonância magnética é um método de diagnóstico mais confiável do que a endoscopia no modelo Levrat. O não-invasivo da ferramenta e seu potencial para quantificar volumetricamente o tamanho e número de tumores provável torna ainda mais útil na avaliação de novos agentes ea sua eficácia em estudos de tratamento de câncer de esôfago

Citation:. Kosovec JE, Zaidi AH, Komatsu Y, Kasi PM, Cothron K, Thompson DV, et al. (2014) Estabelecimento de ressonância magnética como uma ferramenta precisa e confiável para diagnosticar e monitorar o cancro esofágico em um modelo de rato. PLoS ONE 9 (4): e93694. doi: 10.1371 /journal.pone.0093694

editor: Helge Bruns, Hospital Universitário de Heidelberg, Alemanha |

Recebido: 06 de dezembro de 2013; Aceito: 08 de março de 2014; Publicação: 04 de abril de 2014

Direitos de autor: © 2014 Kosovec et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado por David Gold e Irene Blumenkranz. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

as opções de tratamento para pacientes com adenocarcinoma esofágico (EAC) são actualmente limitadas e complicada pelo fato de que a maioria dos pacientes apresentam doença fase avançada [1] – [3]. Além disso, a prevalência de adenocarcinoma de esôfago continua a aumentar nos Estados Unidos, ea taxa de sobrevivência de cinco anos é de apenas 15% [4]. É, portanto, tornou-se cada vez mais relevante para testar novas técnicas e novos agentes para prevenir e tratar EAC através da implementação de modelos translacionais abrangentes. O modelo cirúrgico de ponta-a-lado anastomose esôfagojejunal em ratos (modelo Levrat modificado) induz refluxo gastroduodenoesophageal crónica (GDER) e expõe o esófago a ácido gástrico e bílis para iniciar a progressão da doença [5] – [10]. O modelo Levrat foi validado para replicar de forma eficaz a mesma progressão longitudinal da doença do refluxo gastroesofágico (DRGE) para o esôfago de Barrett (BE) para EAC que é observada em seres humanos [11], [12]. Além disso, o modelo é altamente eficiente, uma vez que foi mostrado que aproximadamente 70% dos ratos desenvolveram EAC por 28 semanas pós-cirurgia [13].

Estudos anteriores têm demonstrado a utilidade deste modelo para determinar a eficácia de agentes preventivos contra a progressão da doença, mas o potencial para serem utilizados como um modelo de tratamento tem sido limitado pela incapacidade para diagnosticar de forma fiável patologia antemortem [13], [14]. análise visual endoscópica tem sido utilizada como uma ferramenta para monitorizar a história natural da doença [15], com biópsia permitindo a análise de marcadores moleculares, evitando o sacrifício de animais [16] – [18]; No entanto, devido à limitação do modelo inerente da apresentação extra-luminal da maior parte dos tumores, bem como a baixa precisão de biópsias endoscópicas, adenocarcinoma histologia só foi validado post mortem [15].

Alternativa técnicas de imagem, como a digitalização micro-PET foram exploradas em uma tentativa de resolver este problema; no entanto, nenhuma técnica tem sido provado significativamente sensível e específica quando comparada com o padrão de ouro de histologia [19]. Recentemente, imagem por ressonância magnética (MRI) tem sido utilizada com sucesso como um método de imagem não invasiva em modelos animais de cancro da mama e do fígado [20] – [22]. Com pós-mortem análise histológica sendo o padrão ouro para EAC, nosso objetivo foi examinar se MRI viria a ser um instrumento válido para detectar a presença de câncer de esôfago no modelo Levrat, em comparação com inspeção visual com endoscopia.

Materiais e Métodos

Levrat Modelo

o Comitê da Universidade de Pittsburgh Institucional animal Cuidado e Uso aprovado um protocolo para o desenvolvimento deste estudo (protocolo no. 1104373). Todos os animais receberam cuidados de acordo com o “Guia para o cuidado e uso de animais de laboratório.” (Fig. 1) foi realizada em 300 g 6-8 ratos Sprague-Dawley semanas de idade End-to-side anastomose esôfagojejunal ( Harlan Laboratories, Indianapolis, IN) de acordo com o procedimento cirúrgico e acompanhamento das normas previamente descrito [13]. O estado de saúde e peso dos animais foram monitorizados numa base diária. Os animais foram sacrificados antes do ponto final do estudo, se eles experimentaram maior do que 45% de perda de peso ou problemas de saúde agudos e recebeu suplementação de dieta pellet mushed ou dieta gel (Nutra-Gel S5769, BioServ) se a perda de peso alcançada superior a 25%. Os ratos foram sacrificados em 40 semanas de pós-operatório através da inalação de dióxido de carbono para avaliação histológica. Os animais foram programados para receber MRI e endoscopia em 32, 36 e 40 semanas de pós-operatório.

imagem Bruto de tumor de esôfago (animal no. 13) induzida pelo modelo Levrat modificado.

endoscópica avaliação

Alimentos e água foram impedidos de animais durante 2-6 horas avaliação pré-endoscópica e por 2-4 horas após o procedimento. Os ratos foram anestesiados com isofluorano a 5% e 2% de indução e de manutenção, respectivamente. Os animais foram intubado com 16-gauge cateter intravenoso ajustada para manter as vias aéreas durante a endoscopia, mas não foram ventilados. Os ratos foram posicionados em decúbito dorsal sobre uma cama cirúrgico aquecido em água para manter a temperatura corporal durante a avaliação e um cone de nariz foi protegido usando fita adesiva ao longo do tubo de intubação. avaliação endoscópica visual foi realizada de toda esôfago usando, uma fonte de luz de fibra óptica mini-rígida Hopkins II Forward-Oblique telescópio de 30 ° (diâmetro de 1,9 /2,1 mm, comprimento 19 cm), e amostras de biópsia foram obtidos utilizando um milímetro beliscar pinça de biópsia em miniatura com maxilas de dupla ação (Karl Storz, Tuttlingen, Alemanha). Air foi introduzido através da porta lateral do endoscópio para auxiliar a visualização do esôfago distal. Quatro biópsias foram obtidas durante cada avaliação, dois para a avaliação histológica e para análise dois correlativo molecular. Todas as avaliações endoscópicas foram gravadas usando um gravador de vídeo digital (AIDA HD Connect DVD, Karl Storz, Tuttlingen, Alemanha). Após a avaliação endoscópica, os animais foram injectados por via intramuscular para os dias 0 a 3, com o cetoprofeno (3 mg /kg) e enrofloxacina (5 mg /kg), num esforço para reduzir o desconforto e prevenir a infecção respiratória de aspiração. Os animais também foram colocados em uma progressão dieta modificada três dias de dieta gel à dieta pellet mushed à dieta normal pellet, respectivamente.

MRI Análise

Todas as avaliações de RM foram realizados dentro de 24 horas de análise endoscópica . Os animais foram anestesiados com isofluorano na indução 5% e 2% manutenção através de um cone do nariz. Os ratos foram colocados inclinados para a mesa de ressonância magnética e protegidas. Um balão de pressão pequena foi colocada abaixo cavidade torácica para monitorar a frequência respiratória e eletrodos de eletrocardiograma 2 de chumbo foram colocados em frente à esquerda e patas traseiras direito de monitorar a taxa de pulso (MR-Compatível Modelo 1030 Sistema de Monitoramento e Gating, Pequenos Animais Instruments, Inc., Stony Brook-, NY). Exames de ressonância magnética usando um eco spin-sequência pesada em T2 fechado-respiratória turbo (TSE) com um tempo de eco (TE) de 27 ms e repetição tempo (TR) de cerca de 1200-1800 ms foram realizadas utilizando um pequeno animal 7 T ClinScan MRI (Bruker) utilizando interface de MRI Siemens (versão VB15A). As imagens de RM foram adquiridas em ambos os planos axial e coronal. tempo de aquisição foi de 9-10 minutos por avião.

histológica de Processamento e patológicos Avaliação

espécimes de biópsia obtida para fins histológicos e avaliar correlações moleculares foram congelados em composto OCT (Tissue-Tek) e em tampão de RLT (Qiagen), respectivamente. Os animais foram sacrificados imediatamente após a conclusão da endoscópica e avaliações finais de ressonância magnética. Após a necropsia, todo o esôfago e jejuno, aproximadamente 1 cm distal à anastomose foi recolhido e aberto longitudinalmente para inspeção visual e remoção de artefato antes espécimes foram incluídos em OCT e congelado rapidamente. As secções de tecido foram cortadas (5 um) dos blocos de OCT e coradas em hematoxilina e eosina (Fig. 2). Dois especialistas em patologia experientes independentes realizaram análise histológica. As amostras em que o consenso não foi alcançado, bem como tumores que não são visíveis no exame bruto (não-salientes; 1 mm de diâmetro) foram excluídos

A, hematoxilina e eosina (ampliação × 10) mostra a confirmação histológica. da EAC. B, a avaliação endoscópica do mesmo rato. Seta designa a área do tumor identificado pelos participantes do estudo endoscópicos suspeita. C, a avaliação Axial MRI. A seta indica uma massa anormal na parede do esôfago selecionada pelos participantes do estudo de ressonância magnética. D, Imagem coronal de ressonância magnética. Seta identifica seção transversal correspondente de suspeita de tumor na área da anastomose de interesse. MRI; ressonância magnética, EAC; adenocarcinoma de esôfago.

Projeto de Blinded Interpretação Estudo

Endoscopia.

vídeos endoscópicos foram editadas usando o QuickTime Player (versão 10.1, a Apple Inc.) para incluir a visualização completa de esófago distai (Fig. 2). Vídeos foram cortadas para excluir cenas de biópsias, de modo a não influenciar o observador a possíveis áreas de interesse. Todos os vídeos foram importados para uma apresentação de slides em triplicado, randomizado e identificou-de (PowerPoint 2010, Microsoft). Imediatamente antes do estudo, endoscopistas e gastroenterologistas cirúrgicos esofágicas foram apresentados com um tutorial descrevendo o modelo cirúrgico, tem como objetivo do estudo e classificação dos padrões da mucosa superfície. características endoscópicas foram descritos como a seguir:

normais – caracterizada pela superfície lisa e uniforme coloração;

esofagite viajantes – caracterizada por placas e cumes elevados e coloração opaca, com exsudato;

Barrett-como-intestinal-metaplasia viajantes – caracterizada por manchas de cor salmão even-tona;

câncer de viajantes – caracterizada por massas e /ou ulceração elevados irregulares. Os observadores foram instruídos a série cada vídeo como positivo ou negativo para o câncer. Além disso, os observadores foram convidados a dar a volta manualmente áreas suspeitas de tumor positivo no vídeo para o primeiro subconjunto triplicado utilizando Ferramentas de Tinta PowerPoint. Todas as apresentações foram gravadas para preservar anotações.

MRI.

Todas as imagens de ressonância magnética DICOM foram transferidos para OsiriX (versão 4.1, Pixmeo Sari) em triplicado, randomizado e de-identificados para avaliação estudo cego. Os participantes do estudo foram apresentados com um tutorial descrevendo o modelo cirúrgico, tem como objetivo do estudo e classificação de patologia da seguinte forma:

normais – mesmo espessura da parede do esôfago de proximal para distal do esôfago;

benigna estenose viajantes – aumento da espessura da parede do esôfago no esôfago distal com limites suaves; – Aumento irregular na parede do esôfago, resultando em massa irregular. especialistas radiologista foram instruídos para interpretar imagens de ressonância magnética correlacionados em planos axial e coronal e registo positivo ou negativo para o câncer (Fig. 2). Além disso, os participantes foram solicitados a circular áreas suspeitas de tumor nas imagens axiais para o primeiro subconjunto triplicado. Todas as imagens que contêm anotações foram salvos.

Análise Estatística

acordo percentual foi calculado como o número total de vezes que o avaliador acordados com a histologia, dividido pelo número total de leituras concluídas. kappa de Cohen foi usado como uma medida de concordância entre um avaliador individual e diagnósticos histológicos (por exemplo, cancro positivo ou negativo). valores de Kappa foram avaliados como se segue: 0 representam nenhum acordo; entre 0,01-0,20 representam ligeira acordo; entre 0,21-0,40, acordo justo; entre 0,41-0,60, concordância moderada; entre 0,61-0,80 acordo substancial; e entre ,81-,99 acordo excelente [23]. O coeficiente de correlação intraclasse (ICC) foi utilizado para estimar a confiabilidade inter e intra-avaliador para a presença de tumor /ausência feita pelos endoscopistas cirúrgicos esofágicas e gastroenterologistas visualização de vídeos de endoscopia e por radiologistas leitura exames de ressonância magnética. ICC pode variar de 0 (nenhum acordo) a 1 (completo acordo). Aumentar ICC tanto para inter e confiabilidade intra-avaliador indicam um aumento acordo. Cinco avaliadores individuais ler cada rato três vezes por ressonância magnética. Cinco avaliadores diferentes ler cada rato três vezes para endoscopia. Uma leitura de consenso (≥2 /3) foi determinada para cada avaliador e cada rato. Uma média de todas as avaliações de consenso para todos os avaliadores foi determinada para cada modalidade. Sensibilidade, especificidade e valores positivos falsos negativos e falsos foram calculados usando histologia como padrão de referência. A curva receiver operating characteristic (ROC) foi construído para MRI e endoscopia usando classificação média de consenso como a variável de teste e histologia como a variável de estado. Um valor de p 0,05 foi considerado como indicativo de significância estatística. Os dados foram analisados ​​usando SPSS Statistics, versão 18.0 (IBM-SPSS, Inc., Chicago).

Resultados

Ratos e Histologia

Um grupo de 38 animais, tendo sofrido cirurgia do Levrat modificado, foram selecionados para receber endoscópica e avaliação MRI em 32, 36 e 40 semanas após a cirurgia. Dez animais foram retirados do estudo devido a morte preliminar (26,3%). Necropsias foram formados em todos os animais e causas de morte incluem: perda de peso (n = 5), infecção respiratória aguda (n = 2), e desconhecido (n = 3). A taxa de mortalidade relatados e causas associadas de morte foram consistentes com estudos previamente relatados utilizando o modelo Levrat [13].

A avaliação histológica foi realizada em todas as 28 amostras de estudo restantes e verificado por um observador independente. As amostras em que o consenso não poderia ser alcançado na histologia (n = 5) e microscópicas tumores (n = 4) foram removidos da coorte do estudo, resultando em uma amostra final do estudo de 19 animais. Dos 19 animais, 57,9% foram relatados para ter EAC (n = 11). Não houve correlação significativa entre biópsias endoscópicas e histologia post-mortem (dados não mostrados), como a maioria das amostras eram difíceis lê devido a esmagar artefato, profundidade inadequada ou orientação indeterminado.

Análise endoscópica

dos 5 participantes do estudo cegos, porcentagem de acordo com a histologia variou entre 42,1% -57,9%, com um acordo média de 50,5% (Fig. 3). valores de Kappa para avaliadores individuais caiu entre -0.044-0.165, e nenhuma avaliação atingiu significância estatística (valor-p 0,05) (Tabela 1). 47,37% de varrimentos podem ser lidos com precisão, pelo menos, 80% (19/09) (Fig. 3). Intraexaminador ICCs confiabilidade variou entre 0,667-0,873 entre os scans em triplicado; enquanto entre avaliadores ICC foi 0,608. análise da curva ROC produziu uma área sob a curva (AUC) de 0,534 (SE = 0,138; significado assintótica = 0,804; intervalo de confiança de 95%, 0,263-0,805) (Fig. 4). Sensibilidade da endoscopia foi 0,455 (95% intervalo de confiança, 0,323-0,586), a especificidade foi de 0,575 (intervalo de confiança de 95%, 0,422-0,728) e precisão de diagnóstico (eficiência) foi 0,505 (intervalo de confiança de 95%, 0,405-0,606). falsos taxas negativas falsas positivas e médios médios foram de 0,425 (intervalo de confiança de 95%, 0,272-0,578) e 0,546 (intervalo de confiança de 95%, 0.0.414-0.679), respectivamente. Mesmo quando 5/5 avaliadores endoscopia classificado como um tumor como positivo, houve uma taxa de falsos positivos de 40%

A, O gráfico mostra por cento de precisão de varreduras individuais quando avaliada por cada técnica:. Endoscopia visual e ressonância magnética. B, O gráfico compara a precisão média de cada técnica avaliada pelo estudo cego. MRI; ressonância magnética

A, curva ROC de média endoscópica lendo. (AUC = 0,534; SE = 0,138; significado assintótica = 0,80; intervalo de confiança de 95%, 0,263-0,805). B, curva ROC de leitura média de ressonância magnética. (AUC = 0,966; SE = 0,036; significado assintótica 0,001; 95% intervalo de confiança, 0-1,0). ROC; característica de operação do receptor, AUC; área sob a curva, SE; erro padrão.

MRI Avaliação

porcentagem de acordo com a histologia dos participantes MRI variou entre 78,95% -94,7%, com um acordo média de 85,3% (Fig. 3) e valores de kappa de taxas individuais entre 0,553-0,890. Todos os avaliadores atingiu significado estatístico (valor de p 0,05) (Tabela 1). 78,95% de varrimentos podem ser lidos com precisão, pelo menos, 80% (15/19) (Fig. 3). ICCs de confiabilidade intraexaminador entre scans triplicados caiu entre 0,315-0,785 e ICC entre avaliadores foi 0,624. análise da curva ROC determinou uma AUC de 0,966 (SE = 0,035; significado assintótica 0,001; intervalo de confiança de 95%, 0-1,00) com sensibilidade de 0,891 (intervalo de confiança de 95%, 0,809-0,973), especificidade de 0.800 (95% de confiança intervalo, ,676-,924), e eficiência de 0,853 (intervalo de confiança de 95%, 0,781-0,924) (Fig. 4). falsos taxas médias positivos e falsos negativos foram 0,200 (intervalo de confiança de 95%, 0,076-0,324) e 0,109 (intervalo de confiança de 95%, 0,027-0,208), respectivamente. Com uma classificação média de ressonância magnética de 0,80 ou superior (4/5 ou 5/5 classificações positivas para o tumor), MRI classificação média foi anotado para ser preditivo do tumor sem falsos positivos.

Discussão

a busca por novos métodos de tratamento para EAC tornou-se extremamente importante nos últimos anos com o surgimento de pacientes com câncer de esôfago. [24], [25]. Desde RM recentemente tinha sido utilizado com sucesso em modelos animais pequenos traducionais para outros tipos de cancros [20] – [22], que destinado a testar a capacidade de ressonância magnética para diagnóstico eficaz do tumor esofágico no modelo, em comparação com Levrat endoscopia. Como notado, verificou-se a ressonância magnética para ser um método muito válido e fiável para a detecção de tumores esofágicos, em comparação com a endoscopia. Embora avaliação endoscópica tem suas próprias vantagens, em nosso estudo, as biópsias não poderia fornecer histologia fiável devido ao pequeno tamanho da amostra ea orientação complicada.

Quando comparados com a avaliação endoscópica, MRI foi anotado para ser superior na detecção de adenocarcinoma em todos os níveis, incluindo a precisão, sensibilidade, especificidade e eficácia. Inter-observador consenso também foi maior para ressonância magnética, indicando as avaliações futuras provavelmente produzir resultados semelhantes. Intra-observador consenso entre leituras em triplicado foi a única variável em que os valores endoscópicos representaram uma gama maior, indicando maior consenso entre leituras endoscópicos. Ainda assim, exames de ressonância magnética com os mais baixos níveis de consenso intra-observador foram consistentes com scans produzir mais baixos níveis de precisão, indicando variabilidade foi principalmente limitado a exames difíceis. Havia quatro casos em que a precisão média de exames de ressonância magnética foi anotado para ser abaixo de 80%. Em três dos casos, a interpretação foi difícil devido à presença de um abcesso no sítio da anastomose ou do estômago; enquanto que no quarto caso, houve efeito de movimento significativo.

A natureza não-invasiva da ressonância magnética, a sua capacidade para identificar com precisão o câncer, e incorporação no modelo Levrat torna a modalidade ainda mais aplicáveis ​​para avaliar novos agentes e sua eficácia em estudos de tratamento. A alta precisão e taxas de falsos positivos baixos indicam MRI seria um método confiável para diferenciar o câncer vs. sem braços de tratamento do câncer com erro mínimo. Além disso, a taxa de falsos negativos de baixo também ajudaria a maximizar a eficiência e minimizar a quantidade de animais necessários para um determinado protocolo. Por outro lado, a endoscopia produziu uma taxa de falsos positivos de 40%, mesmo quando todos os especialistas endoscópicos concordou tumor estava presente. Portanto, endoscopia visuais seria um discriminador pobres do estado do tumor de um tal estudo.

As limitações deste estudo incluem o pequeno tamanho da amostra. Além disso, embora a sequência específica utilizada neste estudo foi capaz de detectar com precisão a presença do tumor, todo o volume de massas suspeitas não foi quantificada devido à natureza inerente 2-dimensional da verificação EET. Estudos futuros podem se beneficiar de um scan 3-dimensional. Uma sequência de ressonância magnética 3-D integra o axial, coronal e sagital para permitir uma quantificação volumétrica precisa das características anatômicas. No modelo descrito, uma verificação de 3-D de ressonância magnética pode ser utilizada para analisar a eficácia num modelo de tratamento, fornecendo o volume do tumor pré e pós-tratamento. Utilização de agentes de contraste para melhorar a área da anastomose de interesse e diferenciar tumor aumentaria ainda mais a precisão desta modalidade.

Reconhecimentos

Os autores também gostaria de agradecer à Universidade de Pittsburgh Cancer Institute, especificamente Erik Weiner, Paul Schornack, e Michael K. Gibson por seu apoio em nossos esforços.