Abstract
ADAM15 é membro de uma família de metaloproteinases de membrana desintegrina cataliticamente activos que funcionam comutadores de sinalização como moleculares, derramou fatores de crescimento ligadas à membrana e /ou clivar e inactivar as moléculas de adesão celular. função aberrante de metaloproteinase ADAM15 pode contribuir para a progressão do tumor através da libertação de factores de crescimento ou ruptura da adesão celular. Neste estudo, foram utilizados tecidos de cancro da bexiga humanos e linhas de células para avaliar a expressão e função de ADAM15 na progressão de cancro da bexiga humano. O exame das bases de dados do genoma e transcriptoma revelou que ADAM15 classificado no top 5% dos genes amplificados e seu mRNA foi significativamente sobre-expressos em câncer de bexiga invasivo e metastático em comparação com doença não-invasiva. Imunocoloração de uma matriz de tecido do tumor da bexiga desenhado para avaliar a progressão da doença revelou aumento da imunorreatividade ADAM15 associado com o aumento do estágio do câncer e exibiu coloração significativamente mais forte em amostras metastáticos. Cerca de metade dos tumores invasivos e que a maioria dos casos metastáticos apresentaram alto índice de coloração ADAM15, enquanto todos os casos não-invasivos de baixo grau e exibiu coloração negativa ou baixa. O knockdown da expressão de ARNm ADAM15 inibiu significativamente a migração de células do tumor da bexiga e reduziu a capacidade invasiva de células de tumor da bexiga por meio de Matrigel
TM e monocamadas de endotélio vascular. O knockdown de ADAM15 num modelo de xenoenxerto humano de cancro da bexiga inibiu o crescimento tumoral em 45% em comparação com os controlos. modelagem estrutural do domínio catalítico levou à concepção de um novo inibidor sulfonamida específicos de ADAM15 que demonstrou bioatividade e reduziu significativamente a viabilidade das células de câncer de bexiga
in vitro Comprar e em xenoenxertos de cancro da bexiga humanos. Tomados em conjunto, os resultados revelaram um papel undescribed de ADAM15 na invasão de cancro da bexiga humana e sugeriu que o domínio catalítico ADAM15 pode representar um alvo terapêutico viável em pacientes com doença avançada
Citation:. Lorenzatti Hiles G, Bucheit A, Rubin JR, Hayward A, Cates aL, Dia KC, et al. (2016) ADAM15 é funcionalmente associado com o metastático progressão do cancro da bexiga humana. PLoS ONE 11 (3): e0150138. doi: 10.1371 /journal.pone.0150138
Edição: Natasha Kyprianou, da Universidade de Kentucky College of Medicine, United States |
Recebido: 23 de julho de 2015; Aceito: 09 de fevereiro de 2016; Publicação: 01 de março de 2016
Direitos de autor: © 2016 Lorenzatti Hiles et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação
Financiamento:. Esta pesquisa é suportada em parte pela R01CA154252 (MLD), University of Cancer Support Center Grant Michigan (P30 CA46592) e fundos de pesquisa da bexiga de generosos doadores o Michigan Departamento de Urologia da Universidade. Este trabalho também foi apoiado em parte pelas Europeu egípcios Indústrias Farmacêuticas. GLH é suportado por UL1TR000433 (Pós-Doutorado Programa Translational Scholars, Instituto Michigan de Clínica e Pesquisa em Saúde) e da Universidade de Michigan. O financiador EEPI forneceu apoio sob a forma de taxas de consultoria para os autores [MLD e LE], mas não tinha nenhum papel adicional no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Os papéis específicos destes autores são articuladas na seção “autor contribuições ‘
Conflito de interesses:. Os autores leram a política da revista e os autores deste manuscrito ter a seguinte interesses concorrentes: MLD é um consultor pago da Europeu egípcia Pharmaceuticals, Alexandria, Egito. Os autores também declarar que este apoio da EEPI não altera a sua adesão a PLOS ONE políticas em dados e materiais de partilha
Abreviaturas:. ADAM, Proteína Adam; DMEM, Dulbecco Modified Eagle Medium; EGF factor de crescimento epidérmico; EGFR, do Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico; FBS, Soro de Bovino Fetal; FRET, ressonância de fluorescência de transferência; GAPDH, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase; GPCR, L-receptor acoplado a proteína; HB-EGF, ligação à heparina Factor de Crescimento Epidérmico; HUV-EC-C, umbilical humano Células Endoteliais da Veia; MTS, 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) -2H-tetrazólio; OD, densidade óptica; PBS, solução salina tamponada com fosfato; PMS, metossulfato de fenazina; RFLP, polimorfismo de fragmentos; SCID, Imunodeficiência Combinada Grave; SD, desvio padrão; SE-cad, solúvel caderina-E; EPM, erro padrão da média; shRNA, RNA hairpin curto; TBST, Tris-Buffered Saline mais Tween; TEM, Trans-Endotelial Migração; TGFa, fator transformador de crescimento alfa; TGF, Fator Transformador de Crescimento Beta
Introdução
O câncer de bexiga é a quarta causa mais comum de câncer, ea oitava causa mais comum de morte por câncer em homens. Estima-se que 74.000 homens e mulheres serão diagnosticadas e 16.000 pessoas morrerão de cancro da bexiga até o final de 2015 [1]. Enquanto a maioria dos cânceres de bexiga apresentam como tumores não invasivos fase inicial, até um terço de doença invasiva não-músculo irá evoluir para doença invasiva muscular e metástase ao longo do tempo [2]. Apesar da eficácia da quimioterapia com cisplatina para o cancro da bexiga localmente avançado e metastático, a falta de durabilidade das respostas e a ausência de ponto de terapia de segunda linha para a necessidade de tratamentos mais eficazes [3, 4]. Crítica aos novos desenvolvimentos terapêuticos são a identificação de vias oncogênicos específicos com intervenções terapêuticas promissoras, bem como a identificação adequada dos pacientes que são susceptíveis de beneficiar de uma determinada terapia (terapia do cancro individualizado).
Níveis
A maioria dos cânceres de bexiga expressam elevados do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) [5,6,7]. EGFR modula o crescimento celular e a proliferação, bem como a regulação da expressão do gene, a angiogénese, a motilidade e a apoptose, resultando em aumento potencial maligno [8,9,10]. EGFR elevada é comum em cancros da bexiga primárias com cerca de 50% dos casos exibindo superexpressão [8]. Além disso, a maioria dos tumores metastáticos da bexiga foram mostrados para expressar EGFR [11]. Além disso, EGFR superexpressão parece ser um preditor negativo significativo da sobrevivência [5]. Assim, caminhos biológicos que aumentam o fator de crescimento sinalização através de EGFR são susceptíveis de contribuir para a bexiga progressão e metástase do câncer. ligandos de EGFR ligado às células, tais como a de ligação de heparina do factor de crescimento epidérmico (HB-EGF), anfirregulina, factor de transformação de crescimento alfa (TGFct) e betacelulina são conhecidos para ser libertado através da acção de proteases ligadas à membrana, incluindo membros do ADAM (proteína Adam) da família [12-14].
A família ADAM é composto por cerca de 40 proteínas, mas apenas uma atividade exposição proteolítica poucos [15-17]. Adams proteoliticamente activa, ou sheddases, o tráfego para a membrana de forma latente, que pode ser activado pelo derramamento proteolítica de um pró-domínio inibidor do terminal N [12,13]. Os cliva proteínas enzimaticamente activas e liberta várias proteínas da superfície das células fisiológicas incluindo membrana ancorada factores de crescimento e seus receptores, ecto-enzimas, e moléculas de adesão celular, tais como a E-caderina e N-caderina. Estas funções colocar ADAM específica em papéis fundamentais para a sinalização celular e a regulação da adesão celular e motilidade celular [12,15]. Vários ADAMs também têm sido implicados na tumorigénese humana [13,14,16,18,19] e o aumento da expressão e função destes ADAMs muitas vezes se correlacionam com a progressão do tumor e a agressividade da doença [18,20].
Uma do cataliticamente activo Adams, ADAM15, tem sido relatada a ser sobre-expressos em numerosas doenças malignas incluindo melanoma, cancro da próstata e cancro da mama [20,21]. A lista de substratos para ADAM15 inclui várias moléculas reguladoras celulares chave, incluindo E-caderina e N-caderina, desmogleínas e os ligantes de EGFR, Fator Transformador de Crescimento Beta (TGF), amphiregulin, epirregulina e HB-EGF [16,21,22]. O nível de sobre-expressão de ADAM15 no cancro da mama e da próstata tem sido correlacionada com a agressividade do tumor metastático e progressão [20]. Mostrámos que a inibição da expressão ADAM15 em células de cancro da próstata PC-3 reduziram o crescimento de tumores e metástases impedido [23]. Uma ligação entre ADAM15 e angiogénese também foi observado [24,25].
Os perfis biológicos e moleculares dos cancros da bexiga sugeriu que a sobre-expressão e activação de ADAM15 podem ser relevantes para a progressão desta doença. Em primeiro lugar, cancros da bexiga expressam níveis elevados de EGFR, onde a liberação local de ligantes de EGFR seria promover o crescimento do cancro da bexiga [5-7,11]. Em segundo lugar, a caderina-E, um outro substrato para ADAM15, foi encontrada na forma enzimaticamente processado em ambas as amostras de soro e de urina de pacientes de cancro da bexiga, que também correlacionados com o resultado clínico pobre [26,27]. , Progressão terceiro cancro da bexiga está estreitamente relacionada com a angiogénese [9,28-30], o que também pode ser afectada pela actividade biológica de ADAM15 [24,25].
ADAM15 está a emergir como um regulador potencial da microambiente do tumor e sua promessa para segmentação terapêutica está a aumentar. Uma análise preliminar da expressão no tecido ADAM15, linhas celulares e modelos de xenoenxerto de cancro humano (histologicamente semelhantes ao tumor primário) sugeriram o seu papel funcional na progressão de cancro da bexiga humano. No entanto, pouco se sabe sobre os níveis de expressão de ADAM15 em câncer de bexiga humana ou como ADAM15 pode funcionalmente mediar a invasão e metástase de células de câncer de bexiga. No estudo atual, partimos para validar a associação de expressão ADAM15 com câncer de bexiga humana avançada e estabelecer a participação funcional da ADAM15 na progressão desta doença.
Materiais e Métodos
celular cultura
linhas celulares de cancro da bexiga humana UM-UC-6 [31,32] e UM-UC-9 [32] foram obtidos a partir do originador (HB Grossman, da Universidade do Texas-MD Anderson cancer Center, Houston TX). SV-40 imortalizadas As células uroepiteliais Humano (SV-HUC-1) [33] foram um presente amável da CA. Reznikoft (Universidade de Wisconsin, Madison, WI). Estabelecidos células endoteliais da veia umbilical humana (HUV-EC-C) foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). As células foram utilizadas no interior da passagem de curto prazo e testado por polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição (RFLP) para autenticação (Research Diagnostic Laboratory Animal, Columbia, MO). As células foram mantidas em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM; Life Technologies, Grand Island, NY), com elevado teor de glucose, suplementado com soro inactivado pelo calor 10% fetal de bovino (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina (Life Technologies). As células HUV-EC-C foram mantidas em Meio de Crescimento de Células Endoteliais de EBM-2
TM (Lonza Inc., Allendale, NJ), suplementado com EGM ™ -2 BulletKit ™ (Lonza Inc.) e 10% de FBS
criação de linhas celulares ADAM15 knockdown
uM-UC-6 e uM-UC-9 células de câncer de bexiga ADAM15-knockdown foram gerados usando um lentivírus transportando knockdown RNA curto hairpin específicos de ADAM15 (shRNA) ( shA15) ou sequência de controlo de vector vazio e /ou mexidos sequência shRNA concebido como um controle para efeitos off-alvo (ctlA15), como já relatado anteriormente [22,23]. As sequências alvo para a frente e complementares para ADAM15 foram 5′-AACCCAGCTGTCACCCTCGAA-3 ‘e 5′-TTCGAGGGTGACAGCTGGGTT-3’.
Amostras de Pacientes
As amostras de tumores para este trabalho foram obtidos preservar a confidencialidade do paciente sob consentimento informado por escrito, da Universidade de Michigan tecido do cancro de bexiga Bank. Cada fonte é compatível com o protocolo Medical School Institutional Review Board aprovado (IRBMED HUM00042401). O tissue microarray composto por 110 núcleos em doentes com cancro da bexiga 37, e incluiu amostras de bexiga normal, bem como cancros da bexiga superficiais, invasivos e metastáticos.
isolamento de proteínas e Immunoblotting
As células foram colhidas por raspagem e o sedimento celular resultante foi lavada duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS), e congeladas a -80 ° C antes da extracção. As pelotas de células foram lisadas em tampão de lise (Tris 50 mM [pH 7,6], NaCl 120 mM, NP40 a 0,5%, EGTA 1 mM, 100 ug /ml de fluoreto de phenylmethysulfonyl, 50 ug /ml de aprotinina). Os extractos foram clarificados por centrifugação a 10.000 rpm durante 10 minutos, e os sobrenadantes foram recolhidos e proteína quantificada utilizando o ensaio de proteína de Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA). Os extractos celulares (20 ug /pista) foram então separadas em gradiente de pré-fundido de 4-20% de Tris-glicina SDS-poliacrilamida gel (Novex, Life Technologies, Carlsbad, CA) e transferidas para uma membrana de nitrocelulose de 0,2 pM reforçado (Merck, Billerica, MA). As membranas foram então bloqueados, sondados, e desenvolvido. O tampão de bloqueio consistiu de 10% de leite em pó magro em TBST (soro fisiológico tamponado com Tris com Tween 20 a 0,1%; Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO). incubações de anticorpos primários e secundários foram realizados em leite em pó desnatado 2,5% em TBST. Os anticorpos primários contra a GAPDH (anticorpo monoclonal de ratinho MAB374, lote 2322571, Merck, Billerica, MA) e ADAM15 (anticorpo policlonal de coelho AB19036, lote 2316790, Merck) foram utilizados a uma diluição final de 1: 10.000 e 1: 2.000, respectivamente. Os anticorpos secundários foram cabra anti-rato IRDye
TM 680RD 1: 5.000 (926-68070, muito C30502-01, Li-Cor, Lincoln, NE) e de cabra anti-coelho IRDye
TM 800CW 1: 10.000 ( C30521-01, muito C30521-01, Li-Cor). As membranas foram fotografadas com o Li-Cor Odyssey CLX
TM (Li-Cor, Lincoln, NE), seguindo as instruções do fabricante.
Imunohistoquímica
embebidos em parafina secções de tecido foram desparafinados e tratada com peróxido em metanol para bloquear o peróxido endógeno actividade. A recuperação de antígenos foi realizada utilizando recuperação de antigénios tampão citrato seguindo o procedimento do fabricante (Citra, Biogenex, San Ramon, CA). A imunocoloração foi realizada usando a coloração com complexo avidina-biotina (ABC, Vector Laboratories, Burlingame, CA). policlonal anticorpo primário de coelho para ADAM15 (AB19035, lote 0603024760, Merck) foi diluído 1:50 em 5% de FBS em PBS. Uma solução de isotipo de coelho pré-diluído (Life Technologies, Carlsbad, CA) foi utilizado como um controlo negativo. A reacção foi completada por desenvolvimento durante 5 minutos com substrato (3,3′-diaminobenzidina e peróxido). As lâminas foram então contrastadas com hematoxilina. As lâminas foram avaliadas por um patologista (LPK) e graduadas para a coloração de intensidade (numa escala de 1-4; 1 = negativo, 2 = fraco, 3 = intermédia, 4 = forte) e a percentagem de células tumorais de coloração. Um “score intensidade” (intensidade de coloração multiplicado pelo percentual de células marcadas) foi utilizado para comparar os resultados.
Cicatrização Ensaio
UM-UC-9 e células UM-UC-6 foram semeadas em pratos de 6 poços de cultura de tecidos e deixou-se atingir a confluência. A monocamada de células foi riscada com uma nova ponta de pipeta de 5 mL através do centro das cavidades para formar uma cruz. Depois de riscar, os poços foram lavados suavemente duas vezes com meio para remover as células destacadas e em seguida reposto com DMEM fresco suplementado com FBS a 10%. As fotografias foram tiradas e digitalizadas para documentar a fissura inicial. UM-UC-9 e UM-UC-6 células foram então incubadas durante 18-20 e 12 horas, respectivamente. As fotografias foram tiradas e digitalizadas para documentar a migração. A diferença de cura foi medida por Image Analysis Software
TM da Olympus (Olympus Corporation, Center Valley, PA).
Matrigel
TM Invasion Câmara Ensaio
BD BioCoat
TM Matrigel
TM Invasion Chambers (BD Biosciences, Bedford, MA) foram utilizados. As câmaras 24 cavidades foram re-hidratadas com PBS e ctlA15 e Sh15 UM-UC-9 ou UM-UC-6 as células foram semeadas sobre as câmaras, de acordo com o procedimento do fabricante (BD Biosciences). Um volume de 0,2 mL de suspensão de células contendo 1×10
5 células /ml em meio livre de soro foram adicionados a cada inserção. Um volume de 0,5 ml de DMEM mais 10% de FBS foi adicionado ao poço inferior. As câmaras foram incubadas a 37 ° C, 5% de CO
2 e atmosfera de UM-UC-9 e células de UM-UC-6 foram deixadas migrar contra um gradiente de soro durante um período de 24 ou 12 horas respectivamente. Após a incubação, as células não invasoras foram removidos a partir da superfície superior da membrana de inserção com aplicadores com ponta de algodão. As células na superfície inferior da membrana foram fixadas com formalina a 10% e coradas com violeta de cristal (BD Bioscience). A contagem das células foi realizada a partir de fotomicrografias de 3-5 campos por pastilha. Cada uma das linhas celulares foram ensaiadas pelo menos três vezes.
transendotelial Ensaio de Migração
BD BioCoat
TM inserções e placas de 24 poços (BD Biosciences) foram utilizados para o ensaio de migração transendotelial. A fibronectina foi adicionado ao revestimento de cada inserto (Sigma-Aldrich Co.) a uma concentração de 50 ug /mL. células endoteliais HUV-EC-C foram então semeadas sobre o inserto, a uma concentração de 1×10
5 células /250 pL de EBM-2 médio mais os suplementos. As células HUV-EC-C foram incubadas durante 48 horas para formar uma monocamada. UM-UC-9 e UM-UC-6, e ctlA15 shA15, as células foram mantidas por 24 horas e semeadas sobre a invasão insere a uma densidade de 1×10
5 células /250 ul de meio isento de soro. inserções de controlo foram carregadas com meio para avaliar o fundo migratório das células endoteliais. A câmara inferior foi preenchida com 300 mL de EBM-2 + 10% de FBS. As câmaras foram então incubadas para permitir que as células de tumor para migrar através da camada endotelial para um gradiente de soro. células de UM-UC-9 foram incubadas durante 24 e UM-UC-6 durante um período de 12 horas. As células não-Transmigratory foram removidos com um cotonete. Em seguida, as células tumorais migratórias foram fixadas com formalina a 10% e coradas com violeta de cristal e fotografado para quantificar a migração de células tumorais. Três campos por inserção foram fotografados e as células contou com assistência de ImageJ [34]. Cada condição foi executado em triplicado.
Design-base Estrutura de um Novel Chemical Inhibitor Segmentação do domínio catalítico da ADAM15
O sítio catalítico da ADAM15 é único e sugere a possibilidade de projetar sondas químicas novas que são selectivos para a actividade de metaloproteinase ADAM15. Esta abordagem levou à identificação inicial e validação do marimastat inibidor não-específico, como uma sonda estrutural com excelente previu ligação e potencial de inibição contra o local activo da ADAM15. Além disso modelação estrutural levou à identificação da bifenil sulfonamida inibidor de metaloproteinases, PD166793 [35], que é dotada com várias propriedades que o tornam um ponto de partida para a síntese do análogo atraente de sondas ADAM15. Projeto preliminar baseada na estrutura, tendo em conta as propriedades anfipáticas únicas do bolso do ADAM15 S1 ‘, nos permitiu projetar e sintetizar um novo composto de chumbo, adamastat, que é concebido como uma sonda seletivo para ADAM15. modos de ligação óptimas e as energias de ligação relativas do nosso metaloproteinases ADAM15 inibidor foi calculada utilizando o programa AutoDock Vina amplamente aceite para ancoragem molecular e da avaliação virtual [36] tal como representado na Tabela S1. Estes cálculos, prever que adamastat deve ligar-se selectivamente e com elevada afinidade ao sítio catalítico de ADAM15.
Transferência de Energia de Ressonância de Fluorescência (TERF) Ensaio
A actividade do domínio catalítico ADAM15 recombinante (A15cat) foi determinada utilizando ensaios de FRET base que medem a clivagem de um péptido substrato fluorogénico ADAM15. A inibição da actividade catalítica de A15cat por marimastat, PD166793 e adamastat foi determinada utilizando um péptido fluorogénico (DABCYL-HGDQMAQKSK (5FAM-NH2) derivado do local de clivagem ADAM15 no receptor de IgE de baixa afinidade (CD23) [37]. Nestas experiências o substrato a uma concentração de 1 ^ M foi incubada com A15cat recombinante (0,5? g /ml) durante 24 horas a 24 ° C em placas de 384 poços (Corning, Corning, NY) com inibidor em soluções salina tamponada com fosfato. a fluorescência foi medida utilizando um PHERAstar (BMG LABTECH Inc., Cary, NC) leitor de placas de fluorescência (excitação a 485 nm e emissão a 530 nm).
Proliferação celular Análise
Para estudar o efeito dos nossos knockdowns ADAM15 em proliferação celular, ctlA15 e shA15 uM-UC-9 e uM-UC-6, as células foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 1.000 e 500 células /poço, respectivamente, em 200 ul de meio. Os pontos finais foram avaliados após 12, 24, 48 e 72 horas de incubação.
de uma maneira semelhante, o efeito anti-proliferativo de adamastat foi analisadas por plaqueamento de SV-HUC-1, uM-UC-9 e células de uM-UC-6 em uma concentração de 2.000, 1.000 e 500 células /poço, respectivamente, em 100 ul de meio. As células foram deixadas a ligar durante a noite e tratada com 100 uL /poço de uma solução adamastat 2X (com 5 uM de concentração final) ou a concentração equivalente de DMSO como controlo do veículo. Por conseguinte, as células foram colocadas na incubadora durante 12, 24, 48, 72, 96 e 120 horas.
A proliferação celular foi avaliada em cada ponto de tempo por meio de um bio-redução da água de tetrazólio solúvel MTS (3- (4,5 -dimethylthiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) -2H-tetrazólio) de sal no seu produto de formazano por células metabolicamente activas [38]. Após a adição de 40 ul de metossulfato de MTS /fenazina (PMS) (20: 1) solução (Promega, Madison, WI), as células foram incubadas durante 2 horas a 37 ° C e a absorvência do produto de forma zan foi medida a 490 nm .
Viabilidade celular Análise
SV-HUC-1, uM-UC-9 e uM-UC-6 as células foram semeadas em placas de 96 poços a uma concentração de 2.000, 1.000 ou 500 células /poço, respectivamente, em 100 ul de DMEM mais FBS 10% (sem vermelho de fenol). A seguir à incubação durante 24 horas, as células foram tratadas com uma concentração final de 0,1% de DMSO (controlo de veículo), 0,1, 1, 10 ou 100 uM adamastat em 100 uL de meio e incubou-se durante 96 horas. Subsequentemente, 40 uL de solução de MTS /PMS foi adicionado a cada poço e a absorvância a 490 nm foi medida após 2 horas de incubação a 37 ° C [38]. O ensaio foi realizado em poços em triplicado. poços em branco, apenas a médio e 2,5 mM estaurosporina (Sigma-Aldrich Co.) foram incluídos como controles. A viabilidade celular (%) era avaliar como: (OD amostra-OD estaurosporina) /(OD médio OD estaurosporina) × 100.
crescimento tumoral em Imunodeficiência Combinada Grave (SCID)
Para estudar o efeito de silenciamento ADAM15 sobre o crescimento do cancro da bexiga, e ctlA15 shA15 células de uM-UC-6 foram inoculados por via subcutânea, a uma concentração de 1×10
6 células em ratinhos C57BL /6 SCID, em dois grupos de 10 ratinhos. Para determinar o tamanho da amostra para a adamastat
in vivo
experimentos foi utilizada a fórmula: (n = log 0,10 probabilidade de erro tipo II dividido por 95% de chance de detectar uma diferença de peso de 40% ou mais Log 0,10 dividida. pelo log 0,6 = 4,5 ratinhos por grupo), assim, o 5 ratinhos por grupo utilizado na experiência. Após 3 semanas, os ratinhos foram eutanizados e os tumores pesavam.
In vivo
eficácia de adamastat foi também determinada na UM-UC-6 xenoenxertos, onde 1×10
6 UM-UC-6 de células de tumor da bexiga foram injectados por via subcutânea no flanco de ratinhos SCID. À luz da disponibilidade oral adamastat predito, os animais foram tratados por via oral com adamastat após a iniciação do tumor (10 dias após a injecção). Os ratinhos foram separados em dois grupos de 5 animais e tratados diariamente com adamastat (100 mg /kg /dose) ou controlo de veículo (PBS) durante 3 semanas antes de necropsia. Cada tumor foi retirado e pesado ao mesmo postmortem tempo. A unidade experimental foi um tumor por rato e todos os tumores (100%) foram incluídos na análise.
O número de animais incluídos anteriormente foi derivada pela observação da quantidade mínima que poderia apresentar significância estatística sob a experimental condições. Todos os grupos foram separados aleatoriamente por gaiola. inoculação das células do cancro ou tratamento adamastat foi iniciado ao mesmo tempo. Os ratos não apresentaram perda de peso e não foram observados efeitos adversos devido a adamastast ou a técnica de sonda gástrica.
Os SCID usados neste estudo eram do sexo masculino e feminino, de 8 a 10 semanas de idade, criados pela Breeding Ulam Testemunho. Os animais foram alojados em uma instalação livre de patógenos em gaiolas ventiladas. Seu bem-estar foi avaliada diariamente pelos autores e ao pessoal veterinário da Universidade de Michigan.
Ética Declaração.
O cuidado e tratamento dos ratos foi avaliada pelo Comitê Universidade da Utilização e cuidados de Animais (UCUCA) e foi encontrado para ser de acordo com as diretrizes institucionais da Universidade de Michigan. Universidade de Michigan UCUCA aprovou esses estudos com animais por PRO00004867 protocolo. A inoculação de células de tumor foi realizada sob anestesia com isofluorano para minimizar o sofrimento. Todos os procedimentos de aderir aos CHEGAM diretrizes para relatar pesquisas com animais, conforme descrito no S1 CHEGAR Checklist.
Análise Estatística
Na análise de microsséries de tecido, um índice de coloração (intensidade pontuação multiplicada pela percentagem de células tumorais coloração) foi calculada para cada núcleo. Vários núcleos da mesma fase clínica a partir do mesmo paciente foram combinados em uma pontuação sumária que representa a média dos núcleos. Este resumo resultou em 48 pontos de dados (correspondendo a combinações únicas paciente-diagnóstico) para avaliação coloração ADAM15. A one-way ANOVA foi utilizado para comparar o índice de coloração estágio pontuação resumo. foram feitas todas as comparações de pares entre grupos utilizando o método de Tukey-Kramer para corrigir para comparações múltiplas. A fraqueza do modelo ANOVA é que pode haver correlação dentro do paciente que não é contabilizada com este método. Um modelo de medidas repetidas usando o índice de coloração para cada núcleo individualmente com estruturas de correlação para explicar os núcleos repetidas dentro do paciente e diagnóstico foi utilizado para verificar os resultados do modelo de pontuação resumo ANOVA. Este modelo quebrou pressupostos de normalidade, mas teve resultados semelhantes e as mesmas conclusões. Para simplificar, resultados da ANOVA são exibidos. Não pareado, 2 de cauda t-testes foram empregados para determinar se foram observadas diferenças estatisticamente significativas na cicatrização de feridas, invasão, migração, e
In vivo
rato experimentos de xenotransplante. Proliferação e viabilidade celular resultados foram avaliados por 2-way ANOVA e testes de comparação múltipla da Turquia. A análise foi realizada utilizando GraphPad Prism Software 6 (La Jolla, CA). Os dados foram considerados estatisticamente significativos a
p
. 0,05
Resultados
Expression ADAM15 está associada a invasão local e metastático progressão do cancro da bexiga humana
anteriormente, relatou que a expressão de ADAM15 foi associada com a progressão de cancros metastático da próstata e da mama [20]. No entanto, não tinha sido examinado o papel de ADAM15 na progressão do câncer de bexiga. Começamos este estudo de levantamento da TM Oncomine
(Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI) do banco de dados de expressão gênica para avaliar número de cópias de DNA e níveis de mRNA de ADAM15 em matrizes de câncer de bexiga humanos. Uma análise de 191 amostras revelou que número de cópias ADAM15 é significativamente elevada em estágio avançado N (N1 +) câncer de bexiga invasivo em relação à doença não-invasiva (N0). Dos 18,823 genes analisados, ADAM15 classificado como o 45
th mais alta no número de cópias ou no top 5% (Fig 1A). Ao analisar mais 3 estudos de transcriptoma independentes em Oncomine
TM (Sanchez, Lee e Blaveri), encontramos a superexpressão significativa de mRNA ADAM15 em infiltrar o cancro da bexiga em comparação com tecidos normais (Fig 1B).
Análise utilizando a Oncomine
TM (Compendia Bioscience) navegador gene.
A)
Boxplots resumir número de cópias média e desvio padrão (SD) de um gene do cancro da bexiga conjunto de dados de expressão. número de cópias ADAM15 foi elevada em câncer de bexiga invasivo (N1 +) em comparação com doença não-invasiva (N0).
B)
mRNA ADAM15 é sobre-expressos em câncer de bexiga invasivo em comparação com cancro da bexiga não invasivo. As barras representam os níveis de mRNA ADAM15 em três estudos de expressão de ARNm publicados diferentes.
C)
Microfoto- de ADAM15 imuno-coloração de um cancro de bexiga matrizes de tecido progressão. Três estágios patológicos são representados (tecido normal, não-invasivo, e câncer de bexiga invasivo).
D)
Boxplots representar o índice de coloração ADAM15 neste TMA como média ± SD. espécimes de câncer de bexiga invasivo e metastático apresentaram aumento significativo índice de coloração em comparação com doença não-invasiva.
A importância destas observações para a progressão do cancro da bexiga foi validado pela avaliação da expressão da proteína ADAM15 em amostras clínicas. A imunocoloração de uma micromatriz de tecido do cancro de bexiga foi realizada, mostrando a sobre-expressão focal específico de ADAM15 na maioria das amostras de cancro avançado da bexiga (invasivo e metastático). Em comparação, todas as amostras de cancro da bexiga de baixo grau não-invasivos e (27/27), exibiu índice de coloração baixa ADAM15 (0-2), enquanto 48% (27/56) dos invasiva e 72% (13/18) de os casos metastáticos exibiu moderado a elevado índice de coloração (2-4) (Quadro 1). Uma avaliação mais perto histológica revelou que ADAM15 localiza no urotélio normal com uma coloração altamente organizada nas junções celulares e aumento da positividade na superfície luminal das células guarda-chuva (Fig 1C). Em contraste, amostras de cancro invasivos apresentaram uma coloração mais desorganizado e citoplasmático de ADAM15. O ADAM15 imuno-positividade aumentou em estágio avançado (Fig 1D) e foi significativamente maior que os tumores progrediram de não invasivo para doença invasiva e metastática. Tomados em conjunto, estes resultados demonstraram que ADAM15 superexpressão está intimamente associada com a invasão local e progressão metastática do câncer de bexiga humana.
Knockdown de ADAM15 Diminui migração de células do cancro de bexiga
motilidade celular é necessário para a invasão pelo tumor e metástases. Nós investigamos a expressão endógena de ADAM15 em dois modelos de células de câncer de bexiga e analisado se a redução na expressão ADAM15 inibe a motilidade celular tumor da bexiga. Utilizando as linhas de carcinoma de células transicionais da UM-UC-9 e UM-UC-6 [31,32], avaliou-se o nível de proteína ADAM15 por análise de imunotransf erência usando um anticorpo específico contra ADAM15-citoplasmática. UM-UC-9 e UM-UC-6 células de câncer de bexiga expressas níveis moderados de proteína ADAM15 quando normalizado aos controles GAPDH carregamento (Fig 2A, S1 e S2 Fig FIG).