Abstract

Os antígenos câncer de testículo-MAGE (CTA) são candidatos atraentes para imunoterapia. O objetivo deste estudo foi determinar a frequência de expressão, a imunidade humoral e significado prognóstico de Magé CTA em câncer epitelial de ovário humano (EOC). de mRNA ou a expressão de proteína foram determinadas para as frequências de MAGE-A1, -A3, -A4, -A10 e -C1 (CT7) em amostras de tecido obtidas a partir de 400 pacientes com EOC. A presença de anticorpos contra os antigénios autólogos MAGE foi determinada a partir de 285 amostras de soro. As relações entre a expressão MAGE, a imunidade humoral a antígenos Mage, e as características clínico-patológico foram estudados. As frequências de expressão individuais foram os seguintes: A1: 15% (42/281), A3: 36% (131/390), A4: 47% (186/399), A10: 52% (204/395), C1 : 16% (42/267). expressão concordantes forte foi observado com MAGE-A1: -A4, MAGE-A1: C1 e MAGE-A4: -A10 (

p Art 0,0005). Expressão de MAGE-A1 ou -A10 antígenos resultou em baixa sobrevida livre de progressão (PFS) (OR 1,44; IC 1,01-2,04,

p = 0,044

e OR 1,3, IC 1,03-1,64,

p

= 0,03, respectivamente); Considerando, expressão MAGE-C1 foi associada com uma melhor PFS (OR 0,62; IC 0,42-0,92,

p

= 0,016). Os PFS melhorados observados para a expressão de MAGE-C1, foi reduzida por co-expressão de MAGE-A1 ou -A10. imunidade humoral espontânea aos antígenos MAGE estava presente em 9% (27/285) dos pacientes, e este previu pobre sobrevida global (log-rank test

p

= 0,0137). Estes resultados indicam que MAGE-A1, MAGE-A4, MAGE-A3 e MAGE-A10 são alvos atraentes prioritários para a imunoterapia polivalente em pacientes com câncer de ovário

Citation:. Daudi S, Eng KH, Mhawech-Fauceglia P , Morrison C, Miliotto A, Beck, A. et al. (2014) Expressão e respostas imunes a MAGE Antígenos prever a sobrevida em epitelial cancro do ovário. PLoS ONE 9 (8): e104099. doi: 10.1371 /journal.pone.0104099

editor: Sophia N. Karagiannis, do Kings College London, Reino Unido

Recebido: 22 Abril de 2014; Aceito: 07 de julho de 2014; Publicação: 07 de agosto de 2014

Direitos de autor: © 2014 Daudi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi financiado em parte pelo Instituto de Pesquisa do Câncer Grupo de Trabalho do cancro do ovário Grant, Cancer Vaccine Collaborative Grant, do Instituto de Pesquisa do Câncer e do Instituto Ludwig para Pesquisa do Câncer, Anna-Maria Kellen Investigator Award Clínica do Instituto de Pesquisa do Câncer (para Kunle Odunsi), Institutos Nacionais de Saúde 5T32 CA 108456, National Institutes of Health R01CA158318-01A1 e Roswell Park Cancer Institute-Universidade de Pittsburg Cancer Institute cancro do ovário especializada Programa de investigação de Excelência Institutos Nacionais de Saúde P50CA159981-01A1. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução câncer de ovário

epitelial (EOC) representa a neoplasia ginecológica mais letal entre as mulheres. Apesar dos esforços consideráveis ​​dirigidas a detecção precoce e as taxas de resposta melhorando, a maioria das mulheres apresentam-se com doença disseminada no momento do diagnóstico inicial, carregam uma taxa de recaída inaceitável de cerca de 85% e uma de 5 anos a sobrevida global de 20-30% [1], [ ,,,0],2]. Por conseguinte, as estratégias de tratamento específicas, como imunoterapia serão necessários para melhorar a evolução clínica de pacientes com câncer ovariano.

O desenvolvimento da imunoterapia bem sucedida requer a caracterização de antígenos associados a tumores (TAA) que são comumente expressa em ovário tumores, com um padrão de expressão restrita em tecidos normais. Além disso, o antigénio ideal deve apresentar uma elevada frequência de expressão em cancro e evidência de imunogenicidade. TAA candidato são frequentemente identificado em pacientes com respostas imunes celulares e /ou humorais fortes que indicam imunogenicidade inerente robusta para esses antígenos [3] – [5]

Os antigénios do cancro dos testículos (CTA) são uma sub-classe de TAA. codificado por cerca de 140 genes. Apesar da sua função biológica pouco caracterizada, a expressão destes antigénios são conhecidos por ser restringida em locais privilegiados imunes, tais como testículos, placenta e ovário fetal, mas não em outros tecidos normais. A expressão anormal destes genes da linha germinal em tumores malignos podem reflectir a activação de um “programa de gametogênico” silenciados, que em última análise conduz à progressão do tumor e ampla imunogenicidade [6]. A imunogenicidade de CTA levou ao desenvolvimento de vacinas contra o cancro generalizada de segmentação destes antigénios em muitos tumores sólidos. Dentro desta ampla classe de TAA, os antigénios associados a melanoma (MAGE) surgiram como candidatos promissores para a imunoterapia do cancro [7] – [9].

Mais de 30 cancro testicular (CT) de genes foram relatadas como membros das famílias multi-genes que são organizados em agrupamentos de genes no cromossomo X (antígenos CT-X). Os agrupamentos de genes estão localizados entre CT Xq24 e Xq28 e incluem famílias de genes, tais como MAGE e NY-ESO-1 [10]. agrupamentos de genes MAGE I Tipo são as mais extensivamente caracterizados e incluem o MAGE-A, B e MAGE-famílias MAGE-C. As proteínas MAGE-A são codificados por 12 membros da família MAGE-um gene diferente (MAGE-A1 a MAGE-A12) e são definidos por uma base de ácido amino conservada 165-171, denominado o domínio de homologia de MAGE (MHD). O MHD corresponde à única região de aminoácidos partilhada por todos os membros da família MAGE-A. MAGE-C1 /CT7 é estruturalmente diferente de MAGE-A família, com um produto de proteína de 1142 aminoácidos (comparada 400 resíduos para as proteínas MAGE-A), que contém uma sequência de repetição em tandem, que está ausente em MAGE-A [ ,,,0],11].

no presente estudo, analisamos a expressão e imunogenicidade de um painel de cinco MAGE CTA em uma grande coorte de pacientes com câncer de ovário. Além disso, examinamos a relação entre a coordenar a expressão de genes MAGE e resultados clínico-patológico.

Materiais e Métodos

Pacientes e espécimes

fixado em formalina parafina-embedded (FFPE; para imuno-histoquímica) e congelados instantaneamente amostras de tecido (por transcriptase reversa-PCR) foram obtidos a partir de 400 doentes submetidos a cirurgia citorredutora de ovário, peritoneal primário e cancro das trompas de Falópio no Instituto Roswell Park câncer (Buffalo, NY), entre 1992 e 2008. Identificamos, e referem-se, estes três tipos de câncer como EOC, devido à sua origem comum no epitélio mülleriano. Todas as amostras de tecido foram recolhidas ao abrigo de um protocolo aprovado do conselho de revisão institucional (IRB) do Roswell Park Cancer Institute. Os pacientes assinaram um IRB aprovado consentimento informado por escrito, e estes foram arquivados no escritório IRB. Todos os espécimes de patologia foram revistos em nossa instituição, e o subtipo histopatológico dos tumores foi classificada de acordo com as diretrizes da Organização Mundial da Saúde (OMS) [12], [13]. O estágio e grau dos tumores foram avaliados de acordo com a Federação Internacional de Ginecologia e Obstetrícia (FIGO) [14], [15]. Num subgrupo de pacientes, as amostras de soro foram recolhidas no momento do diagnóstico. Os prontuários desses pacientes foram revisados ​​retrospectivamente ao abrigo de um protocolo de revisão institucional aprovado. A revisão incluiu ambulatorial e tratamento hospitalar. resultados do estudo incluiu sobrevida global (SG) e sobrevida livre de progressão (PFS). Ambos os critérios de sobrevivência foram medidos a partir do momento do diagnóstico. Recorrência foi definida através de critérios objectivos, como toda a terapia foi dado no cenário adjuvante. A duração de OS é o intervalo entre o diagnóstico e morte. PFS representado o intervalo entre o diagnóstico de progressão da doença, recorrência ou morte. O tempo de observação foi o intervalo entre o diagnóstico eo último contato (morte ou último follow-up). Os dados foram censurados no último follow-up para os pacientes sem evidência de recorrência, progressão ou morte.

RNA total de tecido Isolamento

RNA de tecido total foi isolado a partir de tecidos tumorais congelados pelo uso de do TRI Reagent (Molecular Research Center Inc., Cincinnati, OH, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. Potencialmente ADN contaminante foi removido por tratamento com RNase-free DNase I (Boehringer-Mannheim, Mannheim, Alemanha), seguido por extracção com fenol /chroloform. RNA foi dissolvida em RNase H

2O. A concentração de ARN foi medida espectrofotometricamente resultante (DU500 Spectrophotometer, Beckman Coulter, Fulleron, CA, EUA), e a qualidade do ARN foi verificada por electroforese em gel de agarose a 1,5%.

Transcriptase Reversa-PCR A análise de MAGE A1, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A10 e expressão MAGE-C1

Dois microgramas de cada amostra de RNA foram usados ​​para gerar cDNA com o Ready-To-Go-transcriptase reversa PCR (RT PCR) contas (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido). ARN a partir de tecido testicular normal (Clontech, Mountain View, CA) foi utilizado como um controlo positivo. De PCR foi subsequentemente realizada para estudar a expressão de MAGE-A1, -A3, -A4, -A10 e -C1 em 305 pacientes com EOC. O gliceraldeído-3-Fosfato Desidrogenase (GAPDH) iniciadores foram utilizados como um teste para a integridade de ARN. Tabela S1 lista as sequências de iniciadores para cada gene e o seu respectivo comprimento de fragmento amplificado. As condições de amplificação para todos os produtos do gene foi de 5 min a 95 ° C, seguido por 35 ciclos que consistia em 1 min a 95 ° C, 1 min a 60 ° C e 1 min a 72 ° C. Estes ciclos foram seguidos por um passo de alongamento de 6 minutos a 72 ° C (BioRad iCycler, BioRad Laboratories, Hercules, CA, EUA). Os produtos de PCR foram separados sobre um gel de agarose a 1,5% e visualizado com brometo de etidio sobre um transiluminador ultravioleta (IS-4400 ChemiImager, Alpha Innotech, San Leandro, CA). As intensidades dos produtos de PCR foram heterogêneos, e alguns espécimes produziram bandas amplicon única fracos. Estes foram marcados positivos apenas se o resultado pode ser reproduzida por uma extracção de ARN repetiu e específica de RT-PCR a partir do mesmo espécime de tumor. Casos com níveis muito baixos de transcrição que não eram reproducibly positivo não foram consideradas positivas. PCR bandas de produto foram excisadas a partir do gel de agarose e o DNA isolado foi associado com o QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA, EUA). As amostras de ADN foram submetidos a sequenciação para verificar o produto de PCR.

Análise imuno-histoquímica de MAGE-A3, MAGE-A4 e MAGE-A10 Expressão

imuno análise (IHC) foi realizada utilizando tecidos FFPE de 304 pacientes em microarrays de tecido (TMA). TMA foram construídos utilizando 0,6 mm perfurados de tecido FFPE núcleos a partir de cada bloco dador. Para superar a heterogeneidade do tumor, três núcleos representativos foram seleccionados a partir de cada tumor. Os núcleos de 4 um de espessura de tecido foram desparafinadas e pré-tratado com uma solução de recuperação de antigénio específico (DakoCytomation, Carpenteria, CA) durante 20 minutos. As lâminas foram arrefecidas durante 20 minutos e depois tratou-se em 3% H

2O

2 para extinguir a actividade da peroxidase endógena. As lâminas foram então incubadas TMA com um bloco de proteína livre de soro (DakoCytomation, Carpenteria, CA) durante 30 minutos. Tabela S2 lista os anticorpos e as condições de IHC. MAGE-A3 de coelho anti-humanos de anticorpos policlonais (LS-B4662, tempo de vida Biosciences, Inc.) foi adquirido comercialmente. Anti-MAGE-A4 mAb (clone: ​​57b) e (clone: ​​A3) de MAGE-A10 anti sobrenadantes de hibridoma foram produzidas do Hospital da Universidade de Basileia (Basileia, Suíça) [16], [17]. IgG de coelho ou IgG1 de ratinho (Sigma, St. Louis, MO) foi utilizado como o controlo de isotipo negativo pareado. Labeled biotina estreptavidina (+) LSAB reagentes (DakoCytomation, Carpenteria, CA) foram utilizados de acordo com as instruções do fabricante, seguido de uma 3,3′-diaminobenzidina (DAB) + incubação (DakoCytomation, Carpenteria, CA). As secções foram contrastadas com hematoxilina. Um ponto de corte de células tumorais positivas para 5% foi utilizado para definir expressão positiva.

Medição de anticorpos séricos por ELISA

análise sorológica de respostas imunitárias humorais foi realizada como previamente descrito [18]. 285 amostras de soro a partir de um subconjunto dos pacientes foram analisados ​​por ELISA para a reactividade sérica de proteínas recombinantes de tamanho completo produzida por bactérias MAGE-A1, -A3, -A4, -A10 ou -C1. Como um antigénio de controlo negativo, a proteína de di-hidrofolato redutase recombinante foi preparada e utilizada em cada ensaio. O soro foi diluído em série a partir de 1:100 – 1:100,000 e adicionado ao baixo volume placas de 96 poços (Corning), revestida durante a noite a 4 ° C com 1 ug de antigénio /ml em 25 ul e bloqueadas durante 2 h à temperatura ambiente com PBS contendo 5% de leite desnatado. Após incubação durante a noite, as placas foram extensivamente lavadas com PBS contendo 0,2% de Tween 20 e enxaguadas com PBS (BioTek ELx405 máquina de lavar automática). Soro IgG ligada foi detectada para antigénios com anticorpos IgG anti-humana de cabra conjugada com fosfatase alcalina (Southern Biotech). Após a adição do substrato ATTOPHOS (Fisher Scientific), sinal de fluorescência foi medida utilizando um Cytofluor Series 4000 leitor de fluorescência (PerSeptive Biosystems). Um título recíproca foi calculada para cada amostra de plasma como a diluição máxima ainda significativamente reagir a um antigénio específico. A especificidade foi determinada por comparação entre os sororreatividade vários antigénios testados. Em cada ensaio, de soros de pacientes com reactividade conhecida foram utilizados como controlos. Um resultado positivo foi definido como títulos recíprocos . 100

Análise Estatística

Todas as análises estatísticas foram geradas usando o software SAS (SAS Sistema de Direitos Autorais 2002 SAS Institute Inc. v.9.2) e a R 2.15.3 linguagem de computação estatística. Um nível de significância nominal de 0,05 foi utilizado em todos os testes. Usando uma tabela de contingência 2 × 2, foi determinado o grau de concordância entre os vários perfis de expressão de genes de MAGE. As distribuições de MAGE-A1, -A3, -A4, -A10 e expressão C1 e evolução clínica foram analisados ​​pelo Rank Sum Teste Wilcoxon ou Pearson Chi Teste Square. A análise multivariada de preditores independentes de sobrevivência foram testados utilizando o modelo de riscos proporcionais de Cox [19]. distribuições de sobrevivência estimadas foram calculados pelo método de Kaplan e Meier [20], e os testes de significado com respeito a distribuições de sobrevivência foram com base no teste de log-rank. prognóstico relativo foi resumido usando estimativas e limites de confiança de 95% para a taxa de risco (HR). Não foram feitos ajustes para comparações múltiplas. A árvore filogenética é construído por uma distância Manhattan, codificação de expressão como zero (ausente) e um (presente), eo vizinho padrão juntar algoritmo.

Resultados

Estudo da População

Um total de 400 pacientes com tecidos do ovário, cancros peritoneal primário e das trompas de falópio foram investigados por meio de RT-PCR e IHC. As características dos pacientes neste estudo são apresentados na Tabela 1. A idade média da amostra do paciente foi de 63 (intervalo: 21-93), com uma duração média de acompanhamento de 35 meses (variação: 1-176 meses) . Como esperado, a maioria dos pacientes com doença avançada apresentou fase (82%), tumores pouco diferenciados (74%) e com histologia serosa (64%). doença sensível platina foi demonstrada em 182 dos 400 pacientes (46%), com 116 pacientes com resistência de platina (29%), e 16 pacientes com uma resposta refractário platina (4%). O OS mediana para todos os pacientes foi de 40 meses (variação: 0-173), enquanto que a PFS mediana foi de 12 meses (variação: 0-160).

A expressão de MAGE-A1, MAGE-A3 , MAGE-A4, MAGE-A10, MAGE-C1 no cancro do ovário

a expressão de antigénios MAGE foi avaliada por ambas as RT-PCR e IHC para a maioria dos pacientes de quem as amostras adequadas estavam disponíveis. A expressão de MAGE-A4 e MAGE-A10 foi detectado concordante por ambos os métodos (r = 0,31, OU = 3,88, p 0,001; r = 0,14, OU = 2,00, p 0,001, respectivamente), mas os resultados de MAGE-A3 não eram reproducibly concordantes (r = -0,06, OR = 0,86, p = 0,9198), devido a uma baixa taxa de detecção (Tabela S3). A menos que indicado de outro modo, procedeu-se ao classificar tecidos como antigénio positivo se eles foram identificados por RT-PCR ou IHC (Tabela 2). Consequentemente, quando se considera todos os tecidos amostras 400 analisados ​​por RT-PCR ou IHC neste estudo, as freqüências para MAGE-A3, -A4 e -A10 expressão por qualquer método foram de 36% (131/390), 47% (186/399 ) e 52% (204/395) dos tecidos, respectivamente (Tabela 2). MAGE-A1 e C1 demonstrou a menor frequência de expressão em 15% (42/281) e 16% (42/267), respectivamente. Tabela S3 é um resumo da frequência de mRNA mago e expressão de proteínas em amostras tumorais de pacientes EOC.

MAGE-A3, -A4 e -A10 não exibiu imunomarcação em tecidos normais (Figuras 1A -C), mas intensa imunomarcação no testículo (Figs.1D-F). O padrão de coloração foi citoplasmática e nuclear para MAGE-A3 e A-4, e coloração citoplasmática difusa para MAGE-A10 (Figs.1G-I).

As amostras foram coradas com anticorpo policlonal de MAGE-A3 (X20 ), os clones 57b e sobrenadantes de hibridoma para A3 MAGE-A4 e MAGE-A10, respectivamente (x15). Amostras de ovário normal e testículos foram utilizados como controlos negativos e positivos, respectivamente. A-C: coloração do ovário normal não apresentando reactividade. D-F: Coloração do testículo mostrando túbulos seminíferos com forte coloração intratubular e reactividade não específica ausente. G-I:. Coloração de tumor de ovário demonstrando forte citoplasmática e /ou padrões de coloração nuclear

Co-expressão de MAGE-A e MAGE-C1 no cancro do ovário

As frequências de co-expressão dos antigénios MAGE são mostrados na Tabela 2. A frequência mais elevada de co-expressão foi observada para -A4: -A10 (29%). Embora eles são ambos relativamente raros, o antigénio da família MAGE-C (C1) tendem a ser co-expressa com MAGE-A1 [OR 4,4, p = 0,00015, CI 3,6-5,2] e a ser expressa de forma independente com a outra MAGE- A antígenos da família (Figura 2a). MAGE-A família antigénios -A1: -A4 [ou 3,7, p = 0,0003, 3,0-4,4] e -A1: -A3 [ou 2,8 p = 0,0022, IC 2,2-3,5] ter a co-expressão mais forte; quase cada par está associado exceto para A1: -A10 (OR = 1,2, p = 0,7 IC 0,6-1,8), que sugere que eles são expressos de forma independente. Para caracterizar o padrão multivariada de expressão MAGE, a árvore filogenética na Figura 2b foi criada, em que cada folha que termina em um gráfico de pizza simboliza uma pessoa ou grupo de pessoas. Existem dois padrões distintos de expressão que são observadas. O gene MAGE-A4 dirige um grande padrão de expressão (inferiores clades mão direita), e depois evolui para MAGE-A3 e -A10 expressão nesta população de pacientes. O segundo padrão de expressão única consiste em uma expressão independente de MAGE-A3 e -A10, que então se desenvolve em -A4 (clades mão direita superior). Em contraste, a expressão de MAGE-C1 raramente aparece sozinha e surge esporadicamente em toda a árvore filogenética. Da mesma forma, MAGE-A1 parece com pouca frequência e raramente na clado MAGE-A10. Estas observações traduzem em fortes implicações clínicas dentro desta grande coorte estudo.

(A) MAGE-A1 é co-expressa com -A3 ou -A4 ou C1. MAGE-A3 é co-expressa com -A10. MAGE-A4 é co-expressa com MAGE-A10. A intensidade da cor mais escura representa um significado mais forte. As associações mais fortes são entre MAGE-A1 a -A4, MAGE-A1 a C1 e MAGE-A1 a -A3. odds ratio (OR) superiores a 1 implicam os antígenos tendem a aparecer juntos. (B) a árvore filogenética para a expressão MAGE. Cada folha terminando em um gráfico de pizza simboliza uma pessoa.

Correlação de Magé Antigen Expression com o resultado clínico

A relação entre a expressão de MAGE e os parâmetros clínico-patológico foi investigada. Descobrimos que MAGE-A3 e A4 não teve efeitos prognósticos individuais. Consequentemente, nós nos concentramos uma análise mais aprofundada sobre MAGE-A1, MAGE-A10, MAGE-C1 e outros fatores prognósticos clínico-patológico conhecidos no câncer de ovário.

Sozinho, expressão MAGE-A10 (204/395, 52%) foi associado com pior evolução clínica (PFS mediana de 8,8 [7,2-12,3] vs. 15,5 [13.6-18.4] meses,

p

= 0,009; OS 37.8 [28,2-45,0] vs. 45,0 [39,8-52,2] meses, p = 0,0781). Co-expressão com MAGE-C1 (25/204, 12%) reverteu esta tendência para PFS, mas não OS: A10 (+) /C1 (-) pacientes tiveram PFS mediana de 7,9 meses (7.0-12.1) versus A10 (+) /C1 (+) 13,1 meses (CI9.5-29.9). Estratificados em quatro grupos com base na A10 /padrão de expressão C1, este padrão se mantém (-rank teste log p = 0,0133) e sugere que a A10 (-) /C1 (+) expressão pode ser de proteção mediana PFS 20 [15,7 NA] meses ( ) (Fig. 3).

curvas de sobrevida global para os grupos de pacientes com base em MAGE-A10 e expressão C1. expressão MAGE-C1 prevê um aumento da sobrevivência livre de progressão e uma tendência para a sobrevida global melhorou. Expressão de MAGE-A10 amortece a sobrevivência resultados com o grau de pacientes com expressão MAGE negativo.

padrões de expressão não foram associados em conjunto com a idade (p = 0,900), fase (p = 0,1373), grau ( p = 0,4532), a histologia (p = 0,737), local primário (P = 0,744) ou debulking estado (p = 0,112) (Tabela 3). expressão de MAGE-C1 foi associada à doença de platina sensível (28/38, 74% versus 70/142, 49%; p = 0,009) e da resposta clínica (30/38, 79% versus 92/164, 56%, p = 0,015).

Embora nós nos concentramos em MAGE-A10, a menos prevalente MAGE-A1 (42/281, 15%) foi também levemente associado com os resultados de sobrevivência mais pobres (PFS mediana de 10,3 [6.2- 15.0] vs 12.8 [10.5-15.7] meses

p

= 0,043, OS 38.7 [20,3-78,4] vs. 41,3 [36.5-46.6] meses p = 0,607). Para PFS, MAGE-A1 co-expressão com a A10 é redundante (estratificada teste log-rank p = 0,57), no entanto A1 (+) /A10 (-) os pacientes têm prognóstico ligeiramente pior (PFS mediana de 12,7 [5,3-36,6] vs. 16,3 [14.1-19.4] meses, p = 0,0187). Para modelar todos os três antigénios, em conjunto, recomendamos considerando a expressão quer do antigénio A10 A1 ou juntamente com a expressão de MAGE-C1; o efeito não é significativamente diferente da estratificação apresentados na Tabela 3.

Correlação da resposta de anticorpos para o antigénio MAGE com o resultado clínico

de ELISA para detecção de anticorpos específicos do antigénio MAGE soro foi realizado em amostras de soro obtido no momento do diagnóstico de 285 dos 400 pacientes EOC (Tabela 2). resposta humoral induzida espontaneamente a pelo menos um antigénio MAGE-A foi observada em 9% (27/285) dos doentes, dos quais 85% (23/27) também apresentaram um antigénio MAGE-A. A resposta serológica para qualquer antigénio MAGE foi igualmente distribuído entre todos os parâmetros clínico-patológico (Tabela 4). A presença da resposta imunitária humoral a qualquer dos antigénios MAGE previu uma sobrevivência global pior (PFS mediana 12,3 [6,4-19,7] versus 13,5 [10.9-16.5] meses, p = 0,231; OS mediana 27,8 [17,3-52,2] versus 45,4 [40.2-51.9] meses, p = 0,002) (Figura 4).

curvas de sobrevida global para os grupos de pacientes com base na presença de auto-anticorpos anti-MAGE. resposta humoral a qualquer antigénio MAGE prediz sobrevida global pobres, e nenhuma associação significativa com a sobrevida livre de progressão.

Discussão

A imunoterapia é uma abordagem promissora para melhorar as taxas de sobrevivência e clínica os resultados em pacientes com cancro do ovário [21] – [23]. Entre os possíveis alvos de antígeno tumoral, CTA são considerados os candidatos mais promissores para o desenvolvimento de vacinas anti-câncer. Para avaliar a utilidade do CTA família MAGE como alvos para a imunoterapia específica para EOC, a presente análise abrangente foi realizada em um grande painel de tumores do ovário. Os nossos resultados indicam expressão aberrante de MAGE-A1, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A10, MAGE-C1 em 15%, 36%, 47%, 52% e 16% dos espécimes do EOC, respectivamente. Além disso, verificou-se que, considerando quaisquer destes antigénios MAGE, aproximadamente, 78% mostraram expressão de pelo menos um destes cinco antigénios CT. Além disso, MAGE-A1 e expressão MAGE-A10 foram associados com mau resultado clínico, enquanto MAGE-C1 /CT7 foi associada com melhora da sobrevida

.

A frequência de expressão MAGE em EOC que relatam é geralmente consistente com a relatado para a maioria de outros tumores, excepto para o melanoma e cancro do pulmão de não pequenas células [16], [24]. Expressão de ARNm de MAGE-A3 foi encontrada em 10-40% dos vários tipos de tumores, incluindo o da bexiga [25], da mama [26] e do mieloma múltiplo [27]. No que diz respeito à AOE, a frequência de MAGE-A1 e expressão -A3 que relatamos é semelhante à relatada em estudos anteriores, com a excepção de Zhang

et ai

que encontrada uma expressão de 54% e 37% em tecidos de cancro do ovário, respectivamente [28] – [30]. Isso pode refletir diferenças nas populações estudadas, como havia muito mais tumores em fase inicial do que o nosso grupo de estudo. Num estudo anterior, a expressão de MAGE-A4 negativamente correlacionada com a sobrevivência ou indirectamente, a factores de prognóstico do cancro do ovário estabelecidos em [31]. De acordo com estes estudos, os nossos resultados demonstram uma associação clara para a expressão MAGE e prognóstico. A este respeito, enquanto MAGE-A1 e expressão de MAGE-A10 foram associados com o resultado clínico pobre, MAGE-C1 foi associada com aumento da sobrevivência. Estas descobertas sobrevivência contrastantes entre as diferentes famílias de antígenos MAGE levantam muitas questões essenciais sobre o papel dos genes MAGE em tumorigênese, invasão e metástase em EOC.

Em geral, antígenos MAGE são mais frequentemente expressos em pacientes com doença avançada e pior prognóstico, indicando que a sua expressão pode contribuir para tumorigênese [26], [32] – [37]. Vários estudos têm demonstrado que as proteínas MAGE são críticos para a sobrevivência da célula, aumentando as propriedades tumorigénicas das células e, portanto, podem contribuir activamente para o desenvolvimento de doenças malignas [38] – [40]. Além disso, uma vez que a expressão de antigénio CT tem sido associado com a transformação tumorigénico de células estaminais do cancro [41], é possível que MAGE-A1 e MAGE-A10 expressando células de cancro do ovário representam uma população com as propriedades das células estaminais auto-renovação, e, portanto, mais resistente a eliminação imune ou quimioterapia.

Em contraste com MAGE-A1 e MAGE-A10, o possível mecanismo (s) através do qual a expressão de MAGE-C1 /CT7 confere uma vantagem de sobrevivência é menos claro. Em comparação da estrutura de proteínas dos membros da família MAGE, enquanto os primeiro e segundo domínios são altamente conservadas entre o MAGE-A e -C membros da família, a proteína MAGE-C1 transporta uma característica única. Além de um segmento homólogo MAGE-ácido 275-amino no seu terminal C, MAGE-C1 /CT-7 tem uma região de ácido 867-amino composta por três tipos de repetições em cadeia na sua extremidade N-terminal [11]. Esta região pode ser de importância significativa como a sequência repetitiva da proteína podem moldar os epitopos apresentados para reconhecimento imune de MAGEC1 /CT-7 e, potencialmente, assim, determinar a qualidade das respostas imunitárias resultantes.

Além disso, os nossos resultados indicam que os pacientes com imunidade humoral anti-MAGE tiveram pior prognóstico. Estas conclusões não implicam necessariamente que o anti-MAGE respostas imunes prejudicar diretamente os resultados do tratamento em pacientes com câncer de ovário. Uma vez que a densidade de antigénio apresentados por células apresentadoras de antigénio in

in vivo

diferencialmente afecta a geração de humoral anti-tumor e as respostas de células T [42], nós propomos que os pacientes que desenvolveram respostas imunitárias espontâneas são aqueles com alta densidade de antigénio porque da carga de doença avançada e, portanto, a um pior prognóstico. Estes pacientes são ainda susceptíveis de beneficiar de imunoterapia dirigida-MAGE porque as respostas imunes em curso anti-MAGE-A não são eficazes. Num estudo anterior de respostas imunitárias humorais espontâneas contra o antigénio NY-ESO-1 CT, o impacto da imunidade humoral era neutra no prognóstico do paciente [43].

Porque a expressão de antigénios MAGE é regulada por mecanismos epigenética tais como a metilação e acetilação da histona, nós concluímos que a expressão do antigénio MAGE em tumores pode ser o resultado da activação de um programa de genes-expressão coordenada, em vez de uma série de eventos independentes [6]. Usando métodos analíticos, o presente estudo identificou significativa co-expressão entre os antígenos mago. Estes resultados suportam a noção de que o cancro do ovário, adquire um perfil de transcrição gametogênico, em que os genes silenciados tipicamente são agora activados que conduz a progressão tumoral. Os nossos resultados indicam que o MAGE-A4 é o gene central que orienta o padrão de expressão dos outros genes, com MAGE-C1 única emergente esporadicamente na árvore filogenética. Tomados em conjunto, os nossos resultados sugerem que MAGE-A1, -A10 e C1 são possíveis fatores prognósticos em câncer de ovário, com MAGE-A1 e A-10 associado com mau prognóstico; e MAGE-C1 /CT7 associado com melhor prognóstico. Propomos MAGE-A1 e MAGE-A10 como alvos prioritários para a imunoterapia no câncer de ovário. Desde MAGE-A4 apresenta uma frequência relativamente elevada de expressão, e parece dirigir um grande padrão de co-expressão de outros antigénios MAGE (Fig. 2b), propomos também MAGE-A4 como um alvo prioritário para a imunoterapia do cancro do ovário.

Informações de Apoio

Tabela S1.

Primers para genes MAGE para RT-PCR

doi:. 10.1371 /journal.pone.0104099.s001

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Tabela S2.

anticorpos mago e condições para IHC

doi:. 10.1371 /journal.pone.0104099.s002

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Tabela S3. estatuto antígeno

MAGE no cancro do ovário

doi:. 10.1371 /journal.pone.0104099.s003

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Reconhecimentos

Os autores gostariam de agradecer Erika Ritter e Christina Sedrak, de LICR NY ramo, por sua excelente assistência técnica.