Abstract

Recentemente, nós mostramos que o vírus vaccinia oncolytic GLV-1h68 tem um potencial terapêutico significativo no tratamento de metástases em linfonodos do carcinoma da próstata PC-3 humano em xenoenxertos tumorais. Neste estudo, foram analisados ​​os mecanismos subjacentes à redução mediada por vírus metástases. A imuno-histoquímica demonstrou que o vírus-tratamento resultou numa diminuição drástica dos vasos sanguíneos e linfáticos, representando vias essenciais para a migração de células PC-3, em ambos os tumores e metástases. Assim, GLV-1h68 reduziu drasticamente rotas essenciais para a propagação metastática de células PC-3. Além disso, a análise de distribuição virai em GLV-1h68-injectados ratinhos portadores de tumor em ensaios de placa, revelou títulos de vírus significativamente mais elevadas em comparação com as metástases de tumores sólidos. Para elucidar condições potencialmente mediando a colonização viral preferencial ea erradicação de metástases, componentes do microambiente de tumores e metástases não infectados foram comparados com estudos microscópicos. Estas análises revelaram que o PC-3 linfáticos metástases mostraram um aumento da permeabilidade vascular, maior estado proliferação de células tumorais como determinado por BrdU- e Ki-67 ensaios e menor necrose de células PC-3 do que os tumores sólidos. Observou-se além disso, um aumento do número de células do sistema imunológico (MHCII

+ /CD68

+ macrófagos, MHCII

+ /CD19

+ B linfócitos) combinada com uma expressão sobre-regulada de citocinas pró-inflamatórias em metástases em comparação com PC-3 tumores primários. Propomos que estes componentes do microambiente mediada o tropismo metastático do GLV-1h68. Por conseguinte, baseado no vírus vaccinia viroterapia oncolítico pode oferecer um novo tratamento de carcinomas da próstata metastático em humanos

citação:. Donat L, S Weibel, Hess H, J Stritzker, Härtl B, Sturm JB, et ai. (2012) Preferencial Colonização de metástases por Oncolíticos Vaccinia vírus Strain GLV-1h68 em um PC-3 Modelo Humano câncer de próstata em ratos nus. PLoS ONE 7 (9): e45942. doi: 10.1371 /journal.pone.0045942

editor: Maciej S. Lesniak, The University of Chicago, Estados Unidos da América

Recebido: 25 de junho de 2012; Aceito: 23 de agosto de 2012; Publicação: 25 de setembro de 2012

Direitos de autor: © Donat et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esses autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses: Drs.. Jochen Stritzker, Nanhai G. Chen, Ivaylo Gentschev e Aladar A. Szalay são funcionários da Genelux Corporation e tem interesses financeiros em Genelux Corporation. Dr. Barbara Härtl é um funcionário da Genelux GmbH. Genelux Corporação também concedeu uma subvenção de serviço para a Universidade de Würzburg. Dr. Ulrike Donat e Dr. Stephanie Weibel são beneficiários de uma bolsa de pós-doutorado. Dr. Julia Sturm eo Sr. Michael Hess são beneficiários de uma bolsa de pós-graduação da Universidade de Würzburg. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análises, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Não existem patentes ou produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento, como detalhado em linha no guia para os autores.

Introdução

De acordo com estudos atuais, mais de 90 % dos pacientes com câncer morrem devido aos efeitos diretos ou indiretos de metástases. o prognóstico do paciente é, portanto, imediatamente ligado à fase metastático do carcinoma de [1]. células tumorais metastáticas se infiltrar tecidos saudáveis ​​e barreiras vasos transversais para acessar linfática ou a circulação sanguínea. A tendência de uma célula de tumor para entrar vasos linfáticos ou sangue depende da capacidade de aderir a estruturas específicas, tais como fibras reticulares no seio subcapsular de um nódulo linfático de drenagem ou células endoteliais que revestem os vasos sanguíneos [2].

p> O cancro da próstata é conhecido para metastizar para ossos, pulmões e nódulos linfáticos [3], [4]. Ela representa a segunda principal causa de morte relacionada ao câncer em homens. Como o câncer de próstata prossegue de forma assintomática, o diagnóstico é muitas vezes feita quando metástases já formado. estratégias actuais de tratamento para as metástases são semelhantes aos utilizados para os tumores primários [1]. O tratamento do carcinoma da próstata avançado, é realizada por meio de quimioterapia e radioterapia convencional. Infelizmente, estes tratamentos resultam frequentemente no desenvolvimento de tumores resistentes a metástases e [5], [6]. Além disso, demonstrou-se que mantendo o crescimento do tumor sólido à distância pode, em vez de promover a suprimir a formação de metástases [7]. Combate à tanto a formação e crescimento de metástases, portanto, a chave para o sucesso no tratamento do câncer

Assim, virotherapy oncolytic é uma das mais promissoras novas estratégias na luta contra ambos:. Tumores sólidos e metástases. Oncolíticos vírus são capazes de se replicar selectivamente em células de cancro, resultando na destruição de tecido tumoral, mas deixando os tecidos saudáveis ​​ileso [8]. Em 2007, Zhang

et ai. Descreveu a primeira

atenuada de vírus da vacina recombinante-GLV 1h68 [9], [10]. O efeito oncolitico do vírus tem sido demonstrado em xenoenxertos de tumor da mama, próstata e pâncreas [10] – [12]. Além disso, Gentschev

et ai.

Demonstrado, em princípio, o grande potencial terapêutico de VGL-1h68 no tratamento de metástases dos nódulos linfáticos provenientes da linha celular de carcinoma da próstata PC-3 [11].

neste estudo, foram caracterizados os mecanismos subjacentes à redução mediada por vírus de metástases. Para uma análise detalhada, primeiro visualizado disseminação metastática de células PC-3 no sistema linfático de ratinhos nus, inserindo o

mRFP1

-Gene que codifica a proteína fluorescente vermelha sob o controlo do promotor de CMV no genoma da célula tumoral . Após a injecção virai em ratinhos portadores de tumor PC-3-RFP, foi demonstrado que o tratamento do vírus diminuiu dramaticamente a quantidade de vasos sanguíneos e linfáticos, que são vias essenciais para a propagação metastática de células de tumor, em tumores, bem como nas metástases [13] , [14]. Além disso, foram detectados títulos de vírus significativamente mais elevados em metástases de PC-3 do que em nódulos linfáticos de tumores sólidos e mostrámos que linfáticos renal metástases foram colonizados para um grau ainda mais elevado do que os lombares. Para nosso conhecimento, este tropismo viral a metástase tem, até agora, não foi descrito na literatura. Por isso, nos propusemos a analisar mecanismos que levam à colonização viral preferencial. Neste contexto, foram analisados ​​vários aspectos do microambiente, tais como tumor e metástases vasculatura e da perfusão, o estado proliferativo e a extensão de necrose celular PC-3, carga de células imunes, bem como a expressão de citocinas em tumores primários e metástases nos nódulos linfáticos.

Materiais e Métodos

Linhas Celulares

A linha de células de carcinoma da próstata humano PC-3 (DSMZ ACC465) foi cultivada em meio RPMI 1640 (PAA Laboratories, Cölbe, Alemanha) suplementado com 10% de FCS (PAA Laboratories, Cölbe, Alemanha) e solução de penicilina-estreptomicina a 1% (PAA Laboratories, Cölbe, Alemanha). As células PC-3-RFP foram cultivadas nas mesmas condições, excepto para a adição de 10 ug /ml de blasticidina. A linha de rim de macaco verde Africano celular de fibroblastos de CV-1, obtida a partir da American Type Culture Collection (ATCC CCL-70), foi cultivada em DMEM de alto teor de glicose (PAA Laboratories, Cölbe, Alemanha) suplementado com 10% de FCS e 1% de penicilina solução de estreptomicina. células renais epiteliais humanas (293FT) foram gentilmente fornecidas por P. Hill (Universidade de Nottingham, originalmente obtido a partir da Invitrogen) e cultivadas em RPMI 1640 suplementado com 10% FCS e 2 mM de L-glutamina (PAA Laboratories, Cölbe, Alemanha).

de células PC-3-RFP

a sequência de cDNA da proteína fluorescente vermelha (

mRFP1

) foi inserido no genoma de células PC-3 utilizando Vira Power ™ Lentivirus Expression System Kit (Invitrogen GmbH, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. O

mRFP1

-encoding plasmídeo pCR-TK-SEL-MRFP foi fornecida por Q. Zhang (Genelux Corporation, San Diego) e usado para gerar o

mRFP1-

contendo vectores lentivirais, tal como descrito anteriormente [15]. Replicação incompetente

mRFP1

-encoding lentivírus foram produzidos em células 293FT por uma co-transf ecção dos plasmídeos pLP1, PLP2, PLP /VSVG que fornecem proteínas estruturais e de replicação de lentivírus e a expressão pLENTI6 /V5-DEST-MRFP plasmídeo usando Lipofectamine

TM2000. Após a transdução de células PC-3 com lentivírus MRFP de codificação e blasticidina (10 ug /ml) de selecção, um PC-3 do clone expressando RFP estável foi seleccionado e RFP-expressão em 98% de todas as células foi confirmada por citometria de fluxo .

estirpe do vírus

O atenuada estirpe do vírus vaccinia GLV-1h68 foi construído como descrito anteriormente por Zhang

et al.

[10]. Três cassetes de expressão que codificam para

Renilla

proteína de fusão luciferase-GFP, β-galactosidase ou β-glucuronidase foram recombinadas no

F14.5L

,

J2R Comprar e

A56R

loci, respectivamente, do genoma do vírus parental LIVP. GLV-1h68 foi propagado em células CV-1 e purificada através de gradientes de sacarose.

implantação do tumor e vírus Administração

Os tumores foram gerados através da implantação de 2 × 10

6 PC-3 ou PC células -3-RFP em 100 ul PBS subcutaneamente no flanco abdominal direito de 6-8 semanas de idade do sexo feminino atímicos nu

Foxn1

nu

ratos (Harlan Winkelmann GmbH, Borchen, Alemanha). Uma dose única de 1 × 10

7 unidades formadoras de placas (pfu) GLV-1h68 em 100 ul de PBS foi injectada por via intravenosa (i.v.). Para estudar a colonização viral de metástases PC-3-RFP, GLV-1h68 foi administrada após metástases linfáticas abdominal eram palpáveis; usualmente 45-60 dias após a implantação de células PC-3-RFP, para imitar o estado avançado de carcinoma da próstata. Desde o estágio avançado da doença está associada com a perda de peso independente de infecção viral, o peso foi medido duas vezes por semana e os ratos foram sacrificados antes de taxas normais foram ultrapassados. Os períodos de tratamento analisados ​​não exceda 14 dias. Após a injeção do vírus do estado de saúde dos ratos não se alterou.

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo governo de Unterfranken, Alemanha (número de protocolo AZ 55.2-2531.01-17 /08) e /ou Institutional Animal Care e Use Committee (IACUC) da Explora Biolabs, localizado em San Diego Science Center (San Diego, EUA) (números de protocolo: EB08-003; EB11-25).

Detecção de Humanos PC-3 células de linfa nodos via RT-PCR

A presença de PC-3 em células humanas lombar alargada e gânglios linfáticos renais foi analisado por RT-PCR utilizando iniciadores para actina β-humana como descrito anteriormente [11]. Um nó de linfa foi definida para ser ampliada quando o diâmetro máximo ultrapassou 2 mm.

Fluorescência de imagem de tumores e metástases de linfonodo

Imagens de GLV-1h68 ou PBS tratados tumor PC-3-RFP camundongos -bearing foram tomadas, quer com o EX Imaging System Maestro (Caliper, Hopkinton, MA, EUA) ou com um MZ16 FA Stereo-microscópio de fluorescência (Leica, Wetzlar, Alemanha). Para geração de imagens de camundongos com o Sistema de Imagem Maestro EX, os animais foram anestesiados com 2-3% de isoflurano. As imagens digitais foram processadas com o Photoshop 7.0 (Adobe Systems, Mountain View, EUA).

Análise de Viral Os títulos em tumores e metástases

A quantidade de partículas de vírus em tumores e metástases lisados ​​foi determinada por ensaios de placas padrão. Portanto, PC-3 tumores e metástases foram excisadas 3, 7 e 14 dias após GLV-1h68 injecção, picadas e de 2 volumes de tampão de lise (Tris-HCl a 50 com EDTA 2 mM, pH 7,4) suplementado com fluoreto de fenilmetilsulfonilo 2 mM e foram adicionados mistura de inibidores de proteinase (Roche Diagnostics GmbH, Penzberg, Alemanha). As amostras foram homogeneizadas usando um FastPrep Trituradora (Thermo Scientific, Karslruhe). Após 3 ciclos de congelação e descongelação seguida por diluições em série de sonicação foram titulados em células CV-1 confluentes em placas de 24 poços. Todas as amostras foram medidas em duplicado.

A imuno-histoquímica

Para a histologia, os tumores e metástases foram excisadas e fixadas durante 16 h em paraformaldeído a 4% /PBS, pH 7,4. Preparação de secções de 100 um e procedimentos de marcação foram realizados como descrito anteriormente [16] utilizando o Leica VT1000 Vibratom (Leica, Heerbrugg, Suíça). Após marcação, as secções de tecido foram montadas em Mowiol 4-88 (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemanha). As amostras de tecido foram seccionados (espessura 10 um) com o criostato Frigocut 2800 (Leica, Wetzlar, Alemanha). Após a desidratação em 10% e 30% de sacarose (Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha) amostras foram embebidos em Tissue-Tek® O.C.T. (Sakura Finetek Europe BV, Alphen aan den Rijn, Holanda). Cortes congelados foram armazenados a -80 ° C e incubadas com anticorpos primários durante 1 h. Após lavagem com PBS, as secções foram coradas durante 1 h com anticorpos secundários e, finalmente, montado em Mowiol 4-88.

Anticorpos e reagentes

vasos sanguíneos endoteliais foram coradas com um anticorpo monoclonal anti-hamster CD31 anticorpo (Chemicon International, Temecula, EUA; MAB1398Z) e vasos linfáticos endoteliais com um anticorpo policlonal de coelho anti-LYVE-1 (Abcam, Cambridge, UK; ab14917). Não-específico de rato-IgG (Jackson Immunoresearch, Pensilvânia, EUA; 01200003) foi usado para analisar a permeabilidade dos vasos sanguíneos em tumores PC-3-RFP e metástases. Portanto, 10 mg /kg de rato-IgG foram injectados por via intravenosa (i.v.) em ratinhos portadores de tumor PC-3-RFP. Seis horas após a injecção os ratinhos foram sacrificados e 100 uM secções de tumores e metástases foram preparados. A marcação de células apresentadoras de antigénio foi realizada com um anticorpo monoclonal de rato anti-MHC Classe II anticorpo (I-A /I-E) (eBioscience, San Diego, EUA; 14-5321). As células B foram coradas com um anticorpo monoclonal de rato anti-CD19 (Abcam, Cambridge, Reino Unido; ab25232), macrófagos com um anticorpo anti-CD68 monoclonal de rato (Abcam, Cambridge, Reino Unido, ab53444). O marcador de proliferação Ki-67 foi marcado com um anticorpo anti-Ki-67 policlonal de coelho (Abcam, Cambridge, Reino Unido; ab15580). Para analisar a incorporação de BrdU no ADN de células PC-3-RFP em tumores e metástases, 120 mg /kg de BrdU foram injectados por via intraperitoneal (i.p.). Três horas mais tarde, os tumores e metástases foram excisadas e 10 uM secções foram preparados. Marcação foi realizada usando anticorpo monoclonal de rato anti-BrdU anticorpo (Abcam, Cambridge, Reino Unido; ab6326) após 30 min de incubação com HCl 2 M e lavagem em PBS. Os núcleos foram Hoechst 33342 marcado (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Alemanha). DyLight488-, DyLight549- e DyLight anticorpos secundários conjugados com 649 (burro) foram obtidos de Jackson ImmunoResearch (Pensilvânia, EUA). Todos os anticorpos primário e secundário foram diluídos em PBS 1:100 no caso de 10 um ou secções em PBS /0,3% de Triton-X-100, no caso de secções de 100 um.

Microscopia de Fluorescência

estudos microscópicos foram utilizados para comparar a vasculatura do tumor, estado de proliferação de células e as populações de células imunitárias específicas de tumores, bem como de metastases. Para examinar as secções de tumores e metástases marcados com fluorescência, foram utilizados os seguintes microscópios: Um microscópio estéreo de fluorescência MZ16 FA (Leica) equipado com uma câmera CCD digital eo software Leica IM1000 4.0 (1300 × 1030 imagens de pixel RGB-cor), um microscópio TCS SP2 AOBS a laser confocal (Leica) equipado com o software LCS 2.16 (1024 × 1024 imagens de pixel RGB-cor) e um Axiovert 200 M microscópio (Zeiss) com Axiovision 4,5 software (1388 × 1040 imagens em escala de cinza pixel). As imagens digitais foram processadas com o Photoshop 7.0 (Adobe Systems, EUA) e fundiram-se para produzir pseudo-colored imagens.

Análises de fluorescência Digital Images of

Para as análises de imagens digitais do tumor, LN e RN seções, é importante notar que havia um tumor por rato, mas o número de lombar e metástases linfáticos renais diferiam mouse para mouse. Na maioria dos casos 2 linfonodos e 2 RNs estavam presentes per mouse. Por tumor ou metástase imagens de 2 seções foram analisados, sendo que os dados obtidos a partir de todas as metástases linfáticas lombar foram fundidas para LN e os dados obtidos a partir de todos os gânglios linfáticos renais foram fundidas para RN.

Medição da linfa e dos vasos sanguíneos densidade .

a linfa e dos vasos sanguíneos densidade foi medida em imagens digitais (× 80 × 100 e ampliação) de anti-LYVE-1 e anti-CD31 corado 100 mm seções. Oito imagens por tumor, LN e RN foram analisados ​​por coloração. tempo de exposição para imagens individuais foi ajustado para assegurar a visibilidade clara de todos os vasos sanguíneos e linfáticos detectáveis ​​e decorado com 8 linhas horizontais equidistantes usando o Photoshop 7.0. Todos os linfáticos ou vasos sanguíneos que cruzam essas linhas foram contadas para obter a densidade de vasos por seção.

Medição dos diâmetros dos vasos sanguíneos.

medição do vaso sanguíneo de diâmetro foi realizada utilizando imagens digitais (× 100 ampliação) de 100 mm cortes corados com anti-CD31 utilizando o software Leica IM1000 4.0. Imagens de tumores e metástases em linfonodos foram obtidos com tempos de exposição individuais para receber sinais de CD31 óptimas e excluir a variabilidade dependente do sinal de diâmetro do vaso. imagens individuais foram cobertas com três linhas horizontais equidistantes e os diâmetros de todos os vasos sanguíneos que cruzam essas linhas foram medidos. diâmetros dos vasos sanguíneos foram determinados em 4 imagens por tumor, LN e RN.

Quantificação de rotulagem seção.

Para quantificar a permeabilidade dos vasos sanguíneos, imagens digitais (160 × ampliação) de 100 mm foram analisados ​​cortes histológicos de tumores e metástases. A área total positivos para IgG (marcado com anti-rato-DyLight488) foi determinada em 16 regiões diferentes por amostra. A quantidade de tecido necrótico no PC-3 tumores ou metástases foi determinada em imagens digitais de 100 uM secções. Os núcleos foram marcadas com Hoechst 33342. A fracção de uma secção não coradas pela Hoechst devido à degradação núcleos foi definido como a área necrótica. Neste caso, as imagens de 2 partes inteiras por amostra foram analisadas. A quantidade de MHC-II, CD19 e células CD68 positivas em PC-3 tumores e metástases foi medido em imagens digitais de 10 uM secções. Duas imagens seção inteira por amostra foram analisadas. Análises da quantidade de IgG, tecido necrótico e MHC-II, CD19 e células CD68-positivas em imagens digitais foram realizados utilizando o software ImageJ (https://rsbweb.nih.gov/ij) após a conversão de RGB-imagens em oito bit imagens em escala de cinza usando Photoshop 7.0.

Medição da intensidade de fluorescência.

a medição da intensidade de CD31 e Ki-67 foi feito em imagens digitais de 100 mm e 10 mm seções de PC- 3 tumores e metástases. Para cada coloração, 8 imagens diferentes por amostra foram adquiridos com uma configuração idêntica. RGB-imagens foram convertidas em escala de cinza de 8 bits com uma faixa de intensidade 0-255. A intensidade de fluorescência de CD31 e Ki-67 colorações representa o brilho média de todos os pixels de coloração relacionadas e foi medida usando ImageJ. Imagens de coloração CD31 foram tomadas em 100x, imagens de Ki-67 com aumento de 400x.

Isolamento e caracterização de proteínas

lisados ​​de proteínas de tumores PC-3-RFP, lombar e metástases linfáticas renal de 3 ratinhos 49 dias após o implante de células tumorais foram analisados ​​com um perfil de antigénio de proteínas imuno-relacionadas (RodentMAP® v2.0, regras baseadas Medicina, Austin, EUA), utilizando anticorpos ligados esferas. Os lisados ​​foram efectuadas tal como descrito anteriormente [11]. Os resultados foram normalizados com base na concentração de proteína total.

Análise Estatística

t

um teste de Student bicaudal foi utilizado para análise estatística.

foram considerados estatisticamente significativos valores de p

de ≤0.05. Os asteriscos indicam uma diferença significativa entre os grupos experimentais. (* Indica p ≤ 0,05; ** indica p≤0.01; *** indica p≤0.001)

Resultados

A visualização da propagação metastática de células tumorais PC-3-RFP através do sistema linfático em ratinhos nus

para analisar a propagação metastática de PC-3 células dentro ratinhos nus, era necessário estabelecer tumores primários através da implantação de 2 × 10

6 RFP-expressando células PC-3 subcutaneamente no flanco direito de ratinhos nus. Cerca de 70 dias após a implantação foi visualizada células tumorais metastizadas em lombar (LN) e renais nodos (RN) linfáticos em vivo ratinhos portadores de tumor PC-3-RFP (Figura 1a). Além detecção em lombares e linfáticos renal nodos, as células PC-3-RFP também foram visualizados em vasos que ligam os pares de nódulos linfáticos (Figura 1B). Para descobrir se esses navios são vasos linfáticos ou do sangue colorações imuno-histológicos foram realizados. Etiquetagem de LYVE-1 (marcador linfática) e CD31 (marcador de vasos sanguíneos) nas secções de tecido revelaram claramente uma origem linfática dessas estruturas de vasos semelhantes contendo as células de tumor (Figura 1C).

2 × 10

6 PC-3 ou PC-3-RFP células foram implantadas no flanco direito de ratinhos nus. (A) imagens em tempo real de um rato nu viver tendo um tumor PC-3-RFP 70 dias após a implantação, dorsal e ventral vista. T, tumor; LN, lombares metástases linfáticas; RN, renais metástases linfáticas. (B) lombar (LN1, LN2) e renal (RN1, RN2) metástases linfáticas no abdómen de um rato portador de tumor sólido PC-3-RFP 65 dias após a implantação. imagem da direita: migração de células PC-3-RFP entre LN e RN. (C) 100? M secções transversais da parte entre LNs e RNs coradas com anti-CD31 e anticorpo anti-LYVE-1, respectivamente. (D) para a linfa positivo β-actina humana nodos 21, 28, 35 e 42 dias pós-implantação de células PC-3 e (e) densidade de vasos linfáticos no correspondente PC-3 tumores primários. Tumores, lombar e linfáticos renal nós de 4 ratos foram analisados ​​por ponto de tempo. Para determinar a densidade de vasos linfáticos, a 100 uM secções de tumores PC-3 foram preparadas e 2 cortes foram corados com anticorpo anti-LYVE-1. Quatro imagens (80 x de ampliação) por secção foram analisadas como descrito em materiais e métodos. barras de escala representam 2 mm (B e imagem da esquerda c) e 200 um (direita imagens c). Todas as imagens são exemplos representativos.

Em conjunto, visualizamos a propagação metastática de células tumorais PC-3-RFP do local do tumor primário definido no flanco direito de lombar regional e distantes dos gânglios linfáticos renais em ratinhos nus.

Além disso, foi mostrado uma correlação baseada no tempo entre a formação de metástases linfonodais ea densidade de vasos linfáticos nas correspondentes PC-3 tumores. Ao longo do tempo, um aumento contínuo de linfonodos metastáticos positivo para as células PC-3 foi observado (Figura 1D). Simultaneamente, densidade de vasos linfáticos no PC-3 tumores aumentou (Figura 1e) indicando a coerência entre a quantidade de vasos linfáticos em tumores sólidos e linfonodo metastático.

GLV-1h68 Tratamento diminui drasticamente a densidade de sangue e da linfa Vessel em PC-3-RFP tumores e metástases

recentemente, tem sido mostrado que o tratamento GLV-1h68 de PC-3 resultados de ratinhos portadores de tumor em uma redução significativa de metástases dos nódulos linfáticos [11]. Além disso, mostrámos que GLV-1h68 também é um agente eficaz no tratamento de PC-3 metástases pulmonares, que principalmente surgiu por disseminação metastática de células PC-3 através da via hemática (Figura S1). Para entender o potencial terapêutico da GLV-1h68, analisamos o efeito do tratamento viral em vasos sanguíneos e linfáticos associados ao tumor já que aqueles desempenham um papel essencial como rotas para a propagação metastática para órgãos distantes e linfonodos [13], [14].

para sangue CD31-positivas, bem como para vasos linfáticos LYVE-1-positivos uma redução significativa da densidade de vasos em PC-3 tumores, LN, e RNs foi observada devido a administração intravenosa (iv) de injecção de GLV -1h68 (Figura 2). as medições de densidade de vasos sanguíneos revelaram uma redução da densidade de 46% em tumores e LN e por 60% em RNs em ratos injectados com o vírus vaccinia, respectivamente (figura 2a e b). Resultados semelhantes foram obtidos para a densidade de vasos linfáticos (Figura 2c e d), indicando que o efeito de VGL-1h68 foi mais forte nas metástases de nódulos linfáticos renais.

A análise foi efectuada 57 dias após a implantação de 2 x 10

6 células PC-3 e 7 dias após a injecção de 1 × 10

7 pfu GLV-1h68. Para determinar sangue e densidade de vasos linfáticos, 100 mm secções de tumores, linfonodos e RNs de 5 PBS e 5 ratinhos tratados com GLV-1h68 foram coradas com anti-CD31 ou um anticorpo anti-LYVE-1. Os vasos sanguíneos e linfáticos foram contados em 4 (imagens de ampliação x 100) a partir de cada uma das secções 2 por amostra. (A) densidade de vasos de sangue nos tumores PC-3 /metástases e (b) imagens representativas de secções coradas anti-CD31. Os vasos sanguíneos são mostrados em escala de cinza, por GLV-1h68 expressa GFP em verde. (C) densidade de vasos linfáticos no PC-3 /metástases de tumores e (d) as imagens representativas de anti-LYVE-1, secções coradas. Os vasos linfáticos são mostrados em escala de cinza, por GLV-1h68 expressa GFP em verde. barras de escala representam 500 mm.

Em resumo, os resultados indicam claramente que oncolytic destruição do tecido tumoral em PC-3 tumores e metástases é significativamente reforçada pela erradicação da vasculatura do tumor, bem como vasos linfáticos.

Colonização preferencial de linfonodo metástases comparados com os tumores PC-3 primárias por GLV-1h68

uma vez que temos observado uma redução mais forte das densidades de sangue e vasos linfáticos em metástases linfáticas renais em comparação com tumores primários , partimos para investigar padrões de colonização virais de tumores primários, linfonodos e RNs. Para atingir este objectivo, i.v., os ratinhos portadores de tumor PC-3-RFP foram injectados com 1 × 10

7 unidades formadoras de placas (pfu) GLV-1h68. Para mimetizar a situação dos doentes com cancro em fase avançada e para assegurar a presença de metástases em nodos linfáticos que injectados vírus vaccinia na fase final da doença 55 dias após a implantação de células de tumor. imagens multiespectrais de tumores e metástases revelaram sinais claros GFP em tumores, linfonodos e RNs já 3 dias após a injecção de vírus (dpi). Surpreendentemente, a intensidade de GFP foi a mais elevada no RNs, seguido de linfonodos e tumores sólidos, em seguida, (Figura 3A). Com base nestes resultados assumimos uma colonização mais eficiente das metástases linfáticas, por GLV-1h68 em comparação com tumores primários de PC-3.

1 × 10

7 pfu GLV-1h68 foram i.v. injectado em ratinhos portadores de tumor PC-3-RFP. (A) do rato portador de tumor PC-3-RFP 3 dias após a injecção de VGL-1h68. (B) Os títulos de vírus em tumores PC-3-RFP, linfonodos e RNs 3, 7 e 14 dias após a injecção de GLV-1h68. injecção de vírus foi realizada 55 dias após a implantação de células de tumor. Tumores e metástases em linfonodos de 6 ratinhos foram analisados ​​por grupo (n = 6). (C) 100? M secções de um tumor PC-3-RFP e um nó de linfa renal metástase 77 dias pós-implantação e 7 dias após a injecção do vírus. As células PC-3-RFP são mostrados em vermelho, por GLV-1h68 expressa GFP em verde. Todas as imagens são exemplos representativos. barras de escala representam 1 mm (b) e 2 mm (c).

Para uma análise mais aprofundada, padrões de colonização virais para tumores, linfonodos e RNs foram estudados em um curso de tempo no dia 3, 7 e 14 após a injecção de vírus por ensaios de placa. De facto, mostrou-se que houve um número significativamente mais elevados títulos virais em metástases de nódulos linfáticos, em comparação com tumores primários PC-3-RFP em todos os três pontos de tempo (Figura 3B). Curiosamente, aos 3 e 7 RNs dpi foram colonizados em um grau mais elevado do que linfonodos. No dia da injecção de vírus 7 pós 1.4 × 10

9 pfu de GLV-1h68 por grama de tecido foram determinados em RNs. Em contraste, apenas 28% da concentração de vírus RN foi detectado em linfonodos e tão pouco quanto 2% em tumores primários. Após duas semanas, as diferenças em títulos virais iniciais entre LNs e RNs já não eram detectáveis.

Além disso, a análise microscópica de secções de tumor PC-3-RFP e metástases revelaram, conforme esperado a partir de títulos virais mais elevados, também maior sinais de GFP em metástases em contraste com tumores sólidos de 7 dias após a injecção GLV-1h68 (Figura 3c). Além disso, mostrámos que a colonização preferencial de metástases em comparação com tumores sólidos por GLV-1h68 não é restrita a lombar e metástases de nódulos linfáticos renais. sinais de GFP mais elevados e títulos virais também foram observados em metástases (IN) e linfáticos ciático (SN) inguinais (Figura S2). Além disso, a investigação de uma rota diferente da injeção do vírus revelou injeção semelhante GLV-1h68 padrões de colonização 7 dias após tumoral intra (IT) (Figura S3).

Em conjunto, estes resultados indicaram uma colonização altamente seletivo de metástases por GLV-1h68, quando comparado com tumores primários.

análise dos fatores do microambiente em tumores e metástases primárias necessárias para as concentrações virais melhorados em metástases linfáticas

para encontrar razões para a colonização viral aumentada de as metástases linfonodais, analisamos o status de PC-3 tumores e metástases antes da injeção do vírus vaccinia ocorreu. Vários diferenças no microambiente de tumores e metástases, que pode ser crucial para o vírus de colonizar metástases num grau mais elevado do que os tumores tinham sido considerados. Portanto, vasculatura, o estado proliferativo de células PC-3, a extensão da necrose, células do sistema imunológico e a expressão de citocinas em tumores, linfonodos e RNs foram analisadas em ratinhos portadores de tumor PC-3-RFP não infectadas. Para imitar a situação de pacientes com câncer em estágio avançado no momento do diagnóstico de câncer geralmente ocorre, analisamos parâmetros microambiente na fase final da doença entre 45-60 dias após a implantação de células tumorais.

O aumento da permeabilidade vascular em linfonodo metástases.

em primeiro lugar, analisámos se as diferenças ocorrem na vasculatura em relação a densidade e a permeabilidade dos vasos dos tumores e metástases, levando a uma quantidade inicial superior de partículas virais dentro dos diferentes tecidos tumorais. Histologia de PC-3-RFP tumores, linfonodos e RNs foi realizada e os vasos sanguíneos foram marcadas com CD31. Embora, não há diferenças em densidade dos vasos sanguíneos entre tumores e metástases foram observados 57 dias de implantação de células pós tumoral (Figura 2a grupo de PBS), a intensidade de fluorescência da coloração CD31 foi significativamente maior nos linfonodos e RNs, em comparação com tumores sólidos (Figura 4a) . Em geral, o marcador CD31 vaso sanguíneo é altamente sobre-reguladas em células endoteliais em tecidos inflamados ou em locais de transmigração de leucócitos em curso e está associada com a permeabilidade vascular superior [17]. Portanto, foi realizado um estudo microscópico detalhada dos vasos sanguíneos relativas diâmetro do vaso e da permeabilidade vascular em tumores em comparação com aqueles nas metástases. Significativamente, linfonodos e RNs revelou maiores diâmetros dos vasos sanguíneos (diâmetro 15 mm média) do que os tumores PC-3-RFP sólidos (diâmetro de 10 mm significa) (Figura 4b). Para saber se estes vasos sanguíneos dilatados, de fato contribuir para o aumento da permeabilidade vascular em metástases linfáticas, os padrões de extravasamento de via intravenosa injetada rat-IgG foram analisados ​​histologicamente. Curiosamente, maiores quantidades significativas de IgG extravasado foram detectados em metástases (área média de IgG-positivas cerca de 60%) em comparação com tumores (área média de IgG-positivas 25%).