Abstract

câncer colorretal esporádico (CRC) é um tumor maligno comum e também uma das principais causas de morte por câncer em todo o mundo. expressão aberrante do factor de transcrição SOX2 foi recentemente observado em vários tipos de cancro, mas o seu papel em CRC não foi totalmente elucidado. Aqui nós estudamos a expressão de SOX2 em 441 pacientes com CCR por imunohistoquímica e relacionados com a expressão a variáveis ​​clínico-patológicas e moleculares e prognóstico do paciente. SOX2 foi expressa em 11% dos tumores e foi significativamente associada ao

BRAF

V600E

mutação, mas não para

KRAS

mutações (códon 12 e 13). positividade SOX2 foi correlacionada com a sobrevivência paciente pobre, especialmente em

BRAF

V600E

casos mutados.

In vitro

estudos mostraram que as células expressando a constitutivamente activa

BRAF

V600E

tinha aumentado expressão SOX2, um achado não encontrada em células que expressam

KRAS

G12V

. Além disso, bloqueando a sinalização a jusante BRAF usando um inibidor MEK-resultou numa diminuição da expressão de SOX2. Uma vez que a sobre-expressão SOX2 tem sido correlacionada com o aumento da migração e invasão, foi investigada a expressão SOX2 em metástases do fígado CRC humana e descobriram que um SOX2 positiva principal CRC também apresentaram expressão SOX2 em metástases hepáticas correspondentes. Finalmente, descobriram que as células com superexpressão expressão SOX2

in vitro

se observado aumento de FGFR1, que tem sido relatada a correlação com metástase hepática no CRC. Nossos novos achados sugerem que a expressão SOX2 é parcialmente regulada por sinalização BRAF, e um aumento da expressão SOX2 pode promover CRC metástase e mediar um prognóstico pobre paciente

Citation:. Lundberg IV, Löfgren Burström A, Edin S, V Eklöf , Oberg Å, Stenling R, et al. (2014) Expressão SOX2 é regulada por BRAF e contribui para o prognóstico do paciente pobre no cancro colorectal. PLoS ONE 9 (7): e101957. doi: 10.1371 /journal.pone.0101957

editor: Andreas-Claudius Hoffmann, Cancer Center, da Alemanha Ocidental, Alemanha |

Recebido: 31 de janeiro, 2014; Aceito: 12 de junho de 2014; Publicação: 10 de julho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Lundberg et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada por doações da Fundação Cancer Research no norte da Suécia, OE e Edla Johanssons fundação, Petrus e Augusta Hedlunds Foundation, Magn Bergvall Foundation, The Cancer Society sueco, O Conselho de Pesquisa sueco e Universidade de Umeå. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

câncer colorretal esporádico (CRC) é uma malignidade comum no mundo ocidental e uma das principais causas de mortes por câncer. A alta taxa de mortalidade, devido à doença disseminada oculto ou clinicamente identificados já no momento do diagnóstico, enfatiza a importância de uma maior compreensão dos eventos biológicos que levam a um câncer invasivo. Este conhecimento é importante para predizer o prognóstico do paciente e criar novas terapias e poderosas. O adenoma a sequência de carcinoma de retratar os acontecimentos genéticos necessários para um epitélio do cólon normal a ser transformado num fenótipo maligno, na maioria dos casos esporádicos CRC [1]. Uma vez que o processo metastático em CRC não é totalmente compreendido como, é difícil de explicar por que razão alguns tumores tornam-se mais agressivo e metastizar mais facilmente do que outros. Identificação de marcadores moleculares expressos em tumores invasivos que podem prever mau prognóstico do paciente é, portanto, um importante objeto de pesquisa.

SRY (sex região determinante Y) -box 2 (SOX2) é um membro da grande

SOX família de genes

, compreendendo factores de transcrição conhecidos por serem importantes na regulação de processos de desenvolvimento e tipo celular especificação [2]. O SOX2 chave membro desempenha um papel essencial na manutenção da pluripotência das células e auto-renovação em células-tronco embrionárias [3] e em células-tronco pluripotentes induzidas [4]. Recentemente, também foi relatado que a auto-renovação das células estaminais de cancro é mantida por SOX2 [5], sugerindo um papel de ongogenic SOX2. A sobre-expressão de SOX2 pode ser visto no CRC [6] – [8], bem como em vários outros tumores malignos, tais como cancro da mama, pancreático e cancros gástricos [9] – [11], demonstrando o seu envolvimento na carcinogénese. Além disso, SOX2 tem sido sugerido para ser envolvido no CRC migração celular, invasão e metástase, onde matriz metaloproteinase 2 (MMP2) tem sido proposta como um mediador potencial para o efeito SOX2 [6], mas os mecanismos exactos ainda precisa ser descoberto .

no presente estudo, avaliamos a expressão SOX2 no CRC primária, bem como em amostras de metástase hepática correspondente, e correlacionados nossos achados ao prognóstico do paciente e características do tumor moleculares. Nossos resultados sugerem que a expressão SOX2 é, pelo menos parcialmente, regulada por BRAF, e que a expressão de BRAF

V600E de uma forma dependente estágio se correlaciona com um prognóstico pobre paciente.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

no presente estudo, a manipulação de amostras de tecido e dados paciente foi aprovado pelo comitê de ética em pesquisa do Hospital Universitário Umeå (Ethical Review Board Regional em Umeå, Suécia). Isso inclui o procedimento pelo qual os pacientes verbalmente deram o seu consentimento informado, que foi documentada em cada registro de paciente e considerado pela Comissão de Ética para ser suficiente. Cada amostra de tecido foi registrada como um número de caso e ano no banco de dados usado para as análises e os nomes ou de identificação pessoal não foram indicados.

Amostras clínicas

As amostras de tecido CRC incluídos no estudo eram do cancro colorectal em Estudo Umeå (crums), que consiste em pacientes que foram cirurgicamente ressecados para CRC primária entre 1995 e 2003 no Hospital da Universidade Umeå, na Suécia. classificações histopatológicas de todos os casos foram realizados por um patologista, revendo secções de tumor rotineiramente manchadas. Os dados clínicos foram obtidos através da revisão dos registros de pacientes e dados de sobrevivência foram coletados durante o outono de 2012.

13 pacientes com tecido de arquivo tanto do adenocarcinoma colorretal primário e correspondente metástase hepática distante que foram diagnosticados no mesmo intervalo de tempo como crums foram incluídos no presente estudo. Estes foram identificados usando o banco de dados de registro de paciente computadorizado no Departamento de Patologia Clínica do Hospital Universitário Umeå, na Suécia. Os tumores foram classificados e diagnosticada por patologistas no momento da cirurgia ou biópsia.

Imunohistoquímica

espécimes CRC foram fixados em formalina e embebidos em parafina de acordo com protocolos de rotina do Departamento de Patologia Clínica, Umeå Hospital universitário, Suécia. Eles foram cortados a 4 mícrons e, em seguida, secou-se, desparafinizadas e reidratadas. anticorpo policlonal anti-SOX2 [12] – [14] (Abcam, Cambridge, Reino Unido) foi utilizada a uma concentração de 1:500 numa máquina de coloração semi-automático (Banco Mark Ultra, Ventana Inc) e visualizado por detecção kit iVIEW DAB (Ventana Inc)). As lâminas foram contrastadas com hematoxilina.

Para crums, 449 casos foram imunohistoquímica manchado, mas devido à falta de material de tumor (n = 7) ou perda de tecido repetida durante a etapa de recuperação antigênica (n = 1), oito dos eles não podem ser analisados ​​por coloração com SOX2. Todos os 13 pacientes com metástases correspondente foram coradas com sucesso, e todos poderiam ser analisadas para as células SOX2-positivo. Os espécimes foram analisados ​​sob microscopia de luz, e cada amostra foi avaliada duas vezes pelo mesmo observador e em casos com pontuação discrepante, uma terceira avaliação final foi feita. coloração nuclear foi avaliada como positiva ou negativa. Ocasional coloração citoplasmática ou estromal não foi analisada.

Análise estatística

As associações entre a expressão SOX2 e diferentes variáveis ​​clínico-patológicos foram analisados ​​utilizando χ de Pearson

2 testes. Para estimar a sobrevida específica para o câncer, foi utilizada a análise de sobrevivência de Kaplan-Meier, e as comparações entre os grupos foram feitas usando o teste log-rank. Pacientes na coorte crums que morreram dentro de um mês da cirurgia devido a complicações pós-operatórias (n = 37) foram excluídos da análise a sobrevivência. Modelo proporcional de Cox foram utilizados para as análises multivariadas. eventos específicos do cancro foram definidos como morte com doença conhecida disseminada ou recorrente, e os casos foram censurados no final do follow-up ou no momento da morte por outras causas. SPSS /PASW software estatístico versão 20 (SPSS Inc., Chicago, Illinois, EUA) foi utilizado para as análises estatísticas. Os níveis de expressão do gene foram comparados utilizando

t

teste de duas Student atados. Cada barra representa a média de três experiências independentes e as barras de erro mostram o desvio padrão.

p

. 0,05 foi considerado estatisticamente significante para todas as análises

linhas de células e cultura de células

No presente estudo, a linha de células de cancro do cólon Caco2 (American Type Culture Colecção, Manassas, VA, EUA) cresceu em meio modificado por Dulbecco de Eagle (DMEM) com Glutamax suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) (Gibco, Life Technologies, Estocolmo, Suécia) e mantida a 37 ° C e 5% de CO

2. Geração dos transfectantes estáveis ​​que expressam SOX2 (Caco2-SOX2), BRAF mutante (Caco2-BRAF

V600E) ou KRAS mutante (Caco2-KRAS

G12V) foi realizada por transfecção Caco2 células com pcDNA3.3-SOX2 ( Derrick Rossi, Childrens Hospital Boston, EUA, via Addgene), pMCEF-BRAFV

600E (gentilmente cedido pelo Prof. R. Marais) ou pcDNA3-KRAS

G12V (amável do Dr. N. Ignatenko) usando Caco-2 Transfection Reagent (Altogen Biosystems, Las Vegas, NV, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Entre 48 e 72 horas após a exposição com o ADN, as células transfectadas foram seleccionadas com 800? G /ml de G418 (Gibco, Life Technologies, Estocolmo, Suécia). Meio contendo G418 foi mudado duas vezes por semana.

Para bloquear a sinalização BRAF em Caco2 e Caco2-BRAF

células V600E, 20 mM PD98059 inibidor MEK (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA), ou DMSO como controlo, foi adicionado às células após a incubação durante 24 ou 48 h.

RT-PCR

o ARN total foi isolado a partir de células utilizando o estojo NucleoSpin ARN II (Macherey-Nagel, Duren , Alemanha), e o ADNc foi sintetizado com o Superscript II Reverse Transcriptase (Invitrogen, Life Technologies, Estocolmo, Suécia) de acordo com os protocolos do fabricante. Os iniciadores utilizados no estudo foram a partir de ADN Tecnologia A /S (Aarhus, Dinamarca) e as suas sequências foram as seguintes: para a frente GAPDH: 5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3 ‘, reverso: 5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3’. SOX2 para a frente: 5′-AACCCCAAGATGCACAACTC-3 ‘, reverso: 5′-CGGGGCCGGTATTTATAATC-3’. FGFR1 para a frente: 5′-AGGCTACAAGGTCCGTTATGC-3 ‘, reverso: 5′-TGCCGTACTCATTCTCCACAA-3’. FGFR2 para a frente: 5′-TTAAGCAGGAGCATCGCATTG-3 ‘, reverso: 5′-GGGACCACACTTTCCATAATGAG-3’. FGFR3 para a frente: 5′-CCTCGGGAGATGACGAAGAC-3 ‘, reverso: 5′-CGGGCCGTGTCCAGTAAGG-3’. FGFR4 para a frente: 5′-TGCAGAATCTCACCTTGATTACA-3 ‘, reverso: 5′-GGGGTAACTGTGCCTATTCG-3’. Cada reacção de PCR continha 25 ng de cDNA e cada amostra foi executado em duplicatas. As experiências foram repetidas três vezes. Os desvios padrão foram calculados da média das reacções em triplicado. RT-PCR as reacções foram realizadas em Taqman 7900HT (Applied Biosystems, Life Technologies, Estocolmo, Suécia) e seguintes parâmetros dos ciclos foram utilizados: 50 ° C durante 2 min e, em seguida, uma desnaturação inicial a 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s e 60 ° C durante 60 s. expressões de genes foram normalizadas para GAPDH.

Western blot

Para analisar a expressão de SOX2 no transfectante estável Caco2-SOX2, as células foram lisadas em tampão de lise (NaCl 100 mM, Tris 50 mM, pH 7,5, 1% de Triton X-100, 1 mM de EDTA pH 8,0, MgCl 15 mM

2, inibidores da proteína) antes de proteínas foram separadas por SDS-PAGE e transferidos para uma membrana de PVDF (GE Healthcare, Uppsala, Suécia). O blot foi incubado com o anticorpo primário SOX2 (1:1000, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EUA) e anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano (GE Healthcare, Uppsala, Suécia) de acordo com as instruções do fabricante. A membrana foi desenvolvida com ECL Western Blotting Detection Seleccione Reagente (GE Healthcare, Uppsala, Suécia).

gotícula Digital PCR

O ADN genómico foi isolado a partir das células utilizando o kit de tecido NucleoSpin (Macherey- Nagel, Duren, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante.

digital gota de PCR (ddPCR, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA) foi utilizado para verificar a Caco2 transfectantes expressando mutante

BRAF

V600E

(Caco2-BRAF

V600E) e

KRAS

G12V

(Caco2-KRAS

G12V). O ddPCR-método tem sido apresentada completamente noutro local [15], [16]. Resumidamente, o ddPCR permite a detecção e quantificação de ambas mutação e do tipo selvagem na mesma reacção usando o FAM e HEX fluoróforos conjugado para sequenciar sondas específicas. No ddPCR-método, uma amostra de PCR de 20 l é dividido em 20 000 gotas de nanolitros dando cerca de 20 000 leituras.

Para verificar uma transfecção bem sucedida de Caco2-BRAF

V600E, os iniciadores e sondas foram como se segue: para a frente: 5′-GCACAGGGCATGGATTACTTACA-3 ‘, reverso: 5′-ATCCAGACAACTGTTCAAACTGATG-3′, tipo selvagem sonda: 5’-FAM-56 /TTGGTCTAGCTACAGTGAAAT /3BHQ_1-3 ‘, sonda de mutação: 5’-5HEX /TTGGTCTAGCTACAGAGAAAT /3BHQ_1-3 ‘(DNA Technology A /S, DNA Technology A /S) [17], [18]. A PCR foi realizada num termociclador T100 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA) utilizando o programa: 95 ° C durante 10 min; 40x ciclos de 95 ° C durante 15 s e 56 ° C durante 1 min (taxa de rampa de 2 ° C /segundo); e 98 ° C durante 10 min. 900 nm dos iniciadores, e 250 nM de sonda respectiva foi usada

Para a detecção de transfecção bem sucedida de Caco2-KRAS

G12V, foram utilizados ensaios para ddPCR (PrimePCR ddPCR Ensaio de Mutação:. KRAS p.G12V ensaio, Human; PrimePCR ddPCR ensaio de Mutação: KRAS tipo selvagem para o ensaio p.G12V, humano, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA) com PCR-condições acordo com o manual fornecido pela empresa: 95 ° C durante 10 min; 40x ciclos de 94 ° C durante 30 s e 55 ° C durante 1 min (taxa de rampa de 2 ° C /segundo); e 98 ° C durante 10 min.

Cada reacção de PCR continha 50 ng de ADN e as gotas foram preparados de um gerador de gotícula QX100 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA). O produto de PCR final foi detectada num leitor QX200 gota (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA) e os resultados analisados ​​com o software QuantaSoft, versão 1.4 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA).

ilha CpG methylator fenótipo (CIMP) estado

Tumor estado CIMP foi determinada pelo método MethyLight com sequências iniciadoras e sonda que são previamente descrito [19], [20]. Para os oito genes no painel CIMP (

CDKN2A

,

MLH1

,

CACNA1G

,

NEUROG1

,

RUNX3

,

SOCS1

,

IGF2

e

CRABP1

) [20] foi calculado o percentual de referência metilado (PMR), onde PMR 10 foi considerado como positivo [19]. Os tumores foram classificados como CIMP negativo (sem hipermetilação do promotor), CIMP baixa (de um a cinco genes metilados) ou CIMP elevadas (de seis a oito genes metilados) [20].

microssatélites instabilidade (MSI) status de triagem

reparação de emparelhamentos incorrectos proteínas foram analisados ​​por imuno-histoquímica como previamente descrito [20]. Resumidamente, fixadas em formalina e embebidos em parafina de tecido CRC foi examinado para a expressão de quatro proteínas de reparo incompatível (MLH1, MSH2, MSH6 e PMS2). Uma amostra considerada com um estado de rastreio positivo MSI faltava coloração nuclear de células de tumor por pelo menos uma das proteínas e é referida como a MSI. Um status negativo triagem MSI tinha expressão de todos os quatro genes e foi referida estáveis ​​como microssatélites (MSS).

BRAF

V600E mutacional estatuto

O ensaio de discriminação alélica Taqman, descrito em detalhes em outros lugares [17], foi utilizado para detecção do

BRAF

V600E

mutação (reagentes de Applied Biosystems, Life Technologies, Estocolmo, Suécia).

KRAS sequenciamento

A análise mutacional de

KRAS

foi explicado em outro lugar [21]. . A sequenciação foi efectuada utilizando Big Dye v 3.1 (Applied Biosystems, Life Technologies, Estocolmo, Suécia) e os iniciadores utilizados foram: para a frente: 5′-TGTAAAACGACGGCCAGTGAGTTTGTATTAAAAGGTACTGG-3 ‘e inverso: 5′-CAGGAAACAGCTATGACCTCTGTATCAAAGAATGGTCCT-3’.

resultados

expressão SOX2 no CRC se correlaciona com o grau do tumor, estágio TNM e

BRAF

mutação

expressão SOX2 Nuclear em células de tumor foi avaliada em 441 amostras de pacientes CRC por imuno-histoquímica, onde a expressão foi avaliada como positiva ou negativa (Figura 1). Nos casos positivos, SOX2 expressão não foi observada em todo o tumor, mas núcleos positivos foram encontrados em zonas limitadas. estromal ocasional ou coloração citoplasmática não foi avaliada. 47 (10.7%) das amostras de CRC exibido células tumorais que expressam SOX2 e a expressão em relação a diferentes características clinicopatológicas é mostrado na Tabela 1. Na nossa coorte, SOX2 expressão foi encontrado para ser significativamente associado com um grau elevado de tumores (

p

= 0,004) e estágio TNM (

p

= 0,034). expressão SOX2 também foi altamente correlacionado com o

BRAF

mutação (

p Art 0,001), mas surpreendentemente nenhuma correlação com

KRAS

mutações poderia ser visto (

p

= 0,928).

(a) negativo coloração SOX2 nuclear em uma CRC moderadamente diferenciado. (B) coloração SOX2 nuclear positiva em uma CRC pouco diferenciados.

expressão SOX2 está correlacionada com a sobrevivência paciente pobre

específicas de sobrevivência do cancro de análises revelaram que os pacientes com SOX2 tumores positivos tiveram um pior prognóstico do que pacientes com tumores negativos SOX2 (Figura 2a). Esta associação foi ainda mais forte quando apenas o

BRAF

tumores mutantes foi analisado (Figura 2b), enquanto nenhuma diferença de expressão SOX2 na sobrevivência foi visto em

BRAF

tipo tumores selvagens (Figura 3c). expressão SOX2 não tem qualquer efeito sobre o prognóstico do paciente em

KRAS

tumores mutantes (

p

= 0,676). Em um modelo de risco multivariada Cox proporcional incluindo idade, sexo,

BRAF

mutação e expressão SOX2, o mau prognóstico para pacientes com expressão SOX2 versus sem expressão SOX2 manteve significância estatística (hazard ratio (HR) = 1,64, 95 % CI 1,04-2,58,

p

= 0,032). Quando ainda o ajuste para o estágio na análise multivariada, o impacto prognóstico da expressão SOX2 foi perdido (CI HR = 1,04, 95% 0,65-1,67,

p

= 0,878), enfatizando a dependência palco.

são mostrados gráficos de Kaplan-Meier de sobrevida específica por câncer em (A) todos os pacientes com CCR, (B)

BRAF

V600E

pacientes ou CRC mutantes (C)

BRAF

tipo selvagem pacientes com CCR.

células Caco2 (A), células Caco2 expressando estavelmente

BRAF

mutação (Caco2-BRAF

V600E) e células Caco2 expressando estavelmente

KRAS

mutação (Caco2-KRAS

G12V). expressão SOX2 em Caco2 foi definido como 1. (B) Caco2 após o cultivo com MEK-inibidor, 24 ou 48 h, ou DMSO durante 48 horas como controlo. expressão SOX2 em Caco2 tratado com DMSO foi definido como 1. (C) Caco2-BRAF

V600E após o cultivo com MEK-inibidor, 24 ou 48 horas, ou DMSO durante 48 h como controle. expressão SOX2 em Caco2-BRAF

V600E tratado com DMSO foi definido como 1. PD: PD98059 (MEK-inibidor), *

p Art 0,05, **

p Art 0,01, ***

p Art 0,001, ns: não significativo

p

-valor

expressão SOX2 é regulada por BRAF

in. vitro

Como expressão SOX2 correlacionada com mutado

BRAF

em nossa coorte, continuamos a analisar a sua relação molecular

in vitro

. A linha de células CRC Caco2, com BRAF endógeno e KRAS tipo selvagem, foi transfectado com qualquer BRAF

V600E ou KRAS

G12V, a fim de estabelecer linhas de células que expressam de forma estável mutante

BRAF

(Caco2-BRAF

V600E, Figura S1a) ou mutante

KRAS

(Caco2-KRAS

G12V, Figura S1b). Por análises de RT-PCR, descobrimos que Caco2-BRAF

V600E expressa cerca de duas vezes mais elevados SOX2-níveis em comparação com Caco2 (

p

= 0,013), aumento que não foi observado em Caco2-KRAS

G12V (Figura 3a). Estes resultados, em concordância com os dados do grupo de pacientes (Tabela 1), sugerem que a expressão de SOX2 é regulada por BRAF mutante. O

BRAF

V600E

mutação BRAF torna num estado constitutivamente ativa, estimulando o MEK /ERK cascata de sinalização na ausência de estímulos extracelulares [22]. Com efeito, bloqueando BRAF de sinalização a jusante na Caco2 BRAF

células V600E usando o PD98059 MEK-inibidor, resultou numa diminuição da expressão de SOX2 (Figura 3C), o que sugere que é principalmente a actividade bem caracterizada MEK activação de BRAF que regula SOX2 . Além disso, os baixos níveis endógenos de SOX2 em células Caco2 foram também diminuiu o MEK-inibidor (Figura 3b), o que implica que BRAF responder aos sinais de activação endógenos também regula a expressão SOX2. Juntos, esses resultados confirmam o papel de BRAF como um regulador a montante da expressão SOX2.

SOX2 primário positivo CRC tem metástase hepática SOX2 positiva correspondente

Dado o fato de que a expressão SOX2 está correlacionada a um paciente pior prognóstico, quisemos estudar a expressão SOX2 em tumores primários, bem como metástases à distância correspondente. Por isso, 13 pacientes com tecido de arquivo de tanto um adenocarcinoma colorretal primário e metástases do fígado distante foram incluídos no estudo de expressão e SOX2 nuclear foi avaliada em células epiteliais. Dois dos 13 tumores primários foram SOX2 positiva, ao passo que os outros onze tumores eram SOX2 negativo. Curiosamente, SOX2 tumores primários positivos foram também SOX2 positivo na metástase do fígado correspondente, enquanto que os tumores SOX2 negativos teve SOX2 metástases hepáticas negativo (Tabela 2). Notável, estes metástase positiva SOX2 eram morfologicamente mais parecidos os compartimentos de tumor com núcleos positivos SOX2 do que o resto do tumor primário (dados não mostrados).

SOX2 aumentar a expressão de FGFR1

a desregulação de receptores de factor de crescimento de fibroblastos (FGFR) é visto no CRC, bem como em outros tipos de cancro [23], [24]. Uma vez que foi sugerido que SOX2 regular a expressão de FGFR3 [7], quisemos estudar se SOX2 alterou a expressão de FGFR no nosso

sistema in vitro.

Uma linha de células que sobre-expressam SOX2 foi estabelecida por transfecção da linha de células CRC Caco2 com SOX2 (Caco2-SOX2, figura S2). A expressão de FGFR1-4 foi analisado por RT-PCR em células Caco2 e células Caco2-SOX2. expressão FGFR1 foi encontrado para ser duas vezes maior em Caco2-SOX2 como em Caco2 (

p

= 0,036), enquanto não foram observadas diferenças significativas em relação FGFR2, FGFR3 ou FGFR4 (Figura 4).

Expressão de FGFR1, FGFR2, FGFR3 e FGFR4 por análise de RT-PCR em células Caco2 e células que sobre-expressam de forma estável Caco2 SOX2 (Caco2-SOX2). A expressão em Caco2 foi definido como 1. *

p Art 0,05, ns:. Não significativa

p

-valor

Discussão

neste estudo nós investigamos a expressão SOX2 no CRC em correlação com diversas variáveis ​​clínicas e moleculares e seu efeito sobre o prognóstico do paciente. 11% dos tumores eram SOX2 positiva, ea expressão correlacionada com grau tumoral, estádio TNM e

BRAF

mutação. Além disso, descobrimos que a expressão SOX2 previsto um prognóstico pobre paciente de uma forma dependente fase, em particular em

BRAF

casos mutados. Finalmente, apresentamos SOX2 possível regulador de expressão FGFR1.

Por causa do envolvimento reivindicada por SOX2 no CRC tumorigênese [25] que queria estudar a expressão de SOX2 em nossas crums coorte de pacientes. Descobrimos que 11% dos tumores expressa SOX2 e comparando a expressão de diferentes características clinicopatológicas pudemos ver que a expressão SOX2 foi correlacionada com tumores pouco diferenciados (alto grau). Este encaixa com o conhecimento de que SOX2 é um marcador de células estaminais conhecida, e tem sido sugerido para ser expresso em células estaminais do cancro [5], [26]. Como muitas vezes SOX2 foram expressos em uma parte limitada do tumor, especula-se que estas células pode ser representando o nicho de células-tronco do cancro nestes tumores particulares. Descobrimos ainda que a expressão SOX2 foi correlacionada com mau prognóstico do paciente de um modo dependente fase, o que é consistente com alguns estudos anteriores [6], [27], [28].

SOX2 tem sido descrito por outros para aumentar o efeito migratório e invasiva de células de CRC [6], [7] como poços como de outros tipos de células de cancro [29] – [31], o que implica que as células expressando SOX2 pode abrigar uma capacidade metastático maior. Em CRC Também tem sido sugerido que a expressão de SOX2 pode prever a metástase do tumor [6]. No entanto, não existem estudos existem hoje de expressão SOX2 nas metástases tumorais. Aqui nós mostramos que metástases hepáticas correspondente ao SOX2 tumores primários positivos também abrigam células tumorais SOX2 positivo. Embora estes espécimes de tecidos de pacientes eram muito poucos, ainda indica que as células positivas SOX2 são mais propensos a migrar. Ele seria, evidentemente, ao mesmo tempo interessante e necessário estudar isso em um material de pacientes maior para verificação. O facto de que as células positivas SOX2 só fez-se uma pequena proporção de todo o tumor, sugere que estas células podem exibir um fenótipo mais invasiva do que as células tumorais vizinhas. Outra evidência de suporte para um comportamento mais invasiva de células tumorais positivas para SOX2 é que as metástases eram morfologicamente mais semelhante para as partes do tumor com núcleos positivos SOX2. Mesmo que a comparação morfológica entre tumores primários e metástases só poderia ser estudado em dois casos, achamos provável que ele pode refletir células específicas que realmente dão origem a metástases à distância.

expressão SOX2 foi correlacionada com

BRAF

mutação em nossa coorte de tecido, mas nenhuma correlação pode ser visto entre a expressão SOX2 e

KRAS

mutações. Nosso

in vitro

descobrindo que um aumento da expressão SOX2 foi visto em células que expressam BRAF

mutação V600E mas não KRAS

mutação G12V, confirma essa correlação. A /RAF /MAP quinase cascata RAS é um caminho que está implicado em muitos importantes funções celulares como o crescimento celular, divisão e diferenciação [32], e suas proteínas incluídos são frequentemente mutado no CRC. De todos os CRCs, 30-40% são mutantes no

KRAS

gene e 5-15% no

BRAF

gene [21], [33]. Estas duas mutações são acreditados para ser mutuamente exclusiva em CRC [21], [34], e eles são ambos associados com prognóstico pobre paciente [21], [35] – [37]. Embora eles estão envolvidos na mesma via, podemos ver que o

KRAS Comprar e

BRAF

CRCs mutantes têm diferentes aparências morfológicas. É interessante especular que a associação de

BRAF

mutação com expressão SOX2 pode explicar parte dessa diferença morfológica. Continuamos a analisar a correlação de BRAF e expressão SOX2 no nosso

in vitro

sistema de cultura celular. Na verdade, a expressão SOX2 foi encontrado para ser regulada em células que expressam o constitutivamente ativa BRAF

V600E. Além disso, através do bloqueio do BRAF sinalização a jusante, SOX2 endógena, bem como a expressão induzida por SOX2 BRAF

V600E foi diminuída, o que demonstra que a expressão SOX2 é pelo menos parcialmente regulado pelo BRAF /via de MEK bem caracterizado. Para nosso conhecimento, este é o primeiro estudo que mostra que a expressão SOX2 é regulado por sinalização BRAF. Outra descoberta interessante foi que o efeito prognóstico negativo de expressão SOX2 era restrito a

BRAF

pacientes mutantes, o que indica que é expressão SOX2 em combinação com

BRAF

mutação que contribui principalmente para o mau prognóstico .

é bem conhecido que a expressão anormal de receptores de factor de crescimento de fibroblastos (FGFR) pode conduzir a progressão tumoral [23], [24]. A família do FGFR é composta de quatro genes, e demonstrou-se que pelo menos o

gene FGFR3

é regulada por SOX2 em CRC [7]. Nossa linha de células com superexpressão SOX2, Caco2-SOX2, teve expressão duas vezes maior FGFR1 como células Caco2, o que implica que a expressão FGFR1 pode ser regulada por SOX2. Outros têm mostrado que a sobre-expressão de FGFR1 é encontrado em CRC [38], e que se correlaciona com metástases no fígado [39]. Um estudo recente também sugeriu que a expressão elevada de ambos SOX2 e FGFR1 está correlacionada com mau prognóstico no câncer de pulmão de pequenas células [40]. Juntos, estes resultados sugerem que SOX2 em parte através de regulação positiva de FGFR1 pode melhorar distante disseminação de células tumorais para o fígado, causando assim uma menor sobrevivência do paciente. No entanto, estudos adicionais são necessários para revelar o papel eo mecanismo de SOX2 e FGFR1 no CRC.

Em conclusão, este estudo mostra que a expressão SOX2 está correlacionada a um mau prognóstico em pacientes com CCR e identifica, pela primeira vez que a expressão SOX2, em parte, é regulada por BRAF. Estes achados em combinação com a correlação observada entre a positividade SOX2, tanto do tumor primário e metástases correspondente, sugerem que as células tumorais positiva SOX2 têm uma melhor capacidade de metástase.

Informações de Apoio

Figura S1. .

Transfecção bem sucedida de pMCEF-BRAF

V600E ou pcDNA3-KRAS

G12V na linha de células do cancro do cólon Caco2

doi: 10.1371 /journal.pone.0101957.s001

(PDF)

Figura S2. células

Caco2-SOX2 têm uma maior expressão SOX2, tanto a nível de proteína mRNA e

doi:. 10.1371 /journal.pone.0101957.s002

(PDF)

Reconhecimentos

os autores agradecem a Sra Kerstin Näslund, Departamento de Biociências Medicina, Patologia, Universidade de Umeå, por sua assistência técnica hábil e Anna Dahlin para conduzir o estado CIMP analisa.