Abstract

câncer

pulmão é a principal causa de morte por doenças malignas em todo o mundo, com o não-pequenas células ( NSCLC) subtipo responsável pela maioria dos casos. NSCLC é caracterizada por desequilíbrios frequentes genômicas e variações no número de cópias (CNVs), mas as aberrações epigenéticas que são associados com o prognóstico clínico e falha terapêutica não permanecem identificar completamente. No presente estudo, um total de 55 pacientes com câncer de pulmão foram incluídos e realizamos genômica e analisa a expressão genética, detecção de proteínas imuno-histoquímica, a metilação do DNA e ensaios de imunoprecipitação da cromatina para obter perfis genéticos e epigenéticos associados ao prognóstico e chemoresponse de pacientes com NSCLC. Finalmente, a transfecção mediada por siRNA silenciamento genético e cisplatina ensaios de citotoxicidade celular em linhas celulares de NSCLC A-427 e iner-37 foram avaliados para descrever os mecanismos envolvidos quimioresistência. Os resultados identificaram altas frequências de CNVs (66-51% dos casos) nos 7p22.3-p21.1 e 7p15.3-p15.2 regiões citogenéticos. No entanto, a superexpressão de genes, tais como

MEOX2

,

HDAC9

,

TWIST1

e

AhR

, em 7p21.2-p21.1 lócus ocorreu apesar da ausência de CNVs e pequenas mudanças na metilação do DNA. Em contraste, as sequências do promotor de

MEOX2

e

TWIST1

exibido significativamente menor /diminuição na marca histona repressivo H3K27me3 e aumento na marca histona ativa níveis H3K4me3. Finalmente estes resultados se correlacionam com pior sobrevida em pacientes com NSCLC e chemoresistance celular para medicamentos oncológicos em linhas celulares de NSCLC em um

MEOX2

e

TWIST1

superexpressão-dependente maneira. Em conclusão, relatamos pela primeira vez que

MEOX2

participa chemoresistance independentemente da alta CNV, mas é significativamente dependente de enriquecimento H3K27me3 provavelmente associada com a agressividade e insuficiência quimioterapia em pacientes com NSCLC, os estudos clínicos no entanto adicionais devem ser realizados para confirmar nossos resultados como novos marcadores clínicos prováveis ​​em pacientes com NSCLC

Citation:. Ávila Moreno-F, Armas-López L, Álvarez-Moran AM, López-Bujanda Z, Ortiz-Quintero B, Hidalgo-Miranda Um, et ai. (2014) sobre-expressão de

MEOX2

e

TWIST1

está associada com níveis H3K27me3 e determina Lung Cancer chemoresistance e prognóstico. PLoS ONE 9 (12): e114104. doi: 10.1371 /journal.pone.0114104

editor: Santosh Patnaik, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 12 Agosto, 2014; Aceito: 29 de outubro de 2014; Publicação: 02 de dezembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Ávila-Moreno et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e suas Apoio figuras informações e arquivos. dados de matriz foram submetidas ao banco de dados GEO (GSE62407)

Financiamento:. FAM autor foi apoiado pelo Conselho Nacional de Ciência e Tecnologia (CONACyT), fundos na investigação em Ciências Básicas, Projeto 0.053.643; Direção de Pesquisa do Instituto Nacional de Doenças Respiratórias (INER); e da Universidade Nacional Autônoma do México, UNAM, Projetos IACOD-PAPIIT IA201611, PAPIIT IB202512 e PAPIIT RR282512. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução cancer

Lung continua a ser a principal causa de morte relacionada ao câncer em ambos os EUA [1] e em todo o mundo, com o subtipo de células não pequenas (NSCLC), que representam a maioria dos casos em fumantes e não-do Tabaco pacientes relacionados [2]. diagnósticos tardios e terapêutica ineficientes contribuir para prognósticos pobres e às taxas médias de sobrevivência de 5 anos menos de 15% [1], [3], [4], [5].

NSCLC é caracterizada por anormalidades genómicas, que incluem variações no número de cópias de ADN somáticas comuns (CNVs). hibridização genômica comparativa (CGH) por cariotipagem espectral [6] ou ensaios de DNA genômico de microarray de baixa resolução [7], as perdas [8], [9] têm destacado /eliminações em 2q36-37, 3p21, 8p22, 9p21-22, 9q22 , 13q22 e 17p12-13 e ganhos /amplificações em 1q23, 1q31, 3q25-27, 5p13-14, 6p, 7q e 8q23-24; No entanto, poucas dessas alterações foram mostrados para ser envolvido na agressividade do tumor [9] ou a evolução clínica do NSCLC.

Recentemente, consórcios internacionais para o estudo do cancro do pulmão têm usado matrizes SNP de alta densidade (250 K) para descrever CNVs, tais como 5p15.33, 7p11.2, 14q13.3 e 17q12, bem como deleções em 5q11.2, e 7q11.22 9p23 [10]. Algumas dessas CNVs, como ganhos em 14q13.3 contendo o

NKX2-8

[11] e

NKX2-1

genes [10], foram mostrados para ser funcionalmente envolvido no crescimento , a sobrevivência ea atividade tumorigénico em NSCLC [10], [11]. Aumentos na CNV nos 5p13.2 locus de ter sido proposto como um novo marcador molecular de pré-início invasividade [12]. Além disso, a assinatura genética do mRNA superexpressão de 7q11.23, 14q23.2 e 17q21.2 (

STX1A

,

HIF1A

e

CCR7

, respectivamente) tem sido identificada como uma assinatura preditiva progressão-prognóstico durante os estágios clínicos precoces de doentes com NSCLC [13].

mau prognóstico têm sido associados com o locus 7p, o que pode ser devido, em parte, ao aumento da CNV e a sobre-expressão de oncogenes potenciais em 7p15.3-11.2, que foram descritos em 56% das linhas celulares de NSCLC [14]. Além disso, os ganhos em 7p12-21 foram identificados em quase 50% dos doentes com doença metastática NSCLC [15], o que pode representar um dos modelos de evolução cariotípico de CPCNP com base nos rendimentos de [16] cromossoma 7. Além disso, aberrações epigenéticas, como a hipermetilação DNA em 7p15.2 [17], podem representar mecanismos relevantes regulatórias e /ou marcadores, não só para a biologia do cancro do pulmão [16], mas também para a progressão NSCLC, devido à sua presença durante o início [ ,,,0],17] e estágios tardios [10], [11], [15]. No entanto, até à data, as relações moleculares entre CNVs de alta frequência, aberrações epigenética, prognósticos de pacientes e falha oncológica em NSCLC ainda não foram totalmente investigadas.

No presente estudo, buscou-se correlacionar possíveis modificações epigenéticas com o padrão de ADN de copiar mudanças de números em NSCLC através da utilização de matrizes de alta resolução ladrilhos SNP (500 K). Identificamos amplificações nas 7p22.3-p22.1, 7p21.3-p21.1 e 7p15.3-p15.2 regiões citogenéticas na faixa de 66-51% dos nossos casos. Estas amplificações resultou em

MEOX2

,

HDAC9

,

TWIST1

e

AhR

superexpressão apesar das pequenas aumento dos níveis de metilação do DNA. No entanto, o enriquecimento significativamente menor do repressor histona marcador H3K27me3 eo significativamente maior ativação do H3K4me3 tanto no

MEOX2

e

TWIST1

regiões promotoras foram correlacionados com prognósticos clínicos pobres. Portanto, como foi demonstrado em modelos de linhas celulares de NSCLC, cisplatina chemoresistance correlaciona-se com uma expressão excessiva de

MEOX2

e

TWIST1

genes, principalmente devido à perda das histonas marcas repressivas H3K27me3. Nossos resultados sugerem que mecanismos epigenéticos exceder aberrações genéticas (CNV) em 7p21 e complementá-los, contribuindo assim para a agressividade eo fracasso da terapia oncológica em pacientes com NSCLC.

Materiais e Métodos

Amostra de seleção

Um total de 55 tumores de pulmão (LT), 15 tecidos não-envolvidos adjacentes pulmão combinado (LNAT) e 20 lesões precursoras do pulmão (LP) do fresco Congelado (FF) e fixadas em formalina e embebidos em parafina (FFPE) tecidos métodos de processamento, foram coletadas a partir do Serviço de Cirurgia Torácica e Serviço de Patologia do Instituto Nacional de Doenças respiratórias (INER). Além disso, as linhas celulares de NSCLC SK-MES-1, A-549, A-427, foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EUA) e INER-37, INER-51 foram obtidos a partir mexicana mestiço pacientes, conforme relatado anteriormente [18], [19].

Ética Declaração

a Institutional Review Board (IRB) do Instituto Nacional de Doenças respiratórias (INER) aprovou os protocolos com B17 registo -07 e B09-08, e da Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), FES-Iztacala, Unidade de Pesquisa de Biomedicina analisou e aprovou os protocolos para estes estudos de genética e biologia molecular. O consentimento informado foi obtido de pacientes com diagnóstico de LT e submetidos a procedimentos cirúrgicos. Todos os indivíduos assinaram a carta de consentimento informado para estes estudos de pesquisa no serviço de cirurgia torácica, INER e autorizaram o armazenamento de suas amostras biológicas em repositórios INER e UNAM para esta e futuras estudos. Neste estudo não foram coletadas amostras de menores /crianças, apenas adultos jovens com idade superior a 18 anos foram incluídos.

SNP Mapeamento de matriz 500 K hibridação e Bioinformática Análises

Um total de 30 LNAT, LT, amostras de DNA de linha de célula de LP e NSCLC foram incluídos na plataforma de hibridação matriz (SNP 500 K) e em alguns casos para SNP 6,0 matrizes, de acordo com as instruções recomendadas pelo fabricante (Affymetrix, Santa Clara, CA, EUA) e analisaram-se utilizando o método anteriormente descrito [20] por comparação 300 dadores saudáveis ​​humanos por parte da população mexicana mestiço base de dados de haplótipos Mapa anteriormente descrito [21]. Affymetrix SNP matrizes de dados (Affymetrix Console Versão 4.1.3), foram importadas, normalizado e aumentos de CNV foram identificados utilizando padrões Partek Genomics Programa Suite e Partek Genome Veja Tools (Partek, Saint Louis, MI, USA), quando a média de 20 SNP excedeu a proporção do número de cópias de 2,5 ou foi inferior a 1,5 (

FDR

≤0.02). previsão via análises dos genes com alterações no número de cópias em nossas amostras de NSCLC (S1 Arquivo) foram realizadas utilizando o Programa Sistema Ingenuity Software (Versão 7.0). A lista de genes aberrantes incluídos na nossa previsão via celular análises, foram seleccionados com base na disponibilidade de perfis de expressão em tecidos de pulmão humano e tecidos de carcinoma de pulmão, usando os dados de navegação no EntrezGene (https://www.ncbi.nlm.nih.gov /gene) e um navegador web Human gene GeneCards banco de dados (https://www.genecards.org/). dados de matriz SNP incluídos no presente estudo foram submetidos e aprovados pela Omnibus (GEO) do banco de dados Gene Expression com o número oficial GEO:. GSE62407

imuno-histoquímica Os ensaios em amostras histológicas

análises de imuno-histoquímica foram realizados em LNAT, amostras de tecido e LP LT fixada com formaldeído a 10% ou a esperança de I /II Método reactivo (Innovative Diagnostik-System, Alemanha), e, subsequentemente, utilizando 1-2 microgramas de anticorpos específicos anti-MEOX2, anti-TWIST1, anti-HDAC9 , e anti-EVX1 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, EUA), por incubação numa câmara de humidade e, além disso a reacção específica do antigénio com o sistema peroxidase /diamino-benzidina avidina-biotina (Dako, Carpinteria, CA, EUA ). Um dispositivo Ventana System (Roche, Tucson, Arizona, EUA) e um estudo de microscopia de luz transmitida (Leica, Bannockburn, IL, EUA), foram usados ​​para obter microfotografias em 40X e 80X de ampliação.

Real-Time PCR para a expressão de ARNm e ADN Quantificação Ensaios

para as análises de expressão de ARNm, ADNc foi sintetizado a partir de 2 ug de ARN total utilizando o Kit de alta Capacidade (Life Technologies Corporation, Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). ADNc e ADN genómico também foram amplificadas utilizando ensaios de SYBR Green qPCR e conjuntos de oligonucleótidos desenhados por Primer desenho e /ou programas de software Vector NT, e sintetizados por Sigma-Genosys (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA), descrito para o ARNm ensaios de expressão na Tabela S1, e para a análise de sequências de promotor de ADN na Tabela S2.

quantitativa PCR em tempo real (qPCR) foi realizada num Passo um Plus e 7500 dispositivo (Life Technologies Corporation, Applied Biosystems, Foster City , CA, EUA), e num sistema LightCycler 480 (Roche, Mannheim, Alemanha), utilizando a energia SYBR Green (Life Technologies Corporation, Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) e Maxima SYBR Green master Mix qPCR (Thermo Fisher Scientific , Fermentas, Life Science, Foster City, CA,).

Condições de reacção de PCR quantitativa relativa utilizando SYBR Green Fermentas foram como se segue, um ciclo de 50 ° C durante 2 min, um ciclo de 95 ° C durante 10 min, 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s, 60 ° C durante 30 s, e passo de extensão adicional a 60 ° C durante 30 s. Enquanto que para Applied Biosystems Poder SYBR verde foram os seguintes: um ciclo de 50 ° C durante 2 min, um ciclo de 95 ° C durante 10 min, 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s, 60 ° C durante 30 s, e 72 ° C por 30 s. No final da reacção de PCR, as amostras foram submetidas a uma análise de fusão para confirmar a especificidade do fragmento amplificado, e o gene β-actina foi utilizado como limpeza para a análise de normalização.

Ensaios de Enzima de Restrição A metilação-sensíveis

estado de metilação de ADN genómico (200 ng), que foi derivado de LNAT, LT e LP tecidos e linhas celulares de cancro de pulmão foi examinada utilizando 0,5 unidades de cada uma de uma combinação de enzimas de restrição sensíveis à metilação

Hpall

,

HpyCH4IV

e /ou

Acil

(New England Biolabs, Ipswich, MA, EUA) e incubando a 37 ° C, durante 4 h. Seguido por ensaios de amplificação PCR sensíveis à metilação usando conjuntos de oligonucleotídeos (Tabela S2), concebidos dentro das ilhas CpG previstos de genes alvo do promotor (

MEOX2

,

HDAC9, TWIST1

, e

AhR

), seguindo critérios como o tamanho da ilha 100, e por cento GC . 50.0, utilizando MethPrimer para envolver o maior número de sítios de restrição para atingir as enzimas sensíveis à metilação, dentro do amplicon e indicou na Tabela S3

a metilação Sensitive PCR

Padrão de metilação (%) foi calculada com base em ensaios de PCR sensível à metilação, utilizando conjuntos de oligonucleotídeos contendo locais CpG dentro do amplicon em genes alvo do promotor estudadas (

MEOX2

,

HDAC9, TWIST1

, e

AhR

) descrito na Tabela S3. Resumidamente, 50 ng de ADN digeridos foram utilizados como entrada em 25 ul de total de reacção de PCR, e tamanhos de produtos analisados, de acordo com a Tabela S3, segue as seguintes condies de PCR: um ciclo de 95 ° C durante 10 min, 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s, 55 ° C durante 30 s e 72 ° C 45 s.

Além disso, as linhas de células de pulmão humano (NSCLC) a-427 e INER-37 foram usadas para normalizar as condições de restrição enzimática, desenvolvimento de

in vitro

ensaios de metilação de CpG utilizando metil-transferase (M.SssI) e S-adenosil-metionina (SAM), por incubação a 37 ° C durante 4 h. DNA metilado padrão e DNA do esperma humano extraído de doadores saudáveis ​​foram usados ​​como controles de DNA hiper-metilados e metilados-hipo para ensaios de restrição enzimática.

In Vitro

DNA metilação e histona Modificação Ensaios de Inibição

A-37 iNER linhas de células humanas NSCLC (adenocarcinoma) (5 × 10

5 células) foram tratados

in vitro

com 5′-aza-desoxicitidina [4 mm A-427 e ], para inibir

de novo

metilação do DNA em promotores de sequência, e /ou com TSA [300 nM], para inibir a actividade de histona-desacetilases (HDACs) durante 48 h.

Cromatina imunoprecipitação (ChIP)

LT congelado fresco (3 mm

3) foram pulverizados sob congelação de azoto líquido e fixadas com formaldeído a 1% durante 10 minutos, e imediatamente neutralizado com 0,125 M de glicina durante 5 min. As células resultantes foram lavados com 1% de PBS, e lisadas com o tampão de lise (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, NaCl 140 mM, EDTA 1 mM, pH 8, Triton X-100 a 1%, 0,1% desoxicolato de sódio, 0,1% de SDS) contendo inibidor da protease

completa Mini

1 comprimido em 10 ml (Roche, Indianapolis, IN, EUA).

a cromatina de amostras de LT foi sonicada com 10 pulsos de 20 segundos w /u 60 watts. 10 ug de cromatina foi imunoprecipitada (ChIP) utilizando o kit comercial de EZ-Magna ChIP L (Millipore, Temecula, CA, EUA), e utilizando 2,5 ug de anti-H3K27Ac, ​​anti-H3K4me3, anti-H3K27me3, anti-H3K9me3 e anti anticorpos ativados-ARN Pol II (Abcam, Cambridge Science Park, Cambridge, UK). 1 ug de IgG anti-rato foi utilizada como um controlo negativo para a apara (Millipore, Temecula, CA, EUA). A integridade e a qualidade das sequências de promotor de ADN imuno-precipitado (IP-ADN) foram avaliados pelo produto de amplificação de PCR de 166 pb para a sequência do promotor do GADPH gene, tal como recomendado pelo fornecedor (Millipore, Temecula, CA, EUA).

-DNA IP de amplificação e chip análises quantitativas usando qPCR Ensaios

ADN imunoprecipitado (IP-DNA) 20 ng foi amplificado linearmente usando o Kit Whole Genome Amplification (WGA1) (Sigma, St. Louis, MO , EUA), e depois disso foi purificado por colunas MiniElute (Qiagen, Hilden Renania-Westfalia, Alemanha).

A-ADN de IP obtida a partir de ambas as amostras e linhas de células de LT LT foram analisadas por qPCR quantificação absoluta utilizando LightCycler 480 System (Roche, Mannheim, Alemanha), e SYBR Mix verde master (Thermo Fisher Scientific, Fermentas vida Ciências, Foster City, CA, EUA) e oligonucleotídeos conjuntos para as metas e controles (Tabela S2).

IP-ADN 20 ng foram usadas por reacção, da mesma forma amplificação de curvas padrão foram desenvolvidos, através de diluições em série de ADN nativa de células mononucleares do sangue periférico de dadores saudáveis ​​(100 ng, 10 ng, 1 ng, 0,1 ng e 0,01 ng), e usando sequências oligonucleotídicas alvos (Tabela S2), e controlos de sequência de oligonucleótidos como promotor de C-fos retirado do kit de Cromatina imunoprecipitação Ampliação System (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA).

Citotoxicidade Celular Ensaios

análises viabilidade celular foram realizados em placas de 96 poços, utilizando 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) -2H-tetrazólio (MTS ) (Promega, Madison, WI, EUA) na ausência ou presença da droga cisplatina oncológica. Para fazer isso, as placas de 96 poços foram semeadas com 3000 a 5000 células em 200 ul de meio RPMI-1640 durante 48 horas e, subsequentemente, incubada com 10 ul de MTS [5 mg /mL] durante 3 h, para posterior leitura a 550 nm e /ou 570 nm, utilizando a fórmula: viabilidade celular = (dO da amostra /OD de controlo) × 100. Da mesma forma, as curvas de resistência a drogas foram desenvolvidas de uma forma dependente da dose-resposta utilizando diluições em série do cisplatina droga contra o câncer.

silenciamento genético (siRNA transfecção Ensaios)

Nós utilizados pequenos RNAs interferentes (siRNAs) dirigido contra o

MEOX2

(SC-106233),

TWIST1

(SC-38604) e não-humano relacionado ARNm como um controlo negativo (SC-37007 e SC-44230), todos obtidos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, Texas, EUA). Resumidamente, as culturas de células com 3% de FCS sem antibiótico foram incubadas em placas de 96 poços durante 12 h e, em seguida, transfectadas com o ARNi de reagentes, lipofectamina (Life Technologies Corporation, Invitrogen, Foster City, CA, EUA) e os siRNAs a 50 nM, num volume total de 100 ul.

Western Blot

as proteínas foram extraídas e purificado pelo método de TRIZOL (Invitrogen), suspenso em SDS a 5% com inibidores de protease (complete Mini, Roche, Indianapolis, IN, EUA), e quantificada pelo método de Lowry. Total de proteínas (30 ug) foram sujeitas a electroforese em géis de acrilamida verticais 12%, e depois foram transferidos para membranas de nitrocelulose utilizando equipamento Trans-Blot-Turbo /Transferência Sistema (BioRad, Hercules, CA, EUA). As membranas foram incubadas durante a noite a 4 ° C, bloqueio com leite magro 5% em PBS 1X /Tween 20 a 0,1%, e incubou-se 2 h com anticorpos (MEOX2) 1:1500, (TWIST1) 1:1500, (β-actina) 1 :3000, ou (GAPDH) 1:3000 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, EUA). As membranas foram incubadas durante 1 h com um anticorpo secundário (anti rato HRP /anti-coelho HRP) 1:10000, à temperatura ambiente e revelada com luminol 1 min à temperatura ambiente com o scanner C dígitos (LI-COR, Lincon, Nebraska, EUA ) e Hypercassette e Films (Amersham, Chalfont, Buckinghamshire, Inglaterra).

Análises estatísticas

o teste exato de Fisher,

t

testes estatísticos Mann Whitney-U -teste e foram usado para analisar as diferenças entre os grupos de pacientes,

p

valoriza ≤0.05 foram considerados estatisticamente significativos. Nós também utilizado Log-Rank (Mantel Cox) e Gehan-Breslow-Wilcoxon testes curva de sobrevivência. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando software estatístico SPSS para Mac-OS X (versão 11.0) e GraphPad (versão 5.0).

Resultados

cromossômica Microaberrations e Aumento variações do número de cópia (CNVs) com alta frequências em 7p22-21 e 7p15 em pacientes com câncer pulmonar

a fim de identificar os microaberrations genéticas mais frequentes com seus perfis de expressão genética prováveis ​​e aberrações epigenéticas em pacientes com câncer de pulmão, LNAT-, LP-, LT e NSCLC linha de células derivadas de amostras de DNA (n = 30) foram submetidos a ensaios de hibridização genómicos em SNP 500 K microarrays. A análise bioinformática segmentar permitiu a identificação de aberrações cromossómicas e aumentou CNVs nas amostras de LT-derivados, os quais não foram observados nos tecidos emparelhados LNAT-derivados. aberrações cromossómicas típicas em câncer de pulmão incluindo 3p exclusões; ampliação de várias regiões nos cromossomos 5, 12, 14, 16, 18, 19 e 20; e a amplificação /supressão de várias regiões do cromossoma 8 foram identificados (Figura 1A).

análise focal de todo o genoma e cromossoma 7. (A) A amplificação de todo o genoma e uma análise bioinformática segmentar de três cancro do pulmão pacientes foi realizado utilizando tecido combinado, histologicamente ao lado de pulmão não-envolvidos (LNAT) e carcinomas pulmonares (LT). (B) todo o genoma e análises focais de pulmão normal, lesões precursoras de pulmão e carcinomas pulmonares (18-14 de 27 lesões pulmonares com alta CNV). (C) Uma análise focal do cromossomo 7 revelou uma elevada frequência de CNV na região 7p21 (seta) em lesões pulmonares precursoras e carcinomas pulmonares.

A alta frequência de CNV usando genômica focal analisa em 7p22. 3-p22.1, foram detectados 7p21.3-p21.1 e 7p15.3-p15.2 (Figura 1B). Em particular, observou-se amplificações de ADN no locus de 7p21.1 nas amostras LT- e LP derivadas em quase 55% dos casos (15/27 lesões pulmonares), incluindo 3 de 4 lesões precursoras (Figura 1C e Figura S1), que não foram observados nas amostras LNAT-derivados (Figura 1C).

Além disso, constatou-se aumentos na CNV no locus 7p em ambas as amostras e LP- LT-derivadas utilizando a plataforma SNP 6.0 (Figura S2 ). Os 39 genes com as maiores taxas de mudança na CNV são apresentados na Tabela S4. Essas mudanças foram localizados nas 7p22.3-p22.1 e 7p21.3-p21.1 regiões citogenéticas, e eles incluídos

ZNF12

,

RPA3

,

MEOX2

,

BZW2

,

TSPAN13

,

AGR2

,

AGR3

,

AhR

,

TWIST1

e

HDAC9

. Mudanças no

TWISTN

,

HNRNPA2

,

CBX3

, o

HOXA

cluster e

EVX1

, que estão localizados em 7p15. 3-p15.2, também foram identificados (Tabela S4).

Detectamos um total de 1.376 genes com número de cópias muda em nossas amostras de câncer de pulmão humano (S1 Arquivo). Destes genes, 809 genes foram amplificados com uma frequência de 37-66% no cromossomo 7.

Com base nesta análise, encontramos um enriquecimento de genes envolvidos em várias vias de sinalização celular, particularmente controle do ciclo celular, movimento celular , a morte de células embrionárias e redes de desenvolvimento (dados não mostrados), alguns deles listados na Tabela S4, sugerindo que as aberrações genéticas e /ou epigenética estão a jogar um papel funcional importante na biologia do cancro do pulmão.

aumenta em CNV em 7p21 e 7p15 se correlaciona com mRNA e superexpressão da proteína e não com DNA metilação no câncer de pulmão

foram analisados ​​a correlação entre o aumento da CNV e níveis de expressão de mRNA relativos, bem como o impacto da metilação do DNA em perfis de expressão de mRNA em carcinomas de pulmão. Usando ensaios de qRT-PCR, verificamos que apenas

MEOX2

,

HDAC9

e

TWIST1

(Figura 2A), bem como

AhR

e

EVX1

genes (Figura S3A-B) foram sobre-expressos e positivamente correlacionada com a CNV de alta contexto (Figura 1B e C, e a Figura S1), em comparação com outros genes em 7p21 (não mostrado). A expressão destes genes foi significativamente superior nas amostras derivadas de LT do que nas amostras LNAT-derivados (

P

≤0.05). Além disso, os níveis de proteína nuclear de

MEOX2

,

HDAC9

e

TWIST1

foram consistentemente aumentou nas amostras de LT-derivados (Figura 2B), bem como

MEOX2

e

TWIST1

níveis de proteína /abundância em linhas celulares de NSCLC (Figura S4A-C), ao passo que a expressão destas proteínas no parênquima pulmonar adjacente e as amostras LNAT derivados não foram aumentados (Figura 2B ), tal como detectado por imunoistoquímica. Um aumento na

EVX1

expressão foi detectada nas membranas nas amostras LP- e LT-derivados e as linhas celulares de NSCLC (Figura S5A-B).

(A)

MEOX2

,

HDAC9

e

TWIST1

expressão de mRNA. As barras de erro representam 95% de intervalo de confiança da média. (B) A expressão de proteínas em tecidos não-envolvidos adjacente pulmão (LNAT), lesões precursoras de pulmão (LP) e carcinomas do pulmão (LT) (microfotografias em 200X e 400X), bem como fixado em formalina e embebidos em parafina (FFPE) e congeladas (FF) tecidos frescos, foram comparados. A análise da sequência de metilação (C) Promotor. As diferenças foram estatisticamente significativas em relação ao LNAT e foram detectados pelo teste exato de Fisher, um unpaired

t

-teste e um teste de Mann-Whitney U, *

p

≤0.05; **

p

≤0.005; ***

p

≤0.001. As barras de erro indicam min a classificação máxima com intervalo de confiança de 95%, e diagramas de caixa representam desvios padrão da média.

Para explorar ainda mais o efeito sobre a expressão gênica de genes associados à CNV, o envolvimento de epigenética alterações, em particular, a metilação do DNA foi avaliada. ensaios de restrição enzimáticos sensíveis à metilação revelou pequenas diferenças na porcentagem de metilação do DNA entre as amostras LNAT- e LT-derivados nas sequências do promotor de

MEOX2

,

HDAC9

e

TWIST1

(Figura 2C), o que sugere uma falta de correlação entre a expressão do ARNm e metilação de ADN (Figura 2A e 2C). Além disso, foi identificada uma redução na metilação do DNA para o

MEOX2

,

HDAC9

e

TWIST1

(

p

≤0.005 e

p

≤0.001, respectivamente), nas amostras de LP-derivados que não foram observados nas amostras LNAT- e LT-derivados (Figura 2C).

Como um complemento, uma análise emparelhada entre o LNAT- e LT amostras -derived em alguns pacientes CNV-livres também revelou uma sobre-expressão de mRNA de

MEOX2

,

HDAC9

, e

TWIST1

, sugerindo uma falta de genética (CNV) e epigenética (metilação do ADN) correlação (Figura S6A-C), e uma falta de correlação genética-epigenética CNV em pacientes de alto (Figura S7A-C); com exceção para o

AhR

gene entre LNAT- e LT-amostras (Figura S3A, S3C), e entre pacientes CNV-livres e CNV-elevadas (S6D e S7D). Em resumo, nossos dados sugerem que a metilação do DNA não é o principal responsável pelos padrões de expressão observada em 7p21 região de citogenética em carcinomas pulmonares, como NSCLC.

Diminui do Código histona de H3K27me3 e aumenta em H3K4me3 são associado a

MEOX2

e

TWIST1

superexpressão e correlacionadas com prognóstico clínico pobre em NSCLC

por isso, pedimos se outras modificações epigenéticas pode participar na regulação dos genes afetados, concentrando-se em 7p21 região de citogenética em NSCLC.

Nesta, como um estudo de validação completamente independente, o papel das modificações das histonas na superexpressão de

MEOX2

e

TWIST1

em pacientes com NSCLC foi avaliada. Para esta análise um grupo adicional de pacientes que tinham sido submetidos a um acompanhamento clínico foi estudado para determinar se

MEOX2

e

TWIST1

superexpressão no tecido tumoral foi associado com os níveis de H3K27me3

vs.

H3K27Ac e H3K4me3 e pode determinar o prognóstico e /ou capacidade de resposta ao tratamento oncológico em pacientes com NSCLC.

a análise pareada entre as amostras LNAT- e LT-derivados, em associação com a

MEOX2

e

TWIST1

superexpressão (Figura 3A-B), revelou uma redução na H3K27me3 (Figura 3C-D). Os pacientes com baixos níveis de enriquecimento da histona repressivo H3K27me3 e alta

MEOX2

e

TWIST1

expressão de mRNA (Figura 3A-D) apresentado taxas de sobrevivência pobres, com uma média de 6,2 meses (DSE, RSCL, MGGR, GOMJ e GCH pacientes) enquanto os pacientes com maiores níveis de enriquecimento H3K27me3 e baixo

MEOX2

e

TWIST1

expressão de mRNA (Figura 3A-D) apresentado melhores taxas de sobrevivência, com uma média de 53,4 meses (pacientes GMRM, AEE, SPN, GHM e PMA, com

p

≤0.0027) (Figura 3E, Tabela 1).

(A)

expressão MEOX2

em NSCLC e as amostras LNAT-derivados, e (B)

expressão TWIST1

em NSCLC e as amostras LNAT-derivados. As barras de erro representam erros padrão da média de três réplicas. perfil de enriquecimento (C) a modificação da histona do MEOX2

sequência promotora. perfil de enriquecimento (D) a modificação da histona do

TWIST1

sequência promotora. Os diagramas de caixa representam a média de três réplicas. A análise revelou uma correlação entre a baixa expressão do mRNA e enriquecimento H3K27me3. curva (E) Survival análises baseadas em Log-Rank (Mantel Cox) e testes Gehan-Breslow-Wilcoxon do índice de expressão relativa da

MEOX2

mais

TWIST1

(

p

≤0.0027).

Além disso, níveis significativamente aumentados (

p

≤0.008) do marcador histona repressivo H3K27me3 tanto no

MEOX2 Comprar e

TWIST1

sequências do promotor foram confirmados para aqueles pacientes com taxas de sobrevivência mais elevadas (Figura 4A-B). No entanto, não há alterações significativas nos níveis H3K27Ac foram observados (Figura 4C-D). Em contraste, a redução dos níveis de os H3K4me3 marcador de ativação foram detectados tanto no

MEOX2

(

p

≤0.028) e

TWIST1

(

p

≤ 0,0006) sequências de promotor no grupo de alta sobrevivência de pacientes (Figura 4E-F) e foram correlacionados com resposta parcial ao adjuvante cisplatina ou carboplatina, como a primeira quimioterapia linha em pacientes com NSCLC (Tabela 1).

(a ) enriquecimento H3K27me3 no

MEOX2

sequência promotora (** teste de Mann-Whitney U,

p

≤0.01 e teste F,

p

≤0.0003) e (B ) enriquecimento H3K27me3 no

TWIST1

sequência promotora em pacientes de alto sobrevivência, em comparação com pacientes com prognósticos pobres (*** Mann-Whitney U,

p

≤0.01 e teste t não emparelhado ,

p

≤0.02). enriquecimento (C) H3K27ac na sequência promotora de

MEOX2

(sem alterações significativas) e (D) enriquecimento H3K27ac na sequência promotora de

TWIST1

em pacientes de alto sobrevivência em comparação com pacientes com prognósticos pobres (sem alterações significativas). enriquecimento (E) H3K4me3 no

MEOX2

sequência promotora (* teste F,

p

≤0.02) e (F) a

TWIST1

sequência promotora em pacientes de alto sobrevivência em comparação