Abstract

O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito quimiopreventivo de um romance de flavonóides, ampelopsina (AMP) sobre o crescimento e metástase de células cancerosas da próstata. AMP mostrou a actividade mais potente na inibição da proliferação de células LNCaP sensíveis ao androgénio e, em menor grau, as linhas celulares de cancro de PC-3 humano da próstata independente de androgénios, in vitro, principalmente por indução de apoptose associada com a sub-regulação de Bcl-2. Por outro lado, a AMP mostraram muito menos actividade na inibição da proliferação de células epiteliais normais da próstata do que de linhas celulares de cancro da próstata. AMP também inibiu a migração e a invasão de células PC-3 in vitro associadas com a regulação negativa da expressão de CXCR4. No estudo com animais utilizando um modelo ortotópico de tumor da próstata, AMP (150 e 300 mg /kg de peso corporal) inibiu o crescimento de tumores PC-3 e nó de linfa e metástases pulmonares de um modo dependente da dose. Em comparação com os murganhos de controlo, murganhos tratados com a AMP em 300 mg /kg de peso corporal tinha reduzido o peso final do tumor em 49,2% (P 0,05), de linfonodo metástases em 54,5% (P = 0,3) e as metástases pulmonares em 93% (p 0,05), mas não apresentaram alteração aparente na ingestão de alimentos ou de peso corporal. As actividades in vivo anti-crescimento e anti-metástases de AMP foram associadas com a indução de apoptose e inibição da proliferação de células de cancro da próstata, a redução de angiogénese de tumor da próstata, e redução da expressão de CXCR4. Nossos resultados fornecem provas para justificar uma investigação mais aprofundada para desenvolver AMP como um novo agente candidato eficaz e segura contra a progressão e metástase de câncer de próstata

Citation:. Ni F, Gong Y, Li L, Abdolmaleky HM, Zhou JR (2012) flavonóides ampelopsina inibe o crescimento e metástase do câncer de próstata in vitro e em camundongos. PLoS ONE 7 (6): e38802. doi: 10.1371 /journal.pone.0038802

editor: Rakesh K. Srivastava, The University of Kansas Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 27 Dezembro, 2011; Aceito: 10 de maio de 2012; Publicação: 05 de junho de 2012

Direitos de autor: © 2012 Ni et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela Fundação do Ministério da Saúde United Fujian Provincial de Saúde e Educação (WKJ2008-2-60), Fundação de Fujian Departamento Provincial de Ciência Tecnologia (2011Y0015) e Fundação de Pesquisa Científica de Exploração de Tecnologia Industrial de Desenvolvimento Fujian e Comissão de Reforma (2008-762) para FN, eo Departamento de Defesa (PC073988) e NCI /NIH (R21 CA133865) para JRZ. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do menuscript

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

câncer

próstata é o tumor maligno invasivo mais comum ea segunda principal causa de morte por câncer em homens em os EUA Estima-se que 241,740 novos casos de cancro da próstata seriam diagnosticados e cerca de 28.170 homens morreriam de câncer de próstata nos Estados Unidos em 2012 [1]. modalidades terapêuticas atuais para o câncer de próstata geralmente têm eficácia variável, desenvolver metástase e resistência aos medicamentos, e tem alta toxicidade para tecidos normais. Portanto, a busca por regimes eficazes com efeitos adversos moderados para a intervenção quimiopreventivo de câncer de próstata continua a ser a prioridade máxima na pesquisa do câncer de próstata.

componentes bioativos em plantas e ervas medicinais podem fornecer aos candidatos eficazes e seguros para quimioprevenção e /ou terapia do cancro. textos médicos clássicos chineses contêm extensas registros empíricos de terapias botânicos utilizados para tratar pacientes com câncer e sistemas relacionados com o cancro. No entanto, a maioria destas fórmulas botânicas candidato são recomendados com base em apenas observações clínicas. Além disso, estas observações clínicas eram quase sempre a partir de estudos observacionais não controlados, ou relatos de casos anedóticos. Até muito recentemente, tem havido esforço limitado para desenvolver avaliação pré-clínica, mecanicista, científica dos produtos à base de plantas botânicas como um pré-requisito para estudos clínicos em humanos.

A erva chinesa

Ampelopsis grossedentata

é amplamente distribuída no Sul da China e é usado para tratar a frio e tinea corporis. Ele contém uma rica fonte de fitoquímicos com ampelopsina (AMP, (2R, 3R) -3,5,7-tri-hidroxi-2- (3,4,5-trihydroxyphenyl) -2,3-dihydrochromen-4-ona) a maior flavonóides. AMP é também chamado dihydromyricetin e tem uma estrutura semelhante à miricetina (3,5,7-tri-hidroxi-2- (3,4,5-trihydroxyphenyl) -4-chromenone), um flavonóide de ocorrência natural encontrado em uvas, bagas, frutos, legumes, ervas e outras plantas com determinadas actividades anti-câncer. Como o principal constituinte bioativo de

Ampelopsis grossedentata,

AMP mostrou ser o principal responsável pelas atividades biológicas relatadas, incluindo hipoglicemia [2], anti-oxidativo [3], [4] e hepatoprotetor [4], [5] actividades. AMP também aumentou os efeitos quimiocinese e quimiotaxia de granulócitos neutrófilos e monócitos [6].

AMP foi demonstrado possuir determinadas actividades anti-câncer. AMP inibiu o crescimento [7] e invasão de células de melanoma in vitro [8], [9], e metástase inibida de tumor de melanoma in vivo, [8], [9]. AMP inibiu o crescimento de tumores pulmonares in vivo por inibição da proliferação [10]. AMP tinha actividade anti-angiogénese através da inibição da secreção de factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) e factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF) a partir de células de carcinoma hepatocelular humano in vitro e também inibiu o crescimento do carcinoma hepatocelular humano em ratos [11]. AMP também inverteu a resistência a múltiplos fármacos em células de leucemia in vitro, em parte, através de diminuição da expressão da P-glicoproteína [12]. Por outro lado, o efeito da AMP sobre o crescimento e progressão do câncer de próstata não foi estudado.

Os objetivos deste estudo foram avaliar sistematicamente AMP como quimiopreventivo potencial e candidato terapêutico contra a progressão do câncer de próstata, utilizando tanto in vitro como in vivo em sistemas, e para elucidar os mecanismos celulares e moleculares subjacentes de acções AMP. Nossos resultados fornecidos evidência experimental para apoiar o desenvolvimento futuro da AMP como um agente candidato eficaz e seguro para a prevenção e /ou tratamento de câncer de próstata.

Resultados

Efeitos da AMP, extrato de flavonóides totais (TFE) e miricetina sobre a proliferação de linhas de células de cancro da próstata e células epiteliais de próstata normais (PrEC) in vitro

primeira comparou a actividade entre os AMP, de TFE e miricetina na inibição da proliferação de linhas celulares de cancro da próstata e PrEC. A análise da pureza AMP por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) mostrou que o AMP pureza foi de cerca de 95%, e o cromatograma de HPLC representativo foi demonstrado na Fig. S1. TFE concentrações foram calculadas com base no seu nível de AMP, assim, a diferença de actividade entre TFE e AMP é atribuído a outros fitoquímicos em TFE. Como mostrado na Fig. 1 (A, B, C), AMP e TFE mostrou as actividades semelhantes na inibição da proliferação de células de cancro da próstata ou células da próstata normais, sugerindo que o AMP é a principal flavonóide bioactivo em TFE. AMP ou TFE inibiu a proliferação de linha celular LNCaP no ic

50 de cerca de 25 uM (Fig. 1A), e que de linha de células PC-3 no ic

50 de cerca de 60 uM (Fig. 1B). Por outro lado, AMP ou TFE mostraram muito menos actividade na inibição da proliferação de células epiteliais de próstata normais do que a de linhas de células de cancro de próstata (fig. 1C), sugerindo que o AMP ou TFE pode ter efeito secundário moderado /mínima.

a: os efeitos dose-dependentes da AMP, TFE e miricetina sobre a proliferação de linha celular LNCaP sensível ao andrógeno; B: Os efeitos dose-dependentes da AMP, TFE e miricetina sobre a proliferação da linha de células PC-3 independente de androgénios; C: Os efeitos dose-dependentes da AMP, TFE e miricetina sobre a proliferação de PrEC. Os valores são médias ± SEM de pelo menos três experiências independentes, cada uma em triplicado.

Em contraste, miricetina mostraram actividade mais potente na inibição da proliferação de PrEC do que a de LNCaP ou PC-3. Embora miricetina inibiu o crescimento das linhas celulares de cancro da próstata no ic

50 60 uM (Fig. 1A, 1B), inibiu as células PrEC crescimento no ic

50 cerca de 35 uM (Fig 1C). Devido à actividade anti-câncer potente e efeitos colaterais mínimos da AMP, foi utilizado para avaliação posterior.

Efeitos da AMP na progressão do ciclo celular de linhas celulares de cancro da próstata in vitro

AMP na 25 e 50 uM aumentaram significativamente a fracção de células LNCaP na fase S de 20% a 28% (P 0,05) e 74% (P 0,001), respectivamente (Fig. 2B). Por outro lado, a AMP em 25 e 50 uM aumentou a fracção de células PC-3 na fase S de 22% para 28% (P 0,05) e 34% (P 0,05), respectivamente (Fig. 2E), e em G2 M fases de 17% a 23% (p 0,05) /e 24% (p 0,05), respectivamente (Figura 2F).

A, B, e C:. O efeito dose-dependente do AMP sobre a distribuição de células de LNCaP em G1 (a), S (B) e G2 /M (C) as fases; D, E, e F: O efeito dose-dependente do AMP sobre a distribuição de células PC-3 em G1 (D), S (E) e /fases G2 e M (F). Os valores são média ± SEM de três experiências independentes, cada uma em duplicado. Dentro do painel, o valor com uma carta é significativamente diferente da do controlo, a, p 0,05; b, p 0,01; c, p . 0.001

Vários biomarcadores relacionados ciclo celular, como o ciclo de divisão celular 2 (CDC2), Cdc25C, ciclina B1 e quinase 2 (CDK2) dependente da ciclina, foram determinados por Western blot análise. AMP nível significativamente subregulado proteína CDK2 em células LNCaP (Fig. 3B, 3C) e CDC2 nível de proteína em células PC-3 (Fig. 3E, 3F), mas não outros biomarcadores relacionados ciclo celular.

A e D : o efeito dose-dependente do AMP sobre a percentagem de fragmentação do ADN (sub-L

0), um marcador de apoptose, em células LNCaP (a) e PC-3 (D) as linhas celulares; B e E: As imagens de transferência de Western representativa mostrando os efeitos do AMP sobre os níveis de proteína de progressão do ciclo celular e apoptose relacionado biomarcadores em LNCaP (B) e linhas de células (E) PC-3; C e F: A quantificação dos níveis da proteína significativamente alterada em LNCaP (C) e linhas celulares de PC-3 (F) por densitometria após a normalização para a p-actina. As imagens para quantificação foram a partir de pelo menos duas experiências independentes. Os valores são média ± SEM de três experiências independentes, cada uma em duplicado. Dentro do painel, o valor com uma carta é significativamente diferente da do controlo, a, p 0,05; b, p 0,01; c, p . 0.001

Efeitos da AMP na indução de apoptose em linhas celulares de cancro da próstata in vitro

AMP fragmentação também aumentou significativamente DNA de células de câncer de próstata, um marco para a apoptose. AMP a 25 e 50 uM fragmentação de ADN induzida significativamente de células LNCaP de 15 vezes (P 0,001) e 70 vezes (P 0,001), respectivamente (Fig. 3A), e as células por 86% PC-3 (P 0,05 ) e 270% (P . 0,001) respectivamente (Figura 3D), em comparação com os controlos correspondentes. As células LNCaP foram ainda tratados com AMP na 25 e 50 uM e biomarcadores moleculares relacionados à apoptose foi determinada por análise de Western blot. AMP a apoptose induzida de LNCaP e células PC-3 associados com a regulação negativa da proteína Bcl-2 (Fig. 3B, 3C, 3E, 3F).

O efeito de indução da apoptose do AMP na linha de células PC-3 foi ainda confirmada usando o fluxo de Anexina V-PI ensaio de citometria. AMP mostrou dose e efeitos dependentes do tempo na indução de PC-3 apoptose celular (Fig. S2).

Efeitos da AMP sobre migração e invasão de PC-3 células e regulação baixa do nível de proteína CXCR4 in vitro

a linha de células PC-3 foi usado para avaliar o efeito do AMP sobre a migração de células de cancro da próstata e invasão. AMP a 25 e 50 uM a migração celular significativamente inibida PC-3 em 26% (P 0,05) e 63% (P 0,01), respectivamente (Fig. 4A), e invasão por 27% (P 0,05) e 45% (P 0,01), respectivamente (Figura 4B.). O efeito inibidor do AMP sobre a migração de células PC-3 e invasão foi associada com regulação negativa de nível de CXCR4 proteína (Fig. 4C, 4D), um biomarcador importante para a invasão de células cancerosas e metástases. Sob a condição experimental (tratamento de 16 h), AMP não provocou citotoxicidade celular PC-3, tal como medido pelo ensaio de azul de tripano (Fig. S3). Ele sugere que os anti-imigração e anti-invasão observadas atividades da AMP não são secundariamente devido à sua cytotixicity

A:. O efeito dose-dependente de AMP sobre a migração de células PC-3; B: O efeito dose-dependente de AMP na invasão de células PC-3; C: O efeito dose-dependente do AMP sobre os níveis de proteína de CXCR4 nas células PC-3; D: A quantificação dos níveis de proteína de CXCR4 nas células PC-3 por densitometria após a normalização para a p-actina. Os valores são média ± SEM de três experiências independentes, cada um em duplicado. Dentro do painel, o valor com uma carta é significativamente diferente da do controlo, a, p 0,05; b, p 0,01; c, p . 0,001

Efeitos do AMP sobre o crescimento e a metástase de tumores PC-3 da próstata independente de androgénios e modulação da proliferação de células de tumor, apoptose e CXCR4 expressão e angiogénese do tumor em ratinhos

Um modelo animal de tumor PC-3 ortotópico foi usada para avaliar o efeito do AMP sobre a prevenção do crescimento e metástase do tumor da próstata. AMP inibiu o crescimento tumoral e metástases in vivo de um modo dependente da dose. AMP a 150 e 300 mg /kg de peso corporal reduziu o peso final do tumor em 28% (P 0,05) e 52% (P 0,05), respectivamente (Fig. 5A), linfa inibida nodos metástases em 27% (P 0,05) e 43% (P 0,05), respectivamente (Fig. 5B), e metástases pulmonares inibidos em 57% (P 0,05) e 86% (p 0,05), respectivamente (Figura 5C.). As imagens representativas de metástases do pulmão são mostrados na Fig. S4. Por outro lado, os tratamentos de AMP não alterou significativamente a ingestão de alimentos total (Fig. 5D) ou em peso corporal final (Fig. 5E).

Os valores são média ± SEM grupo (n = 8 /grupo). Dentro do painel, o valor com uma carta é significativamente diferente da do controlo, um, p. 0,05

As análises de marcadores celulares revelou que o tratamento com AMP induziu significativamente a apoptose de células de cancro da próstata em 200% (Fig. 6A, P 0,001), reduziu a proliferação de células de cancro da próstata em 60% (Fig 6B, P . 0,001) e angiogénese de tumor da próstata inibida em 58% (Fig. 6C, P 0,05). Estes resultados confirmaram que o AMP inibiu o crescimento de tumores da próstata através da indução de apoptose, reduzindo a proliferação, e a inibição da angiogénese do tumor da próstata in vivo. As imagens representativas de biomarcadores celulares são apresentados na Fig. S5. O tratamento AMP também reduziu a expressão da proteína CXCR4 em 30% nos tumores de próstata (Fig 6D, P . 0,05).

Os valores são média do grupo ± SEM (n = 8 /grupo). Dentro do painel, o valor com uma carta é significativamente diferente da do controlo, a, p 0,05; c, p . 0.001

Discussão

No presente estudo, descobrimos que AMP inibiu significativamente a proliferação de linhas celulares de cancro da próstata através da indução de apoptose relacionado com a regulação negativa da expressão de Bcl-2, e migração de células de cancro da próstata suprimida e invasão associada com regulação negativa da expressão de CXCR4 in vitro. O estudo em animais confirmaram ainda que o AMP reduziu significativamente o peso final do tumor associada com a indução de apoptose de células de cancro da próstata, a inibição da proliferação de células de cancro da próstata e da redução da angiogénese de tumor da próstata, e metástases pulmonares significativamente inibida. Por outro lado, a AMP em doses eficazes não mostrou efeito adverso significativo sobre a ingestão de alimentos ou de peso corporal. Este é o primeiro estudo, tanto quanto é do nosso conhecimento, que demonstraram o efeito inibidor do AMP sobre o crescimento e metástases de cancro da próstata in vitro e num modelo de tumor ortotópico clinicamente relevante.

estudos mecanismo celular que mostrou AMP inibiu a proliferação de células cancerosas da próstata. Curiosamente, AMP preso células LNCaP em fase S (Fig. 2B), em parte, através de regulação para baixo dos CDK2 (Fig. 3B, 3C), um essencial biomarcador para a transição G1 /S, que é preso células PC-3 no S e G2 /M fases (Fig. 2E, 2F) associada com regulação negativa de CDC2 (Fig. 3E, 3F). CDC2, também conhecido como CDK1 (cinase dependente de ciclina 1), desempenha um papel importante durante o progresso do ciclo celular. CDC2 geralmente combina com ciclina B e regula o S e G2 /progressão fase M. CDC2 tem sido considerada como um alvo molecular essencial para a concepção de fármacos anti-cancro terapêuticas [13]. A sub-regulação de CDC2 pode proporcionar um importante mecanismo molecular que prende AMP progressão do ciclo celular de células PC-3 a S e G2 /M fases. Análise de amostras de tumor in vivo também confirmou que o crescimento do tumor inibido AMP PC-3 está relacionado com a inibição da proliferação de células de tumor (Fig. 6B).

A indução de apoptose de células de cancro da próstata é também um importante mecanismo pelo qual AMP inibem o crescimento do cancro da próstata. AMP a apoptose induzida de células de cancro da próstata in vitro (Fig. 3A, 3D) e in vivo (Fig. 6A). Investigações posteriores mostraram que a indução de apoptose foi associada a regulação para baixo dos níveis de proteína Bcl-2 (Fig. 3C, 3F). Bcl-2 é um regulador importante da apoptose. Expressão de Bcl-2 é mais frequente em tumores de alto grau e metástases do que em menor grau e os tumores não-metastáticos [14], [15]. A resistência à apoptose está associada com níveis mais elevados de Bcl-2 [15], [16], e a regulação negativa da proteína Bcl-2 sensibiliza as células de cancro da próstata para sofrer apoptose [17]. Portanto, a regulação negativa de Bcl-2 pode representar um importante mecanismo molecular pelo qual AMP induz a apoptose do cancro da próstata.

A angiogénese é um passo crítico no crescimento tumoral [18]. O crescimento de todos os tumores sólidos depende de angiogénese e supressão de vasos sanguíneos do tumor oferece um novo opção para a prevenção e tratamento de cancro [19]. Estudos anteriores mostraram que o AMP tinha actividade anti-angiogénese através da inibição da secreção de factor de VEGF pró-angiogénico e bFGF a partir de células de carcinoma hepatocelular humano in vitro [11]. Neste estudo, foi demonstrado que o AMP inibiu o crescimento de PC-3 de tumor da próstata relacionado com a inibição da angiogénese do tumor (Fig. 6C). Embora nós não medir o VEGF e bFGF níveis in vivo, os nossos resultados forneceram evidência experimental sugere que a apoiar um dos mecanismos pelos quais AMP inibe o crescimento do tumor é através de inibição de angiogénese. É necessária mais investigação para determinar os mecanismos moleculares subjacentes que AMP inibe a angiogênese tumoral.

Estudos anteriores demonstraram que a AMP inibiu a invasão in vitro e in vivo a capacidade de metástase de melanoma B16 [8]. No entanto, não foi estudado se AMP tinha actividade anti-cancro da próstata em metástase. Os nossos resultados demonstraram que o AMP tinham actividades potentes na inibição da migração e invasão de células cancerígenas da próstata in vitro e metástases de cancro da próstata no modelo animal de tumor da próstata ortotópico associada com regulação negativa da expressão de CXCR4. CXCR4 está envolvido em várias doenças, tais como angiogénese, distúrbios metabólicos e neurológicos, artrite reumatóide e em diferentes formas de cancro metastático. CXCR4 é um factor crítico para a capacidade de invasão e proliferação de células de cancro da mama [20], [21], [22] e desempenha um papel essencial para o crescimento de tumores malignos e neuronal da glia [23]. inibidores CXCR4 são sugeridos para o tratamento de diferentes formas de cancro metastático [24], [25], [26]. AMP é mostrado ser um antagonista de CXCR4 pequena molécula [27], [28]. Embora não se estudar o CXCR4 era um alvo molecular para directa de AMP, os nossos estudos sugerem que um dos mecanismos moleculares pelos quais o AMP inibe a metástase do cancro de próstata pode ser através de regulação negativa da expressão e função de CXCR4. Outras investigações na aplicação AMP e /ou seus derivados como agentes anti-metástase inovadoras para retardar e /ou prevenir a metástase do câncer poderia ter impactos significativos na prevenção e terapia de câncer.

Em conclusão, os resultados deste estudo forneceu evidência experimental extremamente importante para sugerir que AMP pode ser um novo agente eficaz e seguro candidato para inibir o crescimento e metástase de câncer de próstata.

declaração Materiais e Métodos

Ética

Todos os procedimentos com animais foram revistos e aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional animal no Beth Israel Deaconess Medical Center com o Guia para o Cuidado e Uso de animais de laboratório.

TFE, AMP e miricetina

Um procedimento de extracção proprietária foi aplicado para extrair TFE a partir de

Ampelopsis grossedentata

com teor de AMP em aproximadamente 80%. AMP foi purificado a partir de TFE por HPLC preparativa; e a pureza foi verificada por HPLC de fase inversa analítica. Miricetina foi adquirido a LKT Laboratories (St. Paul, MN). A análise por HPLC foi usada para verificar a qualidade dos materiais. Todos os materiais foram dissolvidos em dimetil sulfóxido (DMSO) para estudos de culturas celulares.

Cultura de células de cancro da próstata, células epiteliais de próstata normais e células endoteliais

Duas linhas celulares de cancro de próstata humanas, andrógeno-sensível LNCaP e independente de androgénios PC-3 (American Type Culture Collection, Bethesda, MD) foram utilizadas para as experiências in vitro. linhas celulares de cancro da próstata humano foram mantidas como culturas em monocamada em meio DMEM suplementado com 10% de soro bovino fetal, 2 mmol L-glutamina /mL, 100 U de penicilina /ml e 100 ug de estreptomicina /mL em 95% de ar, 5% de CO

2 e atmosfera saturada de água. PrEC células foram adquiridos a partir de Lonza (Walkersville, MD) e cultivadas em PrEGM mais EGM-2 singlequotes (Lonza, Walkersville, MD) numa atmosfera humidificada de 95% de ar e 5% de CO

2.

o crescimento celular

o efeito de AMP, TFE e miricetina sobre a citotoxicidade de células de cancro da próstata ou PrEC foi determinada utilizando o Cell Titer 96 Aqueous Ensaio de Proliferação celular (Promega, Madison, WI) como descrito anteriormente [29] . O ensaio determina o número de células viáveis ​​em proliferação, citotoxidade e quimiossensibilidade. Todos os ensaios foram repetidos de forma independente, pelo menos, três vezes, cada uma em triplicado, e os resultados foram confirmados por contagem celular directa usando um hemocitómetro.

Análise da progressão do ciclo celular do cancro da próstata e fragmentação de ADN

O efeito de tratamento do AMP sobre a distribuição do ciclo celular de linhas celulares de cancro da próstata foi determinada por citometria de fluxo, seguindo os procedimentos descritos [30]. As células tratadas com diferentes concentrações de AMP foram colhidas, coradas com iodeto de propídio (a uma concentração final de 50 ug /mL) e RNase (a uma concentração final de 50 ug /ml), e incubou-se a 37 ° C durante 30 min. As células coradas foram depois analisadas por FACScan (Becton Dickinson, Sistemas Immunocytometry, Mountview, CA) para a distribuição do ciclo celular e ADN fragmentado. Os experimentos foram independentemente repetido pelo menos três vezes, cada uma em duplicado.

anexina V e coloração PI para detecção de apoptose

O efeito da AMP sobre a apoptose de células PC-3 foi ainda determinada por anexina kit de detecção de apoptose V-PI (Chemicon International Inc, Billerica, MA) seguindo as instruções do kit. Resumidamente, as células PC-3 tratadas foram ressuspensas em solução de Anexina V e incubada à temperatura ambiente durante 15 min, PI foi então adicionado para uma outra incubação de 5-min, no escuro. As células apoptóticas foram analisadas por citometria de fluxo (Becton Dickinson, Sistemas Immunocytometry, Mountview, CA). Os experimentos foram realizados de forma independente, pelo menos, duas vezes, cada uma em duplicado.

Ensaios

migração de células cancerosas e invasão

Uma suspensão de células PC3 (6000 células para a migração e 30000 células para a invasão) em 250 mL de DMEM isento de soro com AMP ou veículo (DMSO) foi carregada numa inserção revestidos por fibronectina em ensaio de migração ou uma pastilha revestida de Matrigel para ensaio de invasão (Biocoat, placa de 24 poços, 8 mm, Becton Dickinson). Cada inserção de cultura foi colocada num poço contendo 750 ul de DMEM com FBS a 5%. Após incubação durante 16 horas a 37 ° C, as células na parte superior de insertos foram removidos cuidadosamente, utilizando uma ponta de algodão, e as células no lado inferior da membrana foram coradas com inserção soluções de coloração Diff-Quick (Dade Behring Inc., Newark, DE) e as imagens foram capturadas. As células foram contadas sob um microscópio. Todos os ensaios foram realizados de forma independente, pelo menos, três vezes, cada uma em triplicado.

Para confirmar que o anti-imigração e anti-invasão atividades da AMP não estavam em segundo lugar, devido à sua citotoxicidade para as células PC-3, as células PC-3 foram tratados com AMP (0, 25, e 50 uM), durante 16 horas, e os números de células foram medidos por ensaio de exclusão de azul de tripano. A experiência foi realizada de forma independente, pelo menos, três vezes, cada uma em duplicado.

análise Western blot

Para o estudo in vitro, as células foram tratadas com diferentes concentrações de AMP, foram preparados lisados ​​celulares e de proteínas foram determinados por análise de Western blot, seguindo os procedimentos de nós descrito anteriormente [31]. Os anticorpos primários utilizados na transferência de Western contra antigénios humanos foram as seguintes: ciclina B1 (1:200), cdc2 (1:500) e Bax (1:500) (Oncogene Research Products, Boston, MA), Bcl-2 (1 :100), p21 (1:200) e p53 (1:500) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), CDK2 (1:1,000) (Selleck Chemicals, Houston, TX), CXCR4 (1:200) ( R D systems, Inc., EUA), e β-actina (1:10,000) (Merck Co., Darmstadt, Alemanha). Para o estudo in vivo, amostras de tumores em ambos os grupos controle e tratados com AMP foram coletadas para análise de Western blot do nível de proteína CXCR4.

estudo animal

A atividade de intervenção quimiopreventivo da AMP na crescimento e metástase de tumores PC-3 foi determinada num modelo animal de tumor PC-3 ortotópico. ratos macho combinada grave imuno-deficiente (6-8 semanas de idade) foram adquiridos a Taconic (Germantown, NY) e alojados na instalação para animais de Beth Israel Deaconess Medical Center em um ambiente livre de organismos patogénicos equipado com exaustores de escoamento laminar e o padrão gaiolas de vinil com filtros de ar. Após uma semana de aclimatação e adaptação à dieta AIN-93, os ratinhos foram distribuídos aleatoriamente para um dos três grupos experimentais seguintes (em cada grupo, n = 8) e pré-tratados por meio de sonda diariamente durante 2 semanas: (i) Controlo: o veículo (óleo de milho 100 mL); (Ii) AMP a 150 mg /kg de peso corporal (PC); e (iii) AMP a 300 mg /kg de peso corporal. Cada ratinho foi, em seguida, implantadas ortotopicamente com células PC-3 (2 × 10

6 células /50 ul) e continuou nos tratamentos correspondentes em toda a experiência. A ingestão de alimentos eo peso corporal foram medidos semanalmente. No final da experiência (8 semanas após a implantação de células PC-3), os ratinhos foram sacrificados; tumores primários foram excisados ​​e pesados. Uma fatia de tumor a partir de cada tecido do tumor primário foi cuidadosamente dissecados e fixados em formalina a 10% neutralizada-tampão, incluídos em parafina e seccionados a 4 mm de espessura para imuno-histoquímica. Todos os procedimentos com animais foram revistos e aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional animal no Beth Israel Deaconess Medical Center com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório [32]. O estudo animal foi repetido.

A detecção in situ do índice de apoptose

As células apoptóticas foram determinados por um ensaio desoxinucleotidil do terminal mediada-transferase desoxiuridina trifosfato-biotina nick rotulagem final (TUNEL) (Chemicon International Inc , Billerica, MA), seguindo os nossos protocolos descritos [30], [33], [34]. Seis áreas representativas de cada secção, sem necrose foram seleccionados e ambas as células apoptóticas e células núcleos totais foram contados sob um microscópio de luz a 400 x de ampliação. O índice apoptótico foi expressa como a percentagem de células apoptóticas tumorais positivos para células tumorais totais, e o efeito do tratamento sobre a apoptose foi expressa como a percentagem do controlo.

Determinação imuno-histoquímica de proliferação de células tumorais

o índice de proliferação foi avaliada calculando a percentagem de células com coloração Ki-67, seguindo os procedimentos de laboratório em [31]. Ambos proliferação e células tumorais totais Ki-67-positivas foram contadas em seis áreas não necróticas de cada seção usando microscópio de luz em 400 × ampliação. O índice de proliferação foi calculada como a percentagem de células tumorais Ki-67-positivas às células tumorais totais, e o efeito do tratamento sobre a proliferação foi expressa como a percentagem do controlo.

detecção imuno-histoquímica de densidade de microvasos (MVD )

MVD foi usada como um marcador para a angiogénese tumoral e quantificado por coloração imuno-histoquímica do factor VIII a seguir o nosso método anteriormente descrito [30], [33], [34]. MVD foi calculada pela contagem microvasos em 200 × campos sob microscopia de luz em seis locais representativos sem necrose de cada seção, e o efeito do tratamento sobre a angiogênese foi expressa como a percentagem para o controle.

A análise estatística

Os resultados foram expressos como médias de grupo ± SEM e analisadas para significância estatística por análise de variância [35] seguido por protegido da diferença mínima significativa de Fisher com base em comparações de dois laterais entre os grupos experimentais utilizando Statview programa 5.0 (SAS Institute, Inc. , Cary, NC). A

P Art 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Informações de Apoio

Figura S1..

O cromatograma representativo que mostra a pureza da AMP por HPLC de fase inversa analítica. HPLC condições experimentais foram: Instrumento: Waters 2695 com auto-amostrador ea matriz foto diodo (PDA) detector; coluna de HPLC: Phenomenox C-18 (5 m de diâmetro interno, 10 × 250 mm); Fases Móveis: A (H

2O com 0,1% de ácido acético) e B (acetonitrilo); condição Gradiente: 0-30 min, 5% de B até 35% de B; 30-35 min, 35% de B até 95% de B; 35-40 min, 95% B a 5% de B; 40-45 min, 5% de B; Taxa de fluxo:. 1 ml /min

doi: 10.1371 /journal.pone.0038802.s001

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Figura S2.

representativas histogramas FACS que mostra o efeito dependente do tempo de tratamentos Amp (0, 20, e 50 uM) sobre a apoptose de células PC-3, tal como medida pelo fluxo de Anexina-PI ensaio de citometria.

doi: 10.1371 /journal.pone.0038802.s002

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Figura S3.

O efeito do AMP sobre a citotoxicidade das células PC-3, tal como medido pelo ensaio de exclusão de azul de tripano. As células foram tratadas com diferentes concentrações de AMP na durante 16 horas, ao mesmo tempo utilizado para ensaios de migração e invasão. Os valores são média ± SEM de três experiências independentes, cada uma em duplicado. Os valores são estatisticamente insignificante entre os grupos

doi:. 10.1371 /journal.pone.0038802.s003

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Figura S4.