Abstract
Fundo
Todos os anos, cerca de 74.000 mulheres morrem de cancro do endométrio, principalmente devido à doença recorrente ou metastático. A presença de linfócitos infiltrantes de tumor (TILs), bem como receptores de progesterona (PR) positividade tem sido correlacionada com melhor prognóstico. Este estudo descreve dois mecanismos pelos quais a progesterona inibe a propagação metastática do câncer de endométrio: estimulando infiltração de células T e inibindo epitelial-a-mesenquimal transição celular (EMT)
Metodologia e Descobertas Principais
as secções de parafina a partir de pacientes com (n = 9) ou sem (n = 9) cancro do endométrio progressiva (doença recorrente ou metastático) foram avaliadas quanto à presença de células T CD4 + (helper), CD8 + (citotóxico) e Foxp3 + (regulamentares) T-linfócitos e de expressão PR. foi observada doença progressiva para ser associado a uma perda significativa de TILs e perda de expressão de PR. amostras de tumores congelados, utilizados para análise de expressão de todo o genoma, mostrou regulação significativa das vias envolvidas na immunesurveillance, EMT e metástase. Para um certo número de genes, tais como CXCL14, DKK1, DKK4, PEG10 e WIF1, quantitativo de RT-PCR foi realizada para verificar a montante ou a regulação negativa na doença progressiva. Para corroborar o papel da progesterona na regulação da invasão, Ishikawa (IK) linhas celulares de cancro do endométrio, estavelmente transfectadas com ARP (IKPRA), PRB (IKPRB) e PRA + PRB (IKPRAB) foram cultivadas na presença /ausência de progesterona (MPA) e utilizada para a análise de todo o genoma expressão, Boyden- e ensaios de migração cicatrização de feridas, e IHC para marcadores EMT conhecidos. linhas celulares IKPRB e IKPRAB mostrou MPA inibição induzida da migração e perda da vimentina marcador mesenquimais na frente invasiva do ensaio cicatrização de feridas. Além disso, análise de caminho de genes significativamente MPA regulados mostrou regulação para baixo significativa de vias importantes envolvidas na EMT, imunossupressão e metástase:. Tais como IL6-, TGF-β e sinalização /β-catenina Wnt
Conclusão
Intact sinalização de progesterona no câncer endometrial não progressiva parece ser um fator importante estimular immunosurveilance e inibindo a transição de um epitelial a um mais mesenquimais, fenótipo mais invasivo
Citation:. van der Horst PH, Wang Y , Vandenput I, Kühne LC, Ewing PC, van IJcken WFJ, et al. (2012) Progesterona inibe epitelial-a-mesenquimal Transição no câncer de endométrio. PLoS ONE 7 (1): e30840. doi: 10.1371 /journal.pone.0030840
editor: Irina Agoulnik, Universidade Internacional da Flórida, Estados Unidos da América
Recebido: 23 de junho de 2011; Aceito: 22 de dezembro de 2011; Publicação: 25 de janeiro de 2012
Direitos de autor: © 2012 van der Horst et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. O trabalho de LJB e MvdZ é apoiado por uma bolsa da Cancer Society Holandês (EMCR 2008-4056). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análises, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declaram que não há interesses concorrentes existem
Introdução
a cada ano, em todo o mundo, mais de 287.000 mulheres desenvolvem cancro do endométrio tornando-o o câncer ginecológico mais comum no mundo eo quarto malignidade feminino mais comum em países desenvolvidos [1]. Normalmente câncer endometrial é detectado em um estágio inicial e cirurgia é a pedra angular do tratamento. Onde não é doença recorrente ou metastático, no entanto, a situação é diferente. radiação (neo) adjuvante e /ou terapia sistêmica em combinação com a cirurgia é geralmente indicada e, em geral, doença progressiva tem um prognóstico ruim responsável por 74.000 mortes no mundo a cada ano [2], [3]. Fatores prognósticos para recorrente e cancro do endométrio metastático incluem estágio cirúrgico FIGO, grau de diferenciação, subtipo histopatológico e do miométrio e invasão linfática [2], [4], [5], [6], [7].
em vários tipos de cancro, a presença de linfócitos infiltrados no tumor (TIL) tem sido correlacionada com melhor prognóstico, e muita investigação tem sido realizada sobre este tema [8], [9], [10], [11], [12] [13], [14], [15]. A base racional é que o cancro bem diferenciado evoca uma resposta inflamatória semelhante a uma lesão aguda, que, após a infiltração sequencial de diferentes populações de células dendríticas, eventualmente, resulta em infiltração de linfócitos T [16]. Infiltração de TIL como fator prognóstico positivo foi descrito pela primeira vez em melanoma cutâneo, onde a presença de TIL foi preditiva para melhorar a sobrevivência [8]. Galon et ai. Em 2006, mostrou que a infiltração de linfócitos do sistema imune adaptativo para o centro e a margem invasiva do cancro colorectal foi positivamente correlacionada com a recorrência reduzida e aumento da sobrevivência [10]. Em 2009 Kilic et al., Mostraram que os níveis elevados de TIL no cancro do pulmão de não-pequenas células correlacionada com recorrência e sobrevivência reduzida reforçada [12]. No cancro do ovário, a presença de intratumorais linfócitos T também foi correlacionada positivamente com a melhora na sobrevida e recorrência da doença [15] adiada. Além disso, TIL no câncer de ovário também foram associados com aumento dos níveis de INF-γ, IL-2 e quimiocinas, que indica a activação das células T e atração [15].
A presença de TIL não tem sido extensivamente investigada em câncer endometrial . No cancro do endométrio, infiltração de citotóxico (CD8 +) T-linfócitos na área da lesão foi descrito como um factor de risco independente e está positivamente correlacionada com a doença e sobrevivência LIVRE geral [17], [18]. Além disso, um /reguladora dos linfócitos T (/FOXP3 CD8) elevada relação de linfócitos T citotóxicos foi descrito para ser correlacionado com a melhoria da sobrevivência no tipo I cancro do endométrio [17].
ao lado do afluxo de t -lymphocytes para a área do tumor, a presença de receptores de progesterona (PR) é também descrito como um trunfo importante no prognóstico e tratamento de cancro do endométrio [19], [20], [21]. Na expressão PR câncer endometrial bem diferenciado é normalmente mantida e tratamento com acetato de medroxiprogesterona (MPA), dos pacientes com doença bem diferenciado que escolheram para preservar a fertilidade, é geralmente bem sucedido [22], [23]. Perda de PR, no entanto, é um factor de prognóstico negativo e está associada com doença progressiva na qual o tratamento é geralmente apenas MPA temporalmente bem sucedida em 15-20% dos casos [24]
.
Recentemente, o nosso grupo tem estudado o mecanismo através do qual a progesterona podem induzir a diferenciação durante o ciclo menstrual normal e pode inibir o crescimento do cancro do endométrio bem diferenciada. Observou-se que os resultados do tratamento de progesterona na indução da expressão de dois inibidores importantes da sinalização de Wnt /β-catenina: DKK1 e FOXO1 [25], [26]. No cancro do endométrio, a activação da sinalização de Wnt /β-catenina é observado em 30-40% dos carcinomas bem diferenciados endometrióides [27] e progesterona induziu a inibição da via de sinalização Wnt-se a hipótese de ser um mecanismo importante para reduzir a progressão do cancro [25] .
neste estudo teve como objetivo investigar o papel da progesterona como um inibidor direto das capacidades migratórias de células de cancro do endométrio e seu papel na inibição de linfócitos T associado de doença progressiva.
Materiais e Métodos
materiais paciente
endometrial primária carcinoma de tecido de mulheres com (n = 9) e sem (n = 9) um episódio conhecido de recorrência ou metástase, foi obtido de pacientes tratados entre 1997 e 2006 no Hospital Universitário Gasthuisberg, da Universidade Católica de Leuven, na Bélgica. Deste ponto em diante, a doença não recorrente é referido como doença não progressiva e doença recorrente /metastático como doença progressiva. Histopatológico de classificação, estadiamento e digitação foram determinados de acordo com as orientações da OMS e FIGO [28], [29] e todos os tumores foram revisadas por um patologista experiente em gynaecopathology (PCE). Os pacientes com um tipo endometrioid e um palco I carcinoma endometrial FIGO foram incluídos. Foram excluídos os pacientes tratados com esteróides hormonais radio ou quimioterapia antes da cirurgia, que utilizam ou com uma segunda malignidade. história clínica completa foi obtido de todos os pacientes e acompanhamento foi revisto para data. As amostras foram congeladas em azoto líquido para o ARN-isolamento ou fixados em formalina e embebidos em parafina para imuno-histoquímica (IHC). Para a análise de microarray, a partir de 4 não progressiva e 4 pacientes progressivos, pressão foram utilizadas amostras de tumores congelados. Estes foram escolhidos porque continham 80% de tecido tumoral e RNA de boa qualidade pode ser isolado a partir deles. Para RT-PCR, foram utilizados 6 não-progressiva e 6 de encaixe progressivo amostras de tecido do doente congelados. Para IHC 9 não progressiva e 9 de parafina progressiva incorporado amostras de tecido de pacientes estavam disponíveis. Tecidos e coleta de dados clínicos para o estudo atual pesquisa foi aprovada pelo Medical Comissão de Ética do Hospital Universitário Gasthuisberg e pacientes deram consentimento por escrito para a recolha de tecidos e coleta de dados clínicos informados para todos os fins de investigação.
cultura celular
Para todos os experimentos de linhas celulares, linhas celulares de cancro endometrial Ishikawa estavelmente transfectadas com PRA (IKPRA-1), PRB (IKPRB-1) ou PRA e PRB (IKPRAB-36) (previamente descrito por Smit-Koopman et al. [30]) foram cultivadas e mantidas em meio de cultura normal (DMEM /F12 Glutamax, Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) na presença de 5% de soro Fetal de vitela (Invitrogen) suplementado com penicilina e estreptomicina (Invitrogen). Neomicina (ICN Biomedicals, Costa Mesa, CA, EUA) e higromicina (Invitrogen) 1:200 foram usadas para manter a selecção. Para todos os ensaios, as células foram cultivadas em meio de cultura DMEM /F12 suplementado com Glutamax penicilina e estreptomicina (Invitrogen), contendo 5% de carvão FCS (Invitrogen) com adição de higromicina e neomicina.
A imuno-histoquímica
estudos de IHC para CD4 (Sanbio BV, Uden, Holanda), CD8 (Dako, Glostrup, Dinamarca), FOXP3 (Natutech, Frankfurt am Main, Alemanha) e PRA + PRB (progesterona Receptor Ab-8, Neomarkers, Fremont, CA, EUA) foram realizadas em 4 uM secções de parafina em Starfrost-lâminas (Knittel, Braunschweig, Alemanha). Antes da incubação com o anticorpo primário, as lâminas foram desparafinadas e re-hidratadas em xileno a 70% de etanol. Para CD4 + e CD8 + T-linfócito coloração, as lâminas foram micro-ondas a 850 Watt em Tris /EDTA pH 9,0 durante 15 min. A actividade da peroxidase endógena foi bloqueada com 30% H
2O
2 em PBS durante 5 min. Os anticorpos primários foram aplicados a respectivamente 1:160 (CD4) e 1:200 (CD8) em Tris /HCl pH 8,0 e incubou-se à temperatura ambiente durante 30 min. Depois de lavagem com Tris /HCl a pH 8,0, as secções foram incubadas durante 30 min. à temperatura ambiente com anticorpo secundário biotinilado (Dako, 1:400). Depois de lavagem com Tris /HCL, o substrato diaminobenzidina (Dako) foi usado para visualização de reactividade de antigénio-anticorpo.
Para FOXP3, as lâminas foram bloqueadas (peroxidase de desactivação) durante 20 min à temperatura ambiente (TA) em 30 % H
2O
2 em metanol e (recuperação de antigénios) fervida em um pH de citrato tampão 6,0 durante 15 min. O anticorpo primário foi aplicado a 1:25 e incubadas a 4 ° C durante a noite. Após lavagem com PBS, as lâminas foram incubadas durante 30 min. com um anticorpo secundário de coelho anti-rato (DAKO, 1:150) e incubou-se durante 30 min. com o AB-complexo (Dako). O substrato diaminobenzidina (Dako) foi usado para visualização de reactividade de antigénio-anticorpo.
Para a coloração PRA + PRB, a actividade da peroxidase endógena foi bloqueada durante 5 min à temperatura ambiente em cerca de 10% H
2O
2 em solução de metanol e as lâminas foram microondas (recuperação de antigénios) em um forno de microondas a 850 Watts, em 10 nM de tampão de ácido cítrico pH 6,0 (DAKO) durante 15 min. Após arrefecimento até à temperatura lâminas foram lavadas com PBS e bloqueadas durante 30 min com 0,3% de BSA /PBS. O anticorpo primário foi aplicado a 1:50 e incubadas a 4 ° C durante a noite. Após lavagem com PBS, as lâminas foram incubadas durante 30 minutos com um anticorpo cabra-anti-ratinho secundário biotinilado (Dako, 1:400). Após a segunda lavagem as lâminas foram incubadas durante 30 min com BA-complexo (Dako, 1:1:50). O substrato de diaminobenzidina (Dako) foi usado para visualização de reactividade. Todas as lâminas foram contrastadas com hematoxilina durante 30 s, em seguida, desidratadas e montadas.
Para a coloração de vimentina, um ensaio de cicatrização da ferida foi realizada em slides de duas cavidades de câmara (Lab-Tek, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA , EUA), na presença e na ausência de 1 nM o acetato de medroxiprogesterona (MPA), e terminada após 48 horas. As células foram lavadas três vezes com PBS, fixadas com formaldeído a 4% /PBS durante 15 minutos, e permeabilizadas com 0,3% Triton100 /PBS durante 5 minutos. Após lavagem, a actividade da peroxidase endógena foi bloqueada com 10% H
2O
2 em metanol durante 5 minutos. As lâminas foram lavadas e depois bloqueadas durante 30 minutos com 0,3% de BSA /PBS. O anticorpo anti-vimentina (Invitrogen) foi aplicado a 1:50 e as lâminas foram incubadas durante 30 minutos à temperatura ambiente. Após lavagem com PBS, as lâminas foram incubadas com um anticorpo secundário fluorescente GFP-cabra-anti-rato (Invitrogen) em 1:500. Após a lavagem, as lâminas foram incubadas durante 5 minutos com DAPI Staining Nucleic Acid Solution (Invitrogen) para a coloração nuclear. Após o termo da reacção com dH
2O, as lâminas foram montadas e as imagens fluorescentes foram tomadas com o Axioplan 2 imagens fluorescentes Microscope (Carl Zeiss, Jena, Alemanha).
TIL Contando
Após a coloração, as lâminas foram digitalizadas com o scanner de slides NDP (Hamamatsu, Hamamatsu, Japão) e CD4, CD8 e linfócitos tumor positivo infiltrando FOXP3 (TIL) foram contadas utilizando software Image J. (National Institutes of Health, Bethesda, MD , EUA). O número de TILs foi determinada no interior do tumor (intratumoral), na borda do tumor (Tumor da borda) e na fronteira do miométrio /endometrial (EM). A borda completa do tumor e a borda do endométrio /miométrio foram avaliados quanto à presença de TILs. A contagem intratumoral foi realizada pela contagem do TIL em 10 áreas escolhidas aleatoriamente diferentes (1170 mm × 932 mm) escolhidos por um investigador independente, erradicando assim viés do observador.
WST1 ensaio
Para o WST1 ensaio de proliferação, IKPRA-1, 1-IKPRB e IKPRAB-36 linhas de células foram cultivadas na ausência ou na presença de AMP em uma placa de 96 poços (Corning Costar, Cambridge, MA, EUA). No tempo 0, as células foram incubadas com o reagente de proliferação de células WST1 (Roche, Basileia, Suíça) durante 3 horas a 37 ° C e a absorvância foi medida com o leitor de microplacas (BIORAD, modelo 550, Hercules, CA, EUA). Após a medição da linha de base das linhas de células foram cultivadas na presença e na ausência de 1 nM AMP durante 96 horas e às 96 horas, o ensaio foi repetido WST1.
ensaios de migração
Para a cicatrização de feridas ensaio, IKPRA-1, 1-IKPRB e IKPRAB-36 linhas de células foram cultivadas numa placa de 6 poços (Corning Costar). Após indução da ferida, as células foram incubadas com 1 nM de AMP durante 96 horas. A cicatrização de feridas foi verificado a cada 24 horas por fotografia, e analisados medindo o fecho do ferimento.
Para o ensaio Boydon modificado, as células foram semeadas no poço superior de uma câmara de Boydon modificado (Transwell, 8 um poros, 24 mm, 6 inserções de placas bem, Corning Costar) a 2,5 x 10
5 células por poço, na presença ou na ausência de 1 nM MPA. Além disso, como um controlo, as células foram cultivadas numa câmara de Boyden, na presença ou na ausência de 1 nM de MPA em combinação com 100 nM do anticorpo anti-progestagin Org31489 (Organon, Oss, Holanda). Após 96 horas, as células que tinham migrado através do filtro para o poço inferior ou para a parte inferior do inserto foram tripsinizadas e contadas ao microscópio.
Western blotting
IKPRA-1, IKPRB- 1, IKPRAB-36 e IKLV-8 linhas de células foram cultivadas na ausência ou presença de 1 nM de AMP durante 96 horas e, subsequentemente, submetidas a lise a 0 ° C em Tampão de lise celular (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EUA) durante 5 minutos . Em seguida, as células foram raspadas, centrifugou-se a 14.000 rpm durante 10 minutos e o sobrenadante foi removido. A concentração de proteína foi calculada utilizando o kit de ensaio de proteína (Pierce, Thermo Scientific, Rockford, IL, EUA) e de cada amostra de 4,5 ug de proteína em 30 mL tampão de lise + BSA foi carregado num gel de SDS-PAGE a 10%. Western blotting foi realizado de acordo com procedimentos padrão. O papel mata-borrão foi bloqueada durante 30 minutos à temperatura ambiente com tampão de bloqueio (LI-COR Biotecnologia, Lincoln, NE, EUA) e, em seguida, incubadas durante a noite a 4 ° C utilizando anticorpo policlonal de coelho anti-hFOXO1 (1:5000, Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, EUA) em tampão de bloqueio (LI-COR Biotechnology). Em seguida, a membrana de blot foi incubado com a cabra-anti-coelho secundário de IgG (IRDye 800CW, 1:5000, LI-COR Biotechnology) durante 30 minutos à temperatura ambiente e lavou-se. Como um controlo de carga, a membrana foi incubada durante 30 minutos com o anticorpo anti-actina-β monoclonal (1:1000, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA), lavadas com PBS e incubadas durante 30 minutos com o secundário caprino anti-IgG de ratinho (IRDye 680CW, 1:5000, LI-COR Biotechnology). As bandas de proteínas específicas foram detectadas utilizando o sistema de digitalização Odyssey (LI-COR Biotechnology).
ARN-isolamento, análise da expressão do gene e quantitativo em tempo real de RT-PCR
amostras de tecido dos pacientes foram seccionados (5 um, criostato) e cada 10
th seção foi corado com HE e revisto pelo patologista (PCE) para avaliar a carga tumoral. Somente secções contendo 80% do tumor foram lisadas em Trizol (Invitrogen) e ultra-sons durante 1 min. A linha celular que expressa Ishikawa PRA e PRB (IKPRAB-36) foi cultivada durante 48 h na ausência ou na presença de 1 nM MPa (n = 3), colocadas em gelo e lisadas em Trizol (Invitrogen).
a separação de fases foi realizada com 0,2 ml de clorofórmio e centrifugação durante 15 min. O sobrenadante foi transferido e isopropanol foi adicionado para a precipitação de ARN. O RNA precipitado foi lavado com etanol a 75%. Todos os ARN foi limpa com o kit de limpeza de Rneasy MinElute (Qiagen, Venlo, Países Baixos). Quantidade e qualidade do ARN foi avaliada usando o Nanodrop (Nanodrop, Wilmington, DE, EUA) e bio-analisador (Aligent, Santa Clara, CA, EUA).
ARN isolado a partir de material paciente e a linha celular foi rotulado de acordo com protocolos de rotulagem Affymetrix e RNA marcado foi aplicado ao genoma ampla matrizes de expressão (GeneChips Affymetrix U133plus2 contendo 54.614 conjuntos de sondas, representando aproximadamente 47.000 transcritos (Affymetrix, Santa Clara, CA, EUA)). Usando RMA (Robust Multi-matriz Análise [31]), a normalização dos dados brutos foi realizada para ser capaz de produzir listas de genes e, eventualmente, calcular os genes significativamente regulada através de SAM (Stanford University, Stanford, CA, EUA [32]). Listas de SAM genes regulados (1,25 vezes ou mais;-delta valores que se assemelham a p 0,05) foram carregados na via Ingenuity ajudar software para avaliar o envolvimento de diferentes vias biológicas (Ingenuity, Redwood City, CA, EUA). Para os materiais de pacientes listas de matérias de genes regulados (1,25 vezes ou mais) foram carregados no Engenho
Todos os dados micro-array é compatível com dados e cru Miame foi depositado no banco de dados Miame compatível GEO sob série:. GSE29437 (consistindo de GSE29435: dados de linha de células, e GSE29436: os dados do paciente)
Genes para quantitativo em tempo real RT-PCR foram identificadas por análise de micro-arranjo e análise de caminho.. O RNA foi transcrito em cDNA com o uso do kit de síntese de ADNc de um ciclo de Affymetrix (Affymetrix). Para genes identificados, primers foram encomendados e testado (a lista de iniciadores está incluído na Tabela S1). O gene de manutenção β-actina foi utilizado como um gene de referência. RT-PCR foi realizada e analisados utilizando o sistema CFX RT-PCR (Bio-Rad, Veenendaal, Países Baixos).
Estatísticas
Para a análise estatística do CD4 +, CD8 + e FOXP3 + celular contagens, modificado dados Boyden ensaio de câmara, dados de ensaio WST1 e dados de RT-PCR, SPSS 15.0 foi utilizado (IBM, Armonk, NY, EUA). Para os dados distribuídos normais um teste-t para dados inclinados e um teste-U de Mann-Whitney foi realizado para avaliar os valores de P. Um valor de P 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Para calcular o valor-p de vias reguladas, Ingenuity via auxiliar software utiliza o teste exato de Fisher.
Resultados
características do paciente (Tabela 1)
Os pacientes com (n = 9) e sem (n = 9) cancro do endométrio progressiva foram incluídos. Todos os pacientes incluídos foram submetidos a abdominal- primária total ou histerectomia vaginal por laparoscopia assistida e um salpingo-ooforectomia bilateral combinada com remoção dos linfonodos. Nenhuma das mulheres receberam quimioterapia e apenas uma mulher no grupo doença progressiva foi dada radioterapia após a cirurgia. subtipos histopatológicos foram endometrioid (n = 17) e endometrioid mista /mucinóide (n = 1). os graus tumorais foram 1 (n = 7), 2 (n = 4) e 3 (n = 7) e as fases foram FIGO Ia (n = 11) e Ib (n = 7). No grupo doença progressiva todos os 9 pacientes tiveram um ou mais episódios de recorrência local e 4 pacientes desenvolveram uma ou múltiplas metástases distantes. As recorrências foram vaginais, ou pélvica (retro) peritoneal, e foram metástases nos pulmões (n = 3), fígado (n = 1), baço (n = 1) e cérebro (n = 1). O seguimento clínico até agora estava disponível para todos os pacientes. No grupo não progressivo 8 pacientes estão livres da doença e um paciente morreu no follow-up. No grupo doença progressiva 3 pacientes estão livres da doença e 6 pacientes morreram de sua doença relacionada com o cancro endometrial. As características dos pacientes são detalhados na Tabela 1.
status de receptor de progesterona e detecção de CD4 + T-helper, CD8 + células T citotóxicas e + células T reguladoras FOXP3 na doença não progressiva e progressiva
A presença de linfócitos infiltrantes de tumor tem sido correlacionada com a sobrevivência prolongada em câncer endometrial [17], [18]. Além disso, a perda de expressão do receptor de progesterona (PR) em cancro do endométrio foi encontrado para ser um factor de risco para a doença progressiva [33]. Para fundamentar a relação entre a sinalização PR intacta e a presença de infiltração de linfócitos na doença não progressiva, coloração imuno-histoquímica e, quando apropriado, medidas quantitativas foram realizadas.
Como exemplificado na Fig. 1A, em coloração imuno-histoquímica para a doença progressiva de células CD4 +, CD8 + e Foxp3 +-linfócitos parece ser reduzida quando comparada com a coloração no doença não progressiva. A quantificação do número de células CD4 +, CD8 + e Foxp3 +-linfócitos em doença progressiva, de facto confirmou que um menor número de células positivas localizadas na fronteira do endométrio-miométrio (Fig. 1B, EM), na borda do tumor (Fig. 1B, Borda de tumor) e no interior do tumor (Fig. 1B, intratumoral). Se as contagens de células reduzidas foram significativamente diferentes entre os tecidos de cancro do endométrio não progressivas e progressivas é indicado na figura (Fig 1B).
A:. Visão de coloração imuno-histoquímica para CD4, CD8 e FOXP3 em endometrial primária em espécimes de cancro da doença não progressiva (n = 9) quando comparado com doença progressiva (n = 9) (ampliação de 0,4x, embutimento 10x). mostra doença não progressiva pronunciada coloração, enquanto mostra doenças progressivas reduzida coloração. A escala-bar representa 10 mm. B: A quantificação de células T CD4, CD8 e as contagens de células FOXP3 sobre a borda do tumor (Tumor Borda), no tumor (intratumoral) e sobre a borda do endométrio-miométrio (fronteira EM). * Indica um valor de p 0,05 (teste de Mann-Whitney U-test). C e D: Representante não progressiva (C) e (D) tecidos progressivos pacientes foram coradas para CD4, CD8 e PRA + PRB e mostram uma correlação positiva entre a presença de TIL ea expressão de PR. Ampliação é 5x ea escala-bar representa 1 mm. Pacientes 6 e 11 foram incluídos nas análises de micro-array. Além disso paciente de 11 tinha apenas doença recorrente, enquanto o paciente 12 tinham doença recorrente e metastático.
Além disso, a revisão secções consecutivas na doença não progressiva para a expressão dos receptores de progesterona (PR) revelou que a presença de CD4 + e CD8 + linfócitos T foi positivamente correlacionada com a presença de coloração PR (Fig. 1C e 1D).
analisa expressão Genome-wide de tecido endometrial carcinoma primário
Para investigar se a correlação entre sinalização PR e a presença de linfócitos infiltrantes tumorais poderia indicar uma relação causal, uma análise da expressão de ARNm de todo o genoma em espécimes congelados instantaneamente primárias de carcinoma do endométrio a partir de 4 doentes sem e 4 pacientes com doença progressiva foi realizada. Ao nível do gene indivíduo observou-se que um número significativo de quimiocinas e citocinas foram regulados diferencialmente entre a doença não progressiva e progressiva (Tabela S2). Por exemplo, o CCL21 quimiocinas (-1.5x), CXCL9 (-2.9x), CXCL10 (-2.1x) e CXCL14 (três conjuntos de dados presentes: -33.0x; -20.5x; -6.4x, respectivamente) foram todos para baixo regulada na doença progressiva, enquanto as citocinas IL8 (2.0 x; 5.7x; 9,5x) e IL32 (1.9x) foram regulados positivamente na doença progressiva (Tabela S2). activação Além disso, trabalhos anteriores do nosso grupo indicou de sinalização de Wnt /β catenina na doença progressiva [25] e de acordo com isso um número de Wnt /β-catenina genes inhibitory- e de destino foram perdidos por doença progressiva (DKK1, DKK4 e WIF1) (Tabela S2).
Curiosamente, um número de genes acima mencionados, que foram regulados negativamente na doença progressiva, têm sido descritas na literatura para ser sobre-regulada por progesterona (CXCL14 [34], o DKK1 [25], MMP7 [35] e SFRP4 [36]). Isto está de acordo com a constatação de que o PR expressão (em proteína e nível de expressão de mRNA (Fig. 1C e 1D e Tabela S2) é regulada negativamente na doença progressiva.
Ao vias revisão regulada entre os não-progressiva e progressiva doença, a regulação de uma série de vias envolvidas na carcinogénese e doença invasiva e envolvidos na vigilância imunológica foi encontrado para ser significativamente regulada: integrina sinalização, Mecanismos moleculares de Câncer, Antigen Apresentação Pathway, não-pequenas células do câncer pulmonar Signaling, IGF-1 Sinalização, papel do factor tecidual em Câncer, leucócitos extravasamento Signaling, ERK /MAPK sinalização, colorectal Cancer Metástase de sinalização (que inclui /sinalização catenin β Wnt), FGF sinalização, FAK sinalização, etc (a lista completa das vias reguladas e seus valores p consecutivos pode ser acessado a partir da Tabela S3).
para um número de genes (CXCL14, DKK1, DKK4, PEG10 e WIF1) um quantitativo em tempo real RT-PCR foi realizada a fim de verificar regulação (Fig. 2).
CXCL14, DKK1, DKK4, WIF1 e PEG10 foram selecionados a partir dos resultados de micro-arranjo e verificada com tempo real RT-PCR. A significância foi calculado usando um teste-U de Mann-Whitney. Um valor-p de 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
Efeito da progesterona sobre a migração das linhas celulares de cancro endometrial Ishikawa
Para corroborar ainda mais o possível papel para a progesterona na regulação da invasão, Ishikawa linhas celulares de carcinoma do endométrio, estavelmente transfectadas com ARP, PRB, ou PRA e PRB [30] foram cultivadas na presença ou ausência de MPA, durante vários períodos de tempo e utilizado em duas experiências diferentes que medem a migração celular. Para verificar a proliferação de células durante as diferentes experiências de um teste de proliferação WST1 foi realizados que mostraram que, dentro do prazo indicado não há diferenças significativas na proliferação poderia ser detectado entre as células incubadas com ou sem MPA.
Na Figura 3, células de Ishikawa diferente linhas foram submetidos a um ensaio de cicatrização da ferida na presença ou ausência de MPA (1 nM) durante até 96 h. Observou-se que, nas estavelmente expressando PRB (IKPRB-1) e PRA + PRB que expressam (IKPRAB-36) linhas de células de Ishikawa, MPA inibiram o fecho do ferimento infligido manualmente (Fig. 3A-D). Além disso, quando corados na borda da ferida para a vimentina marcador mesenquimais, foi observado que, na presença da expressão de vimentina MPA foi claramente reduzida (Fig. 3E). Próximo a este detalhe na expressão de vimentina, os níveis globais de vimentina foram reduzidos em linhas IKPRB-1 e IKPRAB-36 células incubadas com 1 nM MPA. Observou-se também que, no (1-IKPRA) linha celular estavelmente expressando PRA Ishikawa, nem a cicatrização de feridas, nem expressão de vimentina foi afectada por MPA (Fig. 3A e 3E).
IKPRA-1 (A), IKPRB-1 (B) e IKPRAB-36 células (C) foram cultivadas na ausência (balas branco) ou na presença (balas pretos) de 1 nM MPA e usado para um ensaio de cicatrização da ferida (n = 3) e de fecho da ferida foi medida como uma percentagem de fecho total (100% significa que a ferida está aberta, 0% significa que a ferida foi fechada). D mostra imagens representativas do processo de cicatrização de feridas em vermelho com a ferida. E mostra IF para núcleos (DAPI) e expressão de vimentina na frente invasiva da ferida infligida manualmente. Nesta figura, a ferida estava sempre localizado no lado direito.
Na Figura 4, uma outra abordagem foi utilizada para estudar a capacidade migratória das diferentes linhas de células de Ishikawa, na presença ou ausência de progesterona. Observou-se que para IKPRB-1 bem como células IKPRAB-36, a migração de uma câmara de Boyden modificada foi inibida na presença de progesterona. Além disso, para a linha celular IKPRA-1 não foi observada tal regulação diferencial de migração sob o efeito do AMF.
IKPRA-1, 1-IKPRB e IKPRAB-36 As células foram cultivadas na ausência (pontos pretos ) ou na presença (pontos brancos) de 1 nM MPA numa câmara de Boyden modificada. Após 96 horas, as células que tinham migrado através dos poros do poço superior foram contadas. A figura representa três experiências independentes realizadas em triplicado. * Indica um valor de p 0,05 (Mann-Whitney U-test)
análise de expressão Genome-wide da linha de células de cancro do endométrio Ishikawa
Para mais progesterona documento. inibição induzida de migração celular e para investigar o envolvimento da sinalização da progesterona na infiltração de linfócitos T, células IKPRAB-36 foram cultivadas durante 48 h na presença ou na ausência de 1 nM MPA e utilizados para análise de expressão do genoma. Observou-se que 1616 genes foram significativamente regulada pela progesterona no 36-IKPRAB linha de células (1029-regulada, 587 regulada para baixo, Tabela S4).
Usando análise de caminho Ingenuity de genes regulados significativamente, o seguinte