Abstract

Fundo

O câncer colorretal ( CCR) é a terceira maior causa de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo. 5-fluorouracilo (5-FU) é amplamente utilizado para o tratamento do cancro colorectal, mas como um agente único torna baixas taxas de resposta. Cinase de colina alfa (ChoKα), uma enzima que desempenha um papel na proliferação e transformação celular, tem sido relatada sobre-expressa em vários tumores, incluindo tumores colorrectais. inibidores ChoKα entraram recentemente ensaios clínicos como uma estratégia antitumoral romance.

Metodologia /Principais Achados

ChoKα inibidores específicos, MN58b e TCD-717, demonstraram uma atividade antitumoral potente ambos

In vitro

e

in vivo

contra vários xenoenxertos de linhas celulares derivadas de tumores, incluindo linhas de células CRC-derivados. O efeito de inibidores ChoKα em combinação com 5-FU como uma nova alternativa para o tratamento de tumores do cólon tem sido investigada tanto

in vitro

em CRC-tumor de linhas de células derivadas, e

In vivo

em modelos de xenoenxertos de ratinho. Os efeitos sobre a sintase do timidilato (TS) e os níveis de timidina-quinase (TK1), duas enzimas que se sabe desempenharem um papel essencial no mecanismo de acção do 5-FU, foram analisadas por transferência de Western e análise de PCR quantitativo. A combinação de 5-FU com inibidores ChoKα resultou em um efeito sinérgico

in vitro

em três linhas diferentes de células humanas de câncer de cólon, e

in vivo

contra xenoenxertos de cólon humano em ratinhos nus. inibidores ChoKα modular os níveis de TS e TK1 expressão através da inibição da produção de E2F, proporcionando um racional para seu mecanismo de ação.

Conclusão /Significado

Nossos dados sugerem que as duas drogas em combinação exibição de um efeito antitumoral sinérgico devido à ChoKα modulação da metabolização dos inibidores de 5-FU-dirigido. A relevância clínica destes resultados é fortemente apoiada desde TCD-717 recentemente entrou Fase I de ensaios clínicos contra tumores sólidos

Citation:. De la Cueva A, Ramírez de Molina A, Álvarez-Ayerza N, Ramos MA, Um Cebrián, Pulgar TGD, et ai. (2013) combinada com 5-FU e ChoKα Inibidores como uma nova terapia alternativa do cancro colorectal: Evidência em linhas celulares derivadas de tumor humano e de ratinho xenoenxertos. PLoS ONE 8 (6): e64961. doi: 10.1371 /journal.pone.0064961

editor: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., Estados Unidos da América

Recebido: 25 Março, 2011; Aceito: 22 de abril de 2013; Publicação: 10 de junho de 2013

Direitos de autor: © 2013 de la Cueva et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelas seguintes subsídios: Comunidad de Madrid (S-BIO /0280/2006 e S2010 /BMD-2326), Ministerio de Ciencia e Innovación (SAF2008-03750, SAF2011-29699, RD06-0020-0016 e RD12 /0036 /0019) e UE # 259737. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Juan Carlos Lacal é um dos fundadores do TCD Pharma e membro do seu conselho científico mas não um empregado da empresa. TCD Pharma está desenvolvendo o composto TCD717, um inibidor ChoKα, que está atualmente na fase I de ensaios clínicos. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O câncer colorretal (CRC) é o primeiro tipo de câncer mais prevalente e é a segunda causa de morte por câncer na Europa, com cerca de 212.000 mortes por ano [1]. A droga mais estudada em CRC é o antimetabolito 5-fluorouracilo (5-FU), desenvolvido há mais de 50 anos [2]. 5-FU é um análogo de uracilo com um átomo de flúor. O seu mecanismo de citotoxicidade consiste na incorporação errada de fluoronucleotides em RNA e DNA, mas os principais efeitos tóxicos são mediados pela inibição da enzima sintética de nucleótidos timidilato-sintase (TS). 5-FU é largamente utilizado no tratamento de uma variedade de cancros, incluindo CRC, mama e cabeça e pescoço cancros [3], [4]. As taxas de resposta para quimioterapia baseada em 5-FU como um tratamento de primeira linha para o câncer CRC avançada são apenas 10-15% [5]. A combinação de 5-FU com novas drogas citotóxicas, tais como oxaliplatina e irinotecano melhorou as taxas de resposta de 40-50% [6], [7]. Além disso, os novos agentes biológicos, tais como a anticorpos cetuximab e bevacizumab monoclonal demonstraram vantagens adicionais em pacientes com doença metastática [8], [9]. Assim, esta abordagem é a obtenção de melhorias importantes, e promove a novas estratégias terapêuticas com base em tratamentos combinatórias.

cinase de colina alfa (ChoKα), a primeira enzima na via de Kennedy, é responsável pela síntese do principal fosfolípido de a membranas do plasma, a fosfatidilcolina (PC). Vários estudos têm demonstrado que ChoKα desempenha um papel importante na transformação celular e induz a

in vivo

tumorig�ese [10], [11]. Além disso, ChoKα é sobre-expresso no cólon, mama, pulmão, próstata, ovário e tumores hematológicos [11] – [16]. Com base nestas observações, ChoKα tem sido utilizado como um alvo molecular nova para desenvolver uma nova estratégia anti-tumoral. inibidores ChoKα (ChoKIs) são derivados da estrutura Hemicolinium-3 (HC3), um inibidor de cinase de colina conhecida com uma elevada neurotoxicidade

in vivo

[17] – [19]. MN58b [20], [21] foi identificado como um derivado HC3 primeira geração com atividade antiproliferativa potente

in vitro

e eficiente atividade antitumoral

in vivo

em sistemas de ratos nus incluindo xenoenxertos de cólon [10] , [21]. MN58b foi usado como um modelo para uma nova geração de compostos, e uma molécula de ligação para estudar o mecanismo de acção desta nova classe de drogas anti-tumor.

Uma segunda geração de inibidores da ChoKα foi sintetizado para melhorar o tolerabilidade dos inibidores ChoKα em ratinhos. TCD-717 foi seleccionada entre várias moléculas, pois proporcionou os melhores resultados

in vitro

e

in vivo

(resultados não publicados). inibidores ChoKα drogas são altamente específicas para as células tumorais, uma vez que as células primárias são reversivelmente preso em G1 e são capazes de recuperar a sua cinética de crescimento, uma vez que a droga é removida. No entanto, as células tumorais são accionados a concomitante morte celular a um aumento dos níveis intracelulares de ceramidas [22], [23]. Ambas as drogas, MN58b e TCD-717, são derivados de Hemicolinium-3, e como tal, eles são ambos considerados inibidores competitivos com colina na bolsa de ligação de colina [24] – [26].

Tem sido descrita que o uso combinado de um siRNA de colina-cinase específica e 5-FU, resulta em um efeito sinergético na redução da proliferação celular de células de cancro da mama [27]. O objetivo do presente estudo foi investigar a eficácia antitumor da administração combinada de inibidores ChoKα químicos e 5-FU, em busca de um tratamento alternativo que permitiria melhorar a 5-FU resposta da frequência no tratamento CRC e reduzir a sua toxicidade associada. A relevância clínica deste novo tratamento é fortemente apoiada desde TCD-717 foi aprovado recentemente para entrar ensaios clínicos contra tumores sólidos (https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01215864).

Resultados

ChoKα níveis humana derivada linhas celulares de cancro colorectal

níveis ChoKα foram analisados ​​nas linhas celulares de cancro do cólon três utilizados neste estudo, DLD-1, HT29 e SW620 contra um CCD linha celular colorectal tumoral não -841. A Figura 1 mostra que os níveis ChoKα são cerca de 20-30 vezes maior do que a linha de células primárias. Este resultado está de acordo com a análise anterior da expressão ChoKα em amostras de tumor comparativamente com os tecidos normais correspondentes do mesmo paciente [11], e fornece um racional para o uso potencial de inibidores de ChoKα na clínica em combinação com quimioterapia padrão.

os níveis de proteína ChoKα de três linhas de células de tumor colorretal, respeito DLD-1, HT29 e SW620 foram comparados com os não tumoral linha celular colorectal CCD-841. Abaixo do ocidental é representado níveis de quantificação (ChoKα /tubulina).

ChoKα inibidores de sinergias com a promoção do 5-FU a morte celular das células cancerosas do cólon

O efeito sobre a proliferação de inibidores ChoKα em combinação com 5-FU foi determinada nas três linhas celulares de cancro colorrectal: DLD-1, HT29 e SW620. Para estimar as concentrações apropriadas para cada composto, as células foram tratadas com uma vasta gama de concentrações com base no seu respectivo IC

50, sozinho ou em combinação. As concentrações utilizadas foram de 1 a 6 | iM (MN58b e TCD717) e 2-8,5? M de 5-FU, tanto como tratamentos concomitantes e sequenciais (Fig S1). A melhor combinação para alcançar um efeito sinérgico eficaz como drogas antiproliferativas foi um tratamento sequencial iniciada por um inibidor ChoKα e seguido de 5-FU. O efeito inibidor foi quantificada pelo ensaio de MTT, e as taxas de inibição foram analisados ​​pelo método de Chou e Talalay e índices de combinação (IC) estimado de acordo com o programa CalcuSyn [28]. As parcelas foram obtidos quando os inibidores ChoKα TCD-717 e MN58b foram combinadas com 5-FU em DLD-1, linhas de células HT29 e SW620 (Figura S1). ICs e um valor representativo de cada linha de células de CRC diferente pela combinação sequencial de inibidores ChoKα e 5-FU são mostrados (Figura 2).

6 × 10

3 As células de tumor foram cultivadas em placas de 96 poços . Após 24 h de incubação, as células foram expostas a TCD-717 (painéis da esquerda) durante 24 h ou MN58b (painéis da direita) durante 9 h. Em seguida, o meio foi mudado para meio contendo 5-FU durante 60 h em placas previamente tratados com MN58b e durante 24 h em placas tratadas com o TCD-717. A viabilidade celular foi avaliada por um ensaio MTT e representada como percentagem do controlo, as células não tratadas. valor de IC em cada caso é a média de três experiências independentes, cada uma realizada em quadruplicado. CI 1 indica um efeito sinérgico. Uma experiência representativa de três experiências independentes é mostrado.

O efeito desta combinação foi investigada, e a distribuição do ciclo celular induzida por TCD-717 e 5-FU sozinho ou em combinação analisado (Figura 3). A citometria de fluxo análise mostrou uma indução significativa da morte de células após o tratamento com ChoKIs com um aumento adicional em combinação com 5-FU, indicando que o tratamento combinado tinha um efeito mais forte do que os tratamentos individuais. Estudos anteriores demonstraram que as células de tumor são sensíveis a inibidores da ChoKα se exposto em fase G1, mas tornam-se insensíveis em fase S [23]. 5-FU induziu a exposição a acumulação de fase S, mas o tratamento combinado reduziu drasticamente a acumulação da fase S e o aumento das taxas de morte celular. Estes resultados suportam a necessidade de um tratamento sequencial iniciado com inibidores ChoKα explicando a falta de sinergismo observado com esquemas alternativos de tratamento.

2,5 × 10

5 DLD-1 e SW620 linhas celulares foram semeadas em placas placas de 6 cavidades e incubadas durante 24 h com o TCD-717 seguido de 5-FU durante 24 h, isoladamente ou em combinação. A combinação das duas drogas aumento da morte celular em comparação com os dois fármacos sozinhos. Tabelas sob os gráficos indicam a percentagem das diferentes fases do ciclo celular quando tratamos com TCD-717 e 5-FU sozinho ou em combinação. * P . 0,05 comparado as diferentes fases do ciclo celular vs. controlo

In vivo

sinergismo de inibidores ChoKα e 5-FU em ratinhos nus

Os efeitos de tratamentos combinatórias de inibidores ChoKα e 5-FU no

in vivo

o crescimento do tumor de DLD-1 e xenoenxertos SW620 em ratinhos nus próxima investigado. DLD-1 xenoenxertos foram inoculados em ratinhos atímicos e quando os tumores atingiram o volume padrão de cerca de 0,2 centímetros

3, os ratos foram divididos aleatoriamente em quatro grupos (10 tumores /grupo) e tratados seguindo o seguinte esquema: inibidores ChoKα foram administrados em 2 mg /kg /dia, três vezes por semana durante 3 semanas, e 5-FU foi administrado a 40 mg /kg /dia, duas vezes por semana durante 3 semanas. O crescimento tumoral foi registada após o início do tratamento. os volumes de tumor foram reduzidos em todos os grupos tratados, independentemente do tratamento, em comparação com os de controle, os ratos não tratados (Figura 4). O crescimento do tumor dos grupos de combinação em cada experiência foi significativamente menor do que os tratados com inibidores ChoKα ou 5-FU sozinho (valores de p 0,05). indicando uma forte redução do volume do tumor nos modelos de combinação

Os ratinhos eram expostos a 2 mg /kg /dia de inibidores ChoKα três dias por semana e 40 mg /kg /dia de 5-FU dois dias por semana, em combinação ou sozinhos durante 3 semanas. taxa de inibição do crescimento do tumor é mostrado abaixo de cada experimento. (A) DLD-1 tumores tratados com MN58b como inibidor ChoKα e 5-FU. (B) DLD-1 que os tumores tratados com o TCD-717. (C) SW620 tumores expostos a TCD-717 e 5-FU.

Como uma validação, SW620 xenotransplantes também foram investigados após um cronograma idêntico com uma combinação de TCD-717 e 5-FU. Também foi observado um efeito estatisticamente significativo no tratamento de combinação (Figura 4).

ChoKα inibidores de modular os níveis de enzimas-chave envolvidas no metabolismo de 5-FU expressão

Para elucidar o mecanismo de este efeito sinérgico de inibidores ChoKα e 5-FU, examinámos o efeito de inibidores ChoKα sobre os níveis de expressão de enzimas chave na via metabólica da 5-FU, como a timidilato-sintase (TS) e a timidina-quinase (TK1). células SW620 foram tratadas com concentrações crescentes de inibidores ChoKα de 2 a 10 uM (Figura 5a) mostram uma diminuição dependente da dose nos níveis destas proteínas. Em seguida, SW620, HT29 e DLD-1 foram tratados com inibidores ChoKα (TCD-717 6 e 10 uM, MN58b 10 e 15 | iM) e 5-FU (5,5 uM), isoladamente ou em combinação sequencial para determinar os efeitos sobre a expressão níveis destas enzimas (Figura 5B). Livre (forma activa) e complexo ternário (forma inactiva) de TS e TK1 foram analisadas por western blotting. Como esperado, as células tratadas com 5-FU demonstrou tanto o complexo ternário TS (banda superior) e de TS livre (banda inferior). inibidores ChoKα induziu uma diminuição da regulação significativa de ambos os TS livres (forma activa) e complexo ternário (forma inactiva), bem como TK1 (Figura 5B). Assim, a combinação sequencial de inibidores ChoKα e 5-FU induzida ambos os mecanismos de inactivação, diminuição da formação de complexo ternário e uma regulação significativa de TS activo (forma livre). Além disso, a diminuição dos níveis ChoKIs TK1, que afecta também o mecanismo associado à resistência à 5-FU. Este efeito poderia explicar o mecanismo do sinergismo entre ambos os fármacos.

2,5 × 10

5 DLD-1, linhas de células HT29 e SW620 foram semeadas em placas de 6 cavidades e incubadas durante 24 h. (A) linha celular SW620 foi exposta a concentrações aumentadas de inibidores ChoKα durante 24 h. (B) SW620, HT29 e linhas celulares DLD-1 foram expostas a duas concentrações de inibidores ChoKα [TCD-717: 6 m (linha esquerda) ou 10 mM (linha direita); MN58b: 10 m (linha esquerda) ou 15 mM (linha direita)]. Onde indicado, o meio foi removido depois de tratamento com inibidores ChoKα como acima e mudado para meio fresco com 5,5 uM de 5-FU durante um adicional de 24 h. A expressão de proteínas foi analisada por Western blot utilizando anti-timidilato sintase TS106 clone monoclonal por TS e monoclonal anti-timidina cinase clone F12 para TK1. A figura mostra na parte superior um blot representativo, nos níveis de proteína inferior (TS totais, TS activas, e TK1 /tubulina) calculado pela média ± SEM de três experiências independentes. (C) 2,5 x 10

5 SW620, HT29 e linhas de células DLD-1 foram semeadas em placas de 6 cavidades e incubadas durante 24 h. (A) SW620, (B) HT29 e (C) DLD-1 As linhas celulares foram expostas a duas concentrações de inibidores ChoKα [TCD-717: 6 uM (linha esquerda) ou 10 uM (linha direita); MN58b: 10 m (linha esquerda) ou 15 mM (linha direita)]. Onde indicado, o meio foi removido depois de tratamento com inibidores ChoKα como acima e mudado para meio fresco com 5,5 uM de 5-FU durante um adicional de 24 h. A expressão de proteínas foi analisada por Western blot utilizando anti-E2F1. A figura mostra na parte superior um blot representativo, nos níveis de proteína de fundo (E2F1 /GAPDH) calculado pela média ± SEM de três experiências independentes.

Ambos TK1 e TS foram mostrados para estar sob controlo transcricional de E2F1 [29], [30]. Assim, investigou-se a redução drástica dos níveis de TK1 uma inibição de TS após ChoK foi mediada por um efeito sobre os níveis deste factor de transcrição. Como mostrado na Figura 5C, em todas as três linhas de células investigadas, uma redução drástica dos níveis de E2F1 foi observada consistente com o seu papel como regulador de TS e síntese TK1.

Em seguida, para investigar o potencial de indução de apoptose depois de ChoK inibition, como uma característica da apoptose, os níveis de PARP foram analisados ​​sob condições semelhantes, e uma drástica redução foi observada nos níveis de PARP em SW620 (Figura 6A), HT29 (Figura 6B) e células DLD-1 (Figura 6C) linhas após o tratamento com a combinação programação. A PARP é uma proteína implicada na reparação do ADN e a sua redução tem um significado fisiológico semelhante ao da sua clivagem porque os níveis reduzidos de PARP evitar a reparação e células de DNA são accionados para acoplamento apoptose.

(A-C) SW620, HT29 e células DLD-1 foram semeadas como descrito em materiais e Métodos e tratados com duas concentrações de inibidores ChoKα [TCD-717: 6 m (linha esquerda) ou 10 mM (linha direita); MN58b: 10 uM (linha esquerda) ou 15 uM (linha direita)] durante 24 horas e, sempre que indicado, com 5,5? M de 5-FU ou um veículo para um adicional de 24 h. A expressão de proteínas foi analisada por Western blot utilizando anticorpo policlonal anti-PARP. Atrás de cada gráfico, os dados mostram os níveis de proteína (PARP /GAPDH) calculado pela média ± SEM de três experiências independentes. (A) SW620. (B) HT29. (C) DLD-1. (D) e os níveis de expressão de PARP ChoKα em linhas de células HT29 e SW620 transfectadas com um ARNsi ChoKα específica, determinada por análise de transferência de Western ou um controlo de precipitação siRNA (SCR). A expressão de proteínas foi analisada por Western blot utilizando anticorpo monoclonal ChoKα e anticorpo policlonal anti-PARP. Abaixo de cada ocidental da PARP rácio /Tubulin é representado. 3 Actividade de (E) Caspase (painel superior) e a sua clivagem (o painel inferior) foram determinados em células HT29 após o tratamento com MN58b, durante 24 h. actividade enzimática 3 (F) também caspase foi medida após a transfecção de células HT29, com um siRNA específico ChoKα ou um ARNsi de controlo (SCR) durante 48 h. Western blot representa os níveis de ChoKα após a transfecção e a sua redução relativa normalizados para níveis de GAPDH.

HT29 e células SW620 foram também transfectadas com um ARNsi-específica ChoKα. Como mostrado na Figura 6D, foram obtidos resultados semelhantes aos de ChoKα inibição farmacológica, com uma redução drástica dos níveis de PARP, uma indicação da especificidade devido à inibição ChoKα

.

Como uma prova adicional da indução de apoptose depois inibidores Chok em células cancerígenas do cólon, foram utilizados dois métodos alternativos para o início da maquinaria de sinalização apoptótica. Caspase 3 e actividade de clivagem foi facilmente detectado após tratamento de células HT29 MN58b (Figura 6E). Regulação negativa da expressão ChoKα por siARN específica também aumentou a actividade da caspase, um apoio adicional da especificidade deste efeito, com base na redução da actividade ChoKα (Figura 6F). Assim, os inibidores de QCo são capazes de induzir apoptose por activação da caspase 3.

Finalmente, os níveis de TS foram analisados ​​em tumores gerados a partir do tratamento

In vivo Modelo de Xenoenxerto

DLD-1 depois com MN58b e 5-FU e em comparação com o controlo, os ratos não tratados (Figura 7). Observou-se uma redução estatisticamente significativa nos níveis de TS (tanto de proteína total e activa) em tumores tratados com MN58b sozinho ou em combinação com 5-FU, ao passo que não houve diferença significativa foi encontrada nos tumores dos ratinhos tratados apenas com 5-FU.

Os murganhos foram inoculados com as células DLD-1, tal como indicado em Materiais e Métodos e não tratadas à esquerda ou tratadas com MN58b ou 5-FU sozinho ou em combinação. A) TS níveis de expressão de cada grupo experimento: Control, MN58b, 5-FU e do grupo de combinação. Tubulina foi utilizada como controlo de carga. B) O gráfico representa a média dos níveis de proteína como os rácios TS /tubulina para cada grupo. barras pretas representam TS total de valores /tubulina; barras cinza representam valores ativos TS. (*) Estatisticamente significativa (p 0,05)., Em comparação ao grupo controle

Down-regulação dos níveis de mRNA de TS e gene TK1 após tratamento com inibidores ChoKα e 5-FU em DLD-1, SW620 e células HT29

pré-clínicos e estudos clínicos têm demonstrado que o TS expressão é determinante da sensibilidade 5-FU e evolução clínica [31], [32]. De acordo com estes resultados, a amplificação do gene de TS, com os consequentes aumentos de ARNm e proteína TS, tem sido observada em linhas de células que são resistentes a 5-FU [31], [33], [34].

com base nos resultados acima, SW620, HT29 e células DLD-1 foram tratados com MN58b e TCD-717 durante 24 h. O tratamento com inibidores ChoKα resultou numa regulação negativa significativa de ambos os níveis de mRNA e ST TK1 como determinado por ensaio de Q-PCR em tempo real utilizando sondas específicas para Hs00426591_m1 TS e Hs01062125_m1 para TK1 (Figura 8). Estes resultados indicam que a modulação para baixo nos níveis de proteína de TS e TK1 induzida por inibidores ChoKα resultados de uma redução drástica no nível transcricional, com um efeito significativo em ambos os TS, e a sua via de recuperação mediada por TK1. Uma vez que os níveis de E2F1 foram também drasticamente reduzido, é razoável propor que este factor de transcrição é responsável pelos efeitos observados em ts e inibição TK1 como descrito anteriormente [29], [30].

2,5 × 10

5 DLD-1, linhas de células HT29 e SW620 foram semeadas em placas de 6 poços e incubadas em condições óptimas durante 24 h. Em seguida, as células foram expostas a diferentes concentrações de inibidores ChoKα durante 24 h. Os níveis de TS e TK1 foram analisadas por RT-qPCR como descrito em Materiais e Métodos. 18S foi utilizado como controle endógeno para a normalização.

Os resultados acima seria consistente com um efeito geral sobre a transcrição de genes induzidos por inibidores ChoKα. Para testar esta possibilidade, os níveis de ARNm de outras proteínas também envolvidas no mecanismo de 5-FU de acção foram investigados. Ao contrário do que foi observado com TS ou TK1, uridina fosforilase (

UPP1

) foi aumentada após o tratamento com inibidores da ChoKα (Figura 9). Esta elevação pode ser fisiologicamente relevante porque

UPP1

é responsável pela transformação de 5-FU para um metabolito intermediário que vai ser convertido no trifosfato metabolitos activos fluorouridina (FUTP) e trifosfato de fluorodesoxiuridina (FdUTP). Assim, os efeitos observados na E2F1, TS e TK1 não respondem a um efeito geral, não específica na transcrição de genes.

2,5 × 10

5 DLD-1, HT29 e SW620 linhas celulares foram semeadas em placas de 6 cavidades e incubadas 24 h, sob condições padrão. Em seguida, as células foram tratadas com inibidores ChoKα, TCD-717 (6 e 10 uM) e MN58b (10 e 15? M) durante 24 h. 18S foi usado como um controle endógeno

Efeitos de inibidores ChoKα sobre MAPK, a sinalização AKT e ceramidas níveis

Tal como anteriormente descrito por nós e o grupo de Chesney [40] – [42]. inibição da ChoKα tem um efeito sobre a cinase de MAPK e AKT vias de sinalização com uma redução drástica nas formas fosforilada em vários tipos de células. De acordo com estes resultados, quando as células SW620 foram tratados com inibidores ChoKα, foi observada uma redução drástica tanto p42 /p44 (Figura 10A). No entanto, em contraste com os relatórios anteriores sobre outras linhas celulares, foi observado nenhum efeito significativo na fosforilação de pAKT-Ser

473 (Figura 10B). Além disso, não se observou qualquer efeito sobre a via de sinalização, quer por tratamento de células SW620 com 5-FU sozinho, e nenhuma modificação significativa dos efeitos observados, quando as células foram tratadas com inibidores ChoKα foi observado em condições de combinação.

(A ) 2,5 × 10

5 SW620 células foram semeadas em placas de 6 cavidades e incubadas durante 24 h e exposto a duas concentrações de inibidores ChoKα [TCD-717: 6 uM (linha esquerda) ou 10 uM (linha direita); MN58b: 10 m (linha esquerda) ou 15 mM (linha direita)]. Onde indicado, o meio foi removido depois de tratamento com inibidores ChoKα e mudado para meio fresco com 5,5 uM de 5-FU durante um adicional de 24 h. A expressão de proteínas foi analisada por Western blot utilizando anticorpos monoclonais anti-fosfo MAPK p44 /p42 e anti-p44 /p42 MAPK. A Figura mostra uma mancha representativos de duas experiências independentes. (B) As células SW620 foram cultivadas e tratadas tal como indicado em (A) com 15 uM e 5,5 uM MN58b 5-FU sozinho ou em combinação, durante 24 horas. A expressão de proteínas foi analisada por Western blot utilizando anti-pAKT- Ser

473, anti-AKT ou anti-GAPDH. A figura mostra na parte superior um blot representativo, nos níveis de proteína inferiores (pAKT-Ser

473 /AKT total de /GAPDH) de uma experiência representativa. (C) 2 × 10

6 SW620 células foram semeadas em placas P100 e incubadas 24 h, sob condições padrão. As células foram então tratadas com 15 pM e 5,5 uM MN58b 5-FU sozinho ou em combinação, durante 24 horas. Os níveis totais de ceramida foram analisados ​​por UPLC-TOF. A média ± DP de duas experiências independentes realizadas em triplicado são mostrados.

Finalmente, geração de ceramidas foi observada especificamente em células Jurkat após o tratamento com MN58b, enquanto nenhum aumento significativo foi observado em linfócitos primários humanos [22 ]. Isto pode ser responsável pela indução de apoptose neste sistema celular e poderia também explicar a sinergia observada neste estudo. No entanto, nenhum efeito sobre os níveis de ceramidas foram observadas após o tratamento com 5-FU sozinho nem depois horários combinatórias com MN58b e 5-FU (figura 10B), excluindo este mecanismo como o responsável pelo sinergismo observado quando o 5-FU foi combinado com inibidores de QCo.

Discussão

o cancro do cólon é uma das causas mais comuns de morte por cancro em todo o mundo. O tratamento padrão para o CRC é baseada em 5-FU como primeira linha geralmente em combinação com outras drogas citotóxicas, tais como oxaliplatina ou o inibidor da topoisomerase I CPT-11 (irinotecano) [33] – [35].

um melhor conhecimento da biologia molecular dos tumores CRC mudou gestão dos pacientes com CCR, com o estatuto de mutações K-Ras sendo uma questão de tomada de decisão crítica. Numerosos ensaios clínicos estão em andamento para melhorar os horários para pacientes com CCR, como para muitos outros tipos de câncer. No entanto, as baixas taxas de tratamentos curativos disponíveis ainda faz necessário explorar novas abordagens terapêuticas para alcançar melhores taxas de sobrevivência. Nesse sentido, uma pesquisa muito ativo para tratamentos novos baseados em quimioterapia combinatória e terapia-alvo tem gerado novas alternativas promissoras. Esta estratégia baseia-se em horários que aumentou as taxas de resposta de 10-15%, com 5-FU sozinho para 40-50% em combinação quimioterapia [6], [7].

A terapia direcionada é um tratamento com um mecanismo que age especificamente interferindo um alvo bem definido ou via biológica [36] focado. Atualmente, essas novas abordagens constituem uma promessa real para melhorar a gestão e os resultados dos pacientes com câncer, uma vez que especificamente age contra as células cancerosas e, portanto, deve ter menos efeitos colaterais do que outros tipos de tratamentos terapêuticos.

ChoKα é abundante em um grande variedade de tumores humanos incluindo cancro colorrectal [11] – [16]. Aumento dos níveis de metabolitos no total de colina, incluindo fosfocolina, o produto da actividade de ChoK, é também uma característica comum de muitos tipos de tumores [37]. Portanto, ChoKα é um novo alvo interessante para o desenvolvimento de terapias do cancro. Como consequência, os inibidores ChoKα foram sintetizados para interferir especificamente com a sua actividade [10], [18], [20], [21].

A combinação de siRNA-ChoK com 5-FU em cancro da mama células mostrou uma redução da viabilidade das células e proliferação [27]. No entanto, este tratamento baseia-se na utilização de um siRNA que não é transportado para o alvo células

in vivo

de uma maneira eficiente. Aqui, usamos dois inibidores químicos especificamente concebidos contra ChoKα (MN58b e TCD-717) com alta potência contra células tumorais

in vitro

e

in vivo

, para explorar o efeito da combinação de esta nova abordagem terapêutica alvo 5-FU e melhorar os tratamentos actuais de CRC. Um efeito antitumoral sinérgico forte quando os inibidores da 5-FU e ChoKα foram usadas em combinação contra várias linhas celulares de CRC é relatado.

relatórios anteriores de nosso grupo demonstram que a indução de apoptose pela inibição da ChoKα está relacionada com a geração específica de ceramidas nas células tumorais [22], [23]. foi observada uma diferença dramática na resposta a inibidores específicos ChoKα entre células normais e tumorais. Considerando que o bloqueio de

de novo

fosfocolina (PCHO) síntese através de MN58b em células primárias induz Retinoblastoma desfosforilação e resulta na paragem do ciclo celular reversível na fase G0 /G1 (Rb), células de tumor sofrer uma oscilação drástica no metabolismo de principal lípidos da membrana fosfatidilcolina e esfingomielina, o que resulta em um aumento significativo nos níveis intracelulares de ceramidas que promove a apoptose [22], [23]. Estas experiências iniciais foram reproduzidos em tipos celulares adicionais, incluindo linhas celulares derivadas de cancro do cólon (dados não mostrados). Evidência adicional tem sido relatado que indica uma inibição clara dos caminhos de sinalização de PI3K /AKT e ERK por inibidores de QCo [38], [39], [40]. No entanto, nos sistemas adega utilizados neste estudo, nem geração de MAPK nem AKT sinalização ou ceramidas são significativamente alterada por tratamento sozinho 5-FU. Nenhum efeito significativo é observado quer quando as células foram tratadas com os regimes combinatórias que mostraram uma sinergia potente tanto in vitro ou sob condições in vivo. Estes resultados em conjunto indicam que os efeitos anteriores relataram sobre os mecanismos de acção dos inibidores ChoKα quer em MAPK, AKT e ceramidas de sinalização não são responsáveis ​​pelo efeito sinergístico observado nas células de cancro do cólon quando combinando inibidores ChoKα e 5-FU.

Aqui temos investigado o mecanismo da sinergia dos inibidores de QCo e 5-FU para um melhor entendimento e a melhoria do seu potencial uso na clínica. TS proteína tem um papel fundamental na biossíntese de timidilato, um precursor essencial para a síntese do ADN [41]. Alguns estudos demonstraram que os níveis de proteínas TS são mais elevados em vários tecidos tumores, em comparação com as suas contrapartes normais [42]. Além disso, níveis elevados de TS estão associados com mau prognóstico nestes cancros [43] – [45].