Abstract

PHB é um oncogene e tumor supressor relatados no câncer gástrico. Aqui, nós avaliamos se o

PHB

número de cópias e o polimorfismo rs6917 afetam a sua expressão no câncer gástrico. Down-regulação e aumento da regulação do

foram observadas nos tumores avaliadas PHB

. expressão reduzida foi associada com desdiferenciação tumor e iniciação câncer. O alelo T do polimorfismo rs6917 foi associada com

PHB

reduzidos níveis de mRNA. Além disso, o aumento da regulação do

PHB

apareceu a ser regulada pelo ganho de cópias de genes adicionais. Assim,

PHB

copiar variação do número e expressão diferencial do polimorfismo rs6917 pode desempenhar um papel em

PHB

regulação transcricional

Citation:. Leal MF, Cirilo PDR, Mazzotti TKF , Calcagno DQ, Wisnieski F, Demachki S, et al. (2014) proibitina Expressão desregulamentação em câncer gástrico está associada a região não traduzida 3 ‘1630 C T Polimorfismo e Copy Number Variação. PLoS ONE 9 (5): e98583. doi: 10.1371 /journal.pone.0098583

editor: Amanda Ewart Toland, Ohio State University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 17 de fevereiro de 2014; Aceito: 05 de maio de 2014; Publicado em: 30 de maio de 2014

Direitos de autor: © 2014 Leal et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPESP), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq; RC, MACS e RRB) e Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP; MFL, PDRC e DQC ) como subsídios e bolsas de estudo. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. RC é um editor Acadêmico de PLOS ONE. Os demais autores declararam que não existem interesses conflitantes para eles. Isto não altera a adesão dos autores para PLOS ONE políticas e critérios editoriais.

Introdução

O câncer gástrico (CG) é o quarto câncer mais comum ea segunda principal causa de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo [1]. Apesar dos avanços significativos no estudo da GC, as alterações moleculares envolvidas na carcinogénese gástrica permanecem desconhecidos.

cromossoma 17 é um dos cromossomas mais comuns que exibem aberrações numéricas em GC (veja o comentário [2]). O nosso grupo já havia relatado a presença do cromossomo 17 aneuploidia, ambos os ganhos e perdas, no GC em indivíduos no Norte do Brasil [3], [4], [5], [6] e em todas as linhas de células GC estabelecidas a partir neoplasias neste população [7], [8]. Portanto, este cromossomo pode conter genes importantes envolvidos na carcinogênese gástrica.

O proibitina-1 (

PHB

) mapas gene do cromossoma 17q21 lócus. Este gene codifica uma proteína ubíqua, evolutivamente conservada que se encontra numa grande variedade de organismos, incluindo bactérias, plantas, leveduras, protozoários e mamíferos [9]. PHB foi originalmente pensada para desempenhar um papel central na inibição da progressão do ciclo celular. Mais recentemente, o PHB foi caracterizado como uma chaperona envolvidos na estabilização de proteínas mitocondriais; Assim, o PHB tem sido implicada em vários processos celulares, incluindo a regulação da proliferação, a apoptose e a transcrição de genes [10].

PHB parece desempenhar um papel no desenvolvimento de diferentes tipos de cancro. A sobre-expressão de PHB foi reportado no cancro do colo do útero, do esófago, da mama, do pulmão, da bexiga, da tiróide, da próstata e do ovário. Em contraste, a expressão reduzida de PHB foi observada em gliomas, e mutações somáticas no

PHB

ter sido detectada em cancros esporádicos da mama [9]. Além disso, um polimorfismo de um único nucleótido funcional (SNP) na

PHB

gene, a mudança de uma citosina a uma timina na posição 1630 na UTR 3 ‘(rs6917), cria uma variante que não possui actividade antiproliferativa [11] , [12] e, subsequentemente, pode aumentar o risco de crescimento maligno. O alelo T do presente SNP tem sido associada a um risco aumentado de cancro da mama [13] e melanoma [14]. Portanto, o papel de PHB na proliferação e /ou supressão de cancro continua a ser controversa.

O papel do PHB na carcinogênese gástrica ainda não foi completamente elucidado. Alguns estudos anteriores descreveram aumento da expressão PHB em amostras de GC [15], [16], [17], [18] e soro de pacientes GC [19]. No entanto, outros estudos têm relatado PHB down-regulação neste tipo de câncer [20], [21]. A investigação dos mecanismos moleculares envolvidos na regulação da transcrição da

PHB

pode fornecer novos insights sobre o seu papel no GC e auxiliar no desenvolvimento de novos tratamentos anticancerígenos.

Neste estudo, primeiro avaliado a expressão de ARNm e proteína de PHB no GC e as amostras de tecido gástrico não neoplásicas correspondentes. Além disso, as possíveis associações entre

PHB e características clínico-patológicos foram investigados. Porque o

gene PHB

está localizado em uma região cromossômica frequentemente envolvidos em aberrações numéricas em GC [2], também avaliamos o

PHB

número de cópias nas amostras tumorais. Além disso, a expressão alelo-específico de

PHB

mRNA foi avaliada para investigar a transcrição relativa de cada alelo em indivíduos heterozigotos com o polimorfismo rs6917 como um possível mecanismo envolvido na

regulação PHB

. Para nosso conhecimento, nenhum estudo anterior avaliou

PHB

número de cópias e expressão alelo-específico em amostras de tumor.

Materiais e Métodos

Amostras de Tecido

quarenta e oito pares de amostras de GC e as correspondentes amostras de tecido gástrico não neoplásicas ( 5 cm do bordo do tumor) foram usadas para avaliar

PHB

expressão de ARNm e o genótipo SNP rs6917. Em 38 destas amostras GC, o

PHB

copiar número também foi avaliada. PHB imunorreatividade foi avaliada em 12 amostras de GC.

Todas as amostras gástricas foram obtidos de pacientes que foram submetidos a gastrectomia para GC em João de Barros Barreto Hospital Universitário (HUJBB) no Norte do Brasil. Todos os pacientes tinham histórias negativos da exposição a quimioterapia ou a radioterapia, antes da cirurgia, e não houve co-ocorrência de outros cancros diagnosticados. consentimento informado por escrito com a aprovação do comitê de ética da HUJBB foi obtido.

Parte de cada amostra de tumor dissecados foi fixado em formalina e embebidos em parafina (FFPE). As secções de tecido FFPE foram coradas com HE para avaliação histológica ou usado para a análise imuno-histoquímica (IHQ). Porções adicionais de cada tumor e emparelhado espécime de tecido não-neoplásicas foram congeladas rapidamente em azoto líquido e armazenado a -80 ° C até à purificação de ácido nucleico.

Todas as amostras foram classificadas de acordo com Lauren [22], e os tumores foram classificados de acordo com os critérios de estadiamento TNM [23].

DNA e mRNA purificação

o DNA total e mRNA foram simultaneamente isolados de amostras de tecido gástrico utilizando uma /RNA Kit DNA AllPrep /Protein (Qiagen, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. As concentrações e a qualidade de ADN e de ARN foram determinadas utilizando um espectrofotómetro NanoDrop (Kisker, Alemanha), e a integridade do ARN foi determinada por electroforese em gel.

Gene Expression PHB

PHB

expressão foi avaliado pela reacção de transcrição reversa em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR-RT). Em primeiro lugar, o DNA complementar (cDNA) foi sintetizado utilizando um kit High-Capacity cDNA Archive (Applied Biosystems, Polónia) de acordo com o protocolo do fabricante. Análise em tempo real de RT-qPCR foi realizado utilizando SYBR Green QuantiFast Mistura de PCR (Qiagen, Alemanha) numa máquina de PCR 7500 rápido em tempo real (Applied Biosystems, EUA). Os seguintes iniciadores (150 nM cada) foram concebidos para amplificação RT-qPCR:

PHB

F5′-GTGTGGTTGGGGAATTCATGTGG-3 ‘e R5′-CAGGCCAAACTTGCCAATGGAC-3’;

ACTB

F5′-AGAAAATCTGGCACCACA-3 ‘e R5′-AGAGGCGTACAGGGATAG-3’. Todas as reacções foram realizadas em triplicado, tanto para o gene alvo e o controlo interno (

ACTB

).

PHB

expressão foi normalizada para expressão

ACTB

. A abundância de expressão de mRNA foi ajustado pela eficiência de amplificação (

PHB

= 99%,

ACTB

= 102%) [24]. Uma amostra de tecido gástrico não neoplásico foi designado como um calibrador para cada tumor emparelhado para calcular a quantificação relativa (RQ) [24].

Expressão de Proteínas de PHB

As secções de parafina foram submetidos a IHQ . secções de tecido de tumor (3 ou 4 mm de espessura) foram desparafinados em xileno e re-hidratadas numa série de etanol graduada. Epitopo recuperação foi realizada em tampão de citrato, pH 6,0, em calor húmido em uma panela de pressão. Em seguida, as secções de tecido foram incubadas com um anticorpo primário monoclonal de ratinho contra o PHB (II-14-10, diluição 1:100; ThermoFisher Scientific, EUA). Locais de imunorreactividade foram visualizadas utilizando um kit de detecção SuperPicture Polímero (Invitrogen, EUA). As lâminas foram visualizadas por microscopia de luz usando um microscópio Nikon Eclipse E600 (Nikon, EUA) equipado com uma câmara digital Nikon DSM1200F (Nikon, EUA). A região não corada (região branco) foi seleccionado e definido como o fundo. Qualquer coloração foi considerada como sendo um resultado positivo, independentemente da intensidade. Os controlos negativos, em que o anticorpo primário foi substituído por 5% de albumina de soro bovino (BSA) em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS), foram incluídos em todas as séries, e as secções de tecido de próstata humana normal foram utilizados como controlos positivos.

PHB

Copiar número

para avaliar as variações no número de cópias (CNV), o procedimento qPCR foi realizada utilizando ensaios quantitativos TaqMan CNV (Life Technologies, EUA) para o

PHB

gene (Hs00178432_cn) e para o controle interno

RNAse P

(# 4403326). reações de qPCR multiplex foram realizadas em quadruplicado com gDNA acordo com as condições do protocolo e ciclismo do fabricante em um fast máquina de Real-Time PCR 7500 (Life Technologies, EUA). O número de cópias relativa de cada amostra foi estimado usando Copiar chamador software V1.0 (Life Technologies, EUA). gDNAs comerciais humanos (G1471 e G1521; Promega, EUA) foram utilizados para a calibração

PHB

Genotipagem

DNA a partir de amostras não neoplásicas foi usado para

PHB.

genotipagem. Os indivíduos foram genotipados para o polimorfismo rs6917 utilizando sondas e iniciadores TaqMan personalizado SNP (Applied Biosystems, Foster City, CA). Os seguintes iniciadores e sondas MGB foram concebidos para discriminação alélica: iniciadores F5′-TTGGTCCCTCTCAGATACCCA-3 ‘e R5′-CCGTGAGAAGGGCAGTCTCT-3′; sonda marcada com FAM 5’-CTGCCAAAGACGTGT-3 ‘; e sonda 5’-CTGCCAAAGATGTGT-3 ‘menor alelo VIC-rotulados.

PHB

Alelo-específico expressão Expression

O alelo-específico

foi determinada pela primeira vez por sequenciamento. Vinte a 40 ng de ADN ou de ADNc foi utilizado como molde para amplificação por PCR com os iniciadores utilizados para

PHB

genotipagem. Antes de sequenciação, os produtos de PCR foram separados utilizando electroforese em gel de 2% de agarose e a banda específica foi extraída e purificada. A sequenciação foi realizada utilizando o iniciador directo utilizado para amplificação por PCR e um kit BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystems, EUA). produtos de sequenciação foram separadas usando um ABI 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, EUA). Algumas das amostras foram analisadas pelo menos duas vezes, incluindo distintas RT-PCR e ensaios de sequenciação.

O alélica níveis de expressão foram determinados utilizando o software PeakPicker [25]. O software foi utilizado para executar uma primeira etapa de normalização, em que a altura alelo SNP foi comparada com a altura dos picos de referência em sequências f lanqueadoras. Nós limitado este passo de normalização para dentro de uma janela de 21 base. os valores da Taxa 1 acima foram transformados a 1 /(proporção) para transformar todos os valores para uma escala de 0-1, e os valores foram então ajustado para a média das razões de intensidade do pico a partir de uma amostra de ADN de referência heterozigótico para o polimorfismo rs6917. O ADN genómico de heterozigoto (N = 3) e amostras homozigóticas (N = 3, por genótipo CC; N = 2, para o genótipo TT) foi utilizado para validar a análise e para confirmar os rácios de 50:50 e alélicas 0:100, respectivamente. Além disso, o ADNc a partir de amostras de tecidos (tumorais e não tumorais) a partir de amostras dos dois indivíduos homozigóticos para o alelo menor no polimorfismo rs6917 também foram utilizados como controlos.

específica de alelo

PHB

expressão também foi avaliada em amostras heterozigóticas por RT-qPCR, como previamente descrito [26]. Usando um ensaio de genotipagem personalizado TaqMan SNP para

PHB

genotipagem, geramos uma curva de regressão linear para a intensidade de fluorescência log10

vs

a relação log10 alélicas baseado na diluição em série de CC- e TT- DNAs genómicos genotipados de amostras de controlo (amostras de dois homozigotos) em várias proporções (CC: TT 8:01, 4:01, 2:01, 1:01, 1:02, 1:04, 1:08) por RT -qPCR (Figura 1A). A proporção alélica da expressão do gene foi extrapolada pela intercepção do log10 de FAM: intensidade VIC na curva padrão. ROX (corante interna de referência) e FAM não específica e VIC fluorescência foi normalizada em todas as análises. Todas as reacções foram realizadas em duplicata.

A) O registo

10 de FAM relação de intensidade /VIC para

PHB

em função do log

10 de FAM /alelo VIC proporção de mistura de DNAs homozigotos em diferentes proporções (08:01, 04:01, 02:01, 01:01, 01:02, 01:04, 01:08 FAM /VIC alelo). B)

PHB

expressão pelo genótipo rs6917 em amostras gástricas. C) C /T em relação alélica de ADNc a partir de amostras gástricas de pacientes heterozigóticas através de sequenciação; D) FAM /rácio alélica VIC em amostras gástricas de pacientes heterozigóticas utilizando um ensaio TaqMan Personalizado A genotipagem, em que uma sonda específica para o alelo C foi marcado com corante FAM e uma sonda de alelo T menor foi marcada com VIC corante. * Diferencialmente expressos entre os grupos pelo teste t para amostras independentes,

P

. 0,05

Para as amostras de cDNA heterozigotos, rácios alélicas 0,8 ou 1,2 foram considerada como um indicativo de expressão alelo-específico.

análise estatística

para a análise de expressão de mRNA, primeiro avaliou a hipótese de que os dados apresentaram distribuição normal pelo teste de normalidade de Shapiro-Wilk para determinar a apropriada testes para comparações estatísticas subsequentes. O

PHB

níveis de mRNA não foram distribuídos normalmente e foram transformados (z-score) para análise. Observações 2 ou -2 foram considerados valores discrepantes e excluídos das análises. Um teste t pareado foi realizado para comparar a média

expressão PHB

entre as amostras não neoplásicas e tumores. O teste t para amostras independentes e ANOVA one-way, seguido pelo teste post-hoc Games-Howell foram utilizados para avaliar as possíveis associações entre

PHB

expressão e características clínico-patológicas, imunorreatividade da proteína, o número de cópias do gene e do genótipo . O teste do qui-quadrado ou teste exato de Fisher foi usado para avaliar a relação entre o

PHB

número de cópias e imuno e fatores clínico-patológicos. A correlação de Pearson foi utilizado para avaliar uma possível correlação entre sequenciamento e o ensaio TaqMan para análise de expressão alelo-específico. Em todas as análises,

P

. 0,05 foi considerado significativo

Resultados

PHB

expressão de mRNA em gástrica Tumores

PHB

expressão não diferiu entre as amostras gástricas não neoplásicas neoplásicas e combinados (0,173 ± 0,255

vs

0,227 ± 0,297,

P

= 0,149). No entanto, os níveis de mRNA foram reduzidos, pelo menos, 1,5 vezes em 20 (45,5%) das amostras de GC e cresceu em 9 (20,5%), quando comparados com amostras de tecido gástrico não neoplásicas emparelhados.

A Tabela 1 mostra as associações entre

PHB

expressão e as características clinicopatológicas, bem como o número imunorreactividade da proteína, genótipo e rs6917 de cópias do gene. tumores pouco diferenciados apresentaram redução

PHB

expressão quando comparados aos tumores moderadamente diferenciados (

P

= 0,029; Tabela 1). No entanto, ambos GC pouco diferenciado (0,025 ± 0,022

vs

0,239 ± 0,303;

P Art 0,001, ANOVA seguida pelo teste post-hoc Games-Howell) e moderadamente diferenciado GC (0,057 ± 0,051

vs

0,239 ± 0,303;

P Art 0,001, ANOVA seguido pelos Jogos-Howell teste post-hoc) apresentaram redução

PHB

expressão comparação com não- amostras de tecido gástrico neoplásicas

Redução

PHB

expressão foi associada com menor invasão (

P

= 0,002; Tabela 1). e uma ausência de metástase ganglionar (

P

= 0,040; Tabela 1). Além disso, a GC início apresentaram redução

PHB

expressão comparação com GC avançada (

P

= 0,002; Tabela 1). Além disso, apenas no início GC apresentou uma redução significativa no

PHB

níveis de mRNA em comparação com as amostras não neoplásicas (0,044 ± 0,027

vs

0,239 ± 0,303,

P Art 0,001, ANOVA seguido do teste post-hoc de Games-Howell).

foi observada imunorreactividade em PHB gástrico tumores

imunomarcação de proteína em todas as amostras de tumor avaliada por IHC (Tabela 2). Em todos os casos, a imunorreactividade de PHB foi detectada em células neoplásicas e não-neoplásicas, incluindo metaplásico intestinal e células inflamatórias (Figura 2A-H). PHB foi expresso principalmente no citoplasma. A intensidade da coloração e a percentagem de células imunorreactivas variaram entre os casos estudados (Tabela 2). Amostras apresentando 80% das células tumorais com imunorreatividade PHB mostraram redução da expressão de mRNA (

P

= 0,036, Tabela 1)

A) coloração PHB na mucosa gástrica normal (400x).; B) imunorreactividade de PHB na mucosa gástrica normal e células inflamatórias (400x); C) A coloração por PHB forte em células metaplásicas intestinais (400x); D) PHB coloração forte em um tumor do tipo intestinal; E) moderada a imunorreatividade PHB intensa em um tumor pouco diferenciado; F) moderada a intensa imunorreactividade de PHB em um tumor moderadamente diferenciado; G) PHB coloração fraca em um tumor moderadamente diferenciado (400x); D) coloração PHB fraco em um tumor do tipo difuso (400x).

PHB

Copiar Número no gástrico Tumores

PHB

foi amplificado em 13 de 38 (34,2%) tumores, incluindo 2 amostras com 4 cópias. Nenhum tumor apresentou um

PHB

eliminação. Curiosamente, 3 amostras que apresentaram valores discrepantes em

PHB

expressão de mRNA também apresentou amplificação do gene. Portanto, quando os valores discrepantes foram incluídos na análise,

PHB

expressão foi maior em amostras com amplificação do gene do que naqueles sem amplificação do gene (mediana ± intervalo interquartil: 0,344 ± 0,335

vs

0,047 ± 0,07;

P

= 0,003, teste não paramétrico de Mann-Whitney; Figura 3).

ganho de PHB

foi associada com GC de início tardio em comparação com o GC de início precoce (

P

= 0,022; Tabela 2). Não houve associação entre

PHB

número de cópias e proteína imuno ou quaisquer outras características clinicopatológicas foi encontrado (Tabela 3).

As linhas mostram a mediana e intervalo interquartil de

PHB

expressão. * Diferencialmente expressos entre os grupos pelo teste de Mann-Whitney,

P

. 0,05

PHB

Expressão alelo específico-

investigou-se também se a presença do alelo menor em rs6917 foi associada com a desregulação de expressão de genes em pacientes GC. Em nossa amostra, 11 de 48 pacientes (22,9%) eram heterozigotos e 2 pacientes (4,17%) eram homozigotos para o alelo menor no polimorfismo rs6917. Todas as amostras com o alelo T apresentou 2 cópias do gene da

PHB

. A presença do alelo T na polimorfismo rs6917 foi associada com reduzida

expressão PHB

em GC (

P

0,001; Tabela 1; A Figura 1B) e em amostras não neoplásicas (média ± SD:. 0,302 ± 0,325

vs

0,045 ± 0,043;

P Art 0,001; Figura 1B)

Um par de amostras de heterozigotos (tumor e não-tumor) não foi utilizado para a análise de expressão específica para um alelo. Detectou-se uma correlação entre a proporção de alelos do polimorfismo rs6917 determinada por sequenciação e o ensaio TaqMan (

P

= 0,003; r = 0,627). Por sequenciação, aproximadamente 50% dos casos apresentaram expressão diferencial alélica (Figura 1C). No entanto, o ensaio TaqMan mostraram que os alelos T e C apresentaram expressão diferencial alélica na maioria dos pacientes (Figura 1D). O grau de diferença na expressão entre os dois alelos variaram entre os indivíduos. O rácio de expressão alélica T para C foi semelhante na maior parte dos pares de amostras tumorais e não tumorais. Apenas um paciente apresentou uma maior proporção C /T em ambos os tumores e amostras não neoplásicas em ambos os ensaios. Na maioria dos casos, uma relação C /T baixa foi detectada independentemente do método aplicado (Figuras 1C e 1D). Não foi detectada associação entre a expressão alélica diferencial e idade de início ou qualquer outra variável clínico-patológico.

Discussão

PHB parece ser essencial na homeostase celular. Estudos recentes têm sugerido que o PHB pode actuar como um factor pró-tumorigénico e anti-tumorigénico em vários tipos de células (ver revisão [10]). No presente estudo, as proteínas e mRNA perfis de PHB expressão apresentou um padrão heterogêneo entre amostras tumorais. Embora nós não encontramos uma diferença significativa entre GC e combinados amostras não neoplásicas, observamos que o nível de mRNA foi reduzida de 1,5 vezes em 45,5% das amostras de GC e aumentou em 20,5% dos tumores. A expressão de mRNA reduzida foi, em parte devido a uma frequência reduzida de células tumorais que apresentam imunorreatividade PHB, que destaca a heterogeneidade entre os clones de células tumorais.

Liu et al. [21] descreveram a expressão de ARNm reduzida em quatro tumores gástricos em comparação com os tecidos normais correspondentes, os quais, em parte, corroborando os resultados. Apoiando um papel anti-tumorigénica, PHB blocos de entrada na fase S [27]. Além disso, o tipo selvagem rs6917

PHB

3’UTR sozinho é capaz de inibir a progressão do ciclo celular [11], [28] e o crescimento de tumores [12], bem como reduzir a mobilidade de células [29]. Além disso, o PHB desempenha um papel na manutenção da função mitocondrial e morfologia normais [30]. Tem sido sugerido que a perda de expressão de PHB mitocondrial (localização citoplasmática, como observado nas amostras) poderia levar à proteólise acelerada das proteínas da membrana e da função da cadeia respiratória mitocondrial [10] prejudicar. Nosso estudo proteômica anterior mostrou que diversas proteínas envolvidas nas vias do metabolismo energético (disfunção mitocondrial, metabolismo do piruvato, fosforilação oxidativa, círculo citrato, glicólise /gluconeogénese) foram desregulados [31] e sugeriu que as funções mitocondriais proeminentes pode ser alterada, deslocando a produção de energia no GC células e sugerindo o efeito Warburg [32].

Para o nosso conhecimento, poucos estudos avaliaram a possível associação entre

PHB

níveis de mRNA e o polimorfismo rs6917. Num estudo, Tang et al. não foi observada uma associação significativa entre o polimorfismo rs6917 e a expressão de ARNm em linhas de células linfoblastóides incluídos no banco de dados HapMap [33]. No entanto, estes autores relataram que o alelo T estava associada com um risco aumentado de cancro da mama. No presente estudo, foi demonstrado que a presença do alelo T na polimorfismo rs6917 foi associada com reduzida

PHB

expressão em células gástricas não-neoplásicas e neoplásicas. O rs6917 polimorfismo localiza-se na 3 ‘UTR e está presente apenas em uma isoforma de PHB, que foi detectada no presente estudo de sequenciação de ADNc e um ensaio TaqMan. A 3’UTR contém múltiplos

cis viajantes – e

-elements trans, e estas estruturas têm uma ampla influência na tradução do mRNA, estabilidade e localização subcelular [34], [35], [36 ]. A variante T cria um potencial local de ligação para os microRNAs tem-miR-1292 e tem-886-5p (https://snpinfo.niehs.nih.gov/cgi-bin/snpinfo/mirna.cgi?2_rs6917), o que pode alterar a expressão genética por qualquer mRNA decadência ou tradução. Outros microRNAs foram previamente associados com a regulação da

expressão PHB

no GC. Liu et al. [21] relataram que

PHB

é regulada por miR-27a, que é comumente-regulada em GC. Os autores sugeriram que a sub-regulação de

PHB

por este microARN pode explicar porque a supressão de miR-27a pode inibir o crescimento de células de GC. Além disso, o 3 ‘UTR de

PHB

codifica um ARN anti-sentido (Gene ENSG00000250186; Havana https://www.sanger.ac.uk/). A presença do alelo raro no ARN anti-sentido pode modificar a estrutura secundária e diminuir o kcal /mol, quando comparado com a sequência de tipo largo utilizando CLC RNA Workbench software 4.0 (dados não apresentados). Portanto, o polimorfismo rs6917 pode levar a

PHB

infra-regulação através da criação de novos locais de destino microRNA ou através da sua regulamentação pelo RNA antisense nas células gástricas, contribuindo assim para a carcinogênese gástrica.

Em nossa amostras, a maioria dos pacientes heterozigóticos apresentaram um aumento na expressão do alelo T em relação ao alelo C. A diferença nos níveis de ARNm relativos dos dois alelos pode ser o resultado de diferenças na transcrição ou a estabilidade do ARNm, e que mostram que este polimorfismo apresenta um

cis

efeito em células gástricas. Para o nosso conhecimento, este é o primeiro estudo a avaliar o PHB diferencial

expressão alelo-específico em amostras de tumor. Estudos anteriores demonstraram que a

PHB

variante com o alelo T na posição 1630 na 3’UTR carece de capacidade de supressão de crescimento anti-proliferativas e de tumor in vitro e em modelos animais [29]. Portanto, a presença do alelo T, particularmente quando se apresenta elevada expressão em relação ao alelo C, pode induzir um efeito “esponja” para os reguladores pós-transcricionais tais como miARNs e contribuir para a proliferação celular gástrico, o que predispõe indivíduos heterozigóticos para GC.

o possível efeito da

PHB

infra-regulação – devido ao polimorfismo rs6917, por exemplo – no risco GC está de acordo com as associações entre reduzida

PHB

mRNA e menor invasão, falta de metástases em linfonodos e GC em estágio inicial. Para nosso conhecimento, nenhum estudo anterior na literatura avaliou a possível associação entre o

PHB

expressão e GC fatores prognósticos. Estes achados sugerem que

PHB

infra-regulação pode ser necessária para a iniciação do tumor.

No entanto, estudos de proteômica anteriores relataram upregulation PHB em tumores gástricos [15], [16], [17] . Além disso, Kang et ai. [18] relataram a superexpressão da proteína PHB e mRNA em GC (em comparação com os tecidos gástricos normais adjacentes) em indivíduos asiáticos. Em nossa amostra, 20,5% dos tumores também apresentaram aumento

PHB

expressão. PHB parece desempenhar um papel na proliferação celular, migração e adesão e, portanto, na progressão da transformação maligna através do RAS-RAF sinalização [37]. Nossa hipótese é que um aumento da

PHB

nível de mRNA é necessário para a progressão GC. A avaliação das amostras humanas só permite a investigação de um único ponto de tempo (no momento da reparação cirúrgica); Assim, somos incapazes de avaliar a regulação dinâmica da expressão do gene. No entanto,

PHB

expressão está provavelmente relacionado com o contexto celular e fundo molecular das células gástricas.

Kang et al. [18] relataram que a proteína PHB e expressão de mRNA diferiu entre GC moderadamente e pouco diferenciados e que tumores apenas pouco diferenciados presente superexpressão PHB comparadas com amostras não-neoplásicas. Em nossa amostra, alguns tumores foram classificados de acordo com o grau de diferenciação. No entanto, observou-se que ambos os tumores pouco e moderadamente diferenciados apresentaram redução

PHB

expressão em comparação com as amostras não neoplásicas e que os

PHB

níveis de mRNA foram menores nos tumores pouco diferenciados. Portanto, em nossas amostras,

PHB

expressão pareceu diminuir com desdiferenciação tumor. Outras investigações são necessárias para uma melhor compreensão do papel de PHB no processo de diferenciação em células gástricas normais e neoplásicas.

Neste estudo, observou-se que 34,2% dos tumores cópias de

PHB

adquirida. Alterações no cromossoma 17 ter sido associado com a progressão do tumor e o potencial maligno primário em GC [38], [39]. Para o nosso conhecimento, este é o primeiro estudo a usar uma técnica precisa e robusta na avaliação do

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número de cópias em amostras de GC. Observou-se uma associação entre o

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número de cópias e os níveis de mRNA, revelando um efeito cis-dosagem de CNV nos níveis de expressão de genes. Portanto, nossos resultados sugerem que a CNV é um elemento importante na condução jusante

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transcrição em alguns tumores gástricos. Este mecanismo genético, observado principalmente em GC de início tardio, podem contribuir para o

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papel como oncogene. Este achado também destacam que vários mecanismos podem levar a

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desregulamentação em células GC.

O aumento da

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copiar o número foi associado com GC de início tardio. clínicopatológicos diferenças entre início precoce e tardia GC têm sido descritos [40], [41], [42], mas pouco se sabe sobre as alterações genéticas relacionadas com a idade de início de GC [2]. Buffart et ai. [43] anteriormente demonstrado que os pacientes jovens e idosos pertencem a grupos com diferentes perfis genômicos. A amplificação do

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lócus destaca a heterogeneidade da GC.

A principal limitação deste estudo é o seu tamanho relativamente pequeno da amostra. Portanto, uma análise estatística apresentaram redução de energia para detectar diferenças significativas entre os grupos, provavelmente devido à grande heterogeneidade entre as amostras. Portanto, os resultados falso-negativos podem ter ocorrido. Outras avaliações ainda são necessários para avaliar o papel da

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na carcinogênese gástrica e sua regulação da transcrição.

Em conclusão, tanto a infra-regulação e aumento da regulação do

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pode ser observado no GC. A redução de

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expressão parece estar envolvido no processo de iniciação do tumor e desdiferenciação cancro. O alelo T no

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polimorfismo rs6917 pode contribuir para a redução observada no

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níveis de mRNA e, portanto, contribuir para o risco GC. No entanto,

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-regulação parece ser regulada pelo número de cópias do gene. A expressão diferencial do polimorfismo rs6917 em amostras gástricas foi relatado pela primeira vez, e essa variação pode desempenhar um papel na regulação de

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expressão.