Abstract

A identificação e validação de biomarcadores para aplicações clínicas continua a ser uma questão importante para melhorar o diagnóstico e terapia muitas doenças, incluindo câncer de próstata. perfis de expressão gênica são rotineiramente aplicadas para identificar biomarcadores de diagnóstico e previsão ou novos alvos para o câncer. No entanto, apenas alguns marcadores preditivos identificados

in silico

também foram validados para relevância clínica, funcional ou mecanicista na progressão da doença. Neste estudo, nós usamos uma abordagem ampla, baseada em bioinformática para identificar tais biomarcadores através de um espectro de estágios de progressão, incluindo lesões normais e tumorais adjacentes, pré-malignas, primárias e fase tardia. mineração Bioinformatics dados juntamente com a validação clínica dos biomarcadores pela sensível, quantitativa de transcrição reversa-PCR (qRT-PCR), seguindo-se a avaliação funcional dos genes candidatos em processos de doença relevantes, tais como a proliferação de células de cancro, motilidade e invasão. A partir de 300 candidatos iniciais, foram selecionadas oito genes para validação por várias camadas de mineração de dados e filtragem. Para a validação clínica, a expressão de ARNm diferencial de genes seleccionados foi medida por qRT-PCR em 197 amostras de tecidos da próstata incluindo clínico normal da próstata, comparado com histologicamente benigna e tecidos cancerosos. Com base nos resultados de qRT-PCR, a expressão de ARNm significativamente diferente foi confirmada em próstata normal versus amostras de CaP malignos (para todos os oito genes), mas também em tecidos de cancro adjacentes, mesmo na ausência de células de cancro detectáveis, indicando assim a possibilidade de efeitos pronunciados de campo em lesões da próstata. Para a validação das propriedades funcionais destes genes, e para demonstrar a sua relevância putativo para processos de doença relevantes, siRNA knock-down estudos foram realizados em ambos os modelos de cultura de células organotípicas 2D e 3D. Silenciamento dos três genes (

Dlx1

,

PLA2G7

e

RHOU)

no cancro da próstata linhas celulares PC3 e VCaP por siRNA resultou na prisão crescimento acentuado e citotoxicidade, particularmente em condições de cultura de células organotípicas 3D. Além disso, o silenciamento de

PLA2G7

,

RHOU

,

ACSM1

,

LAMB1

e

CACNA1D

também resultou em célula tumoral reduzida invasão no PC3 organ�de culturas. Para

PLA2G7

e

RHOU

, os efeitos do siRNA silenciamento sobre a proliferação e célula-motilidade também poderia ser confirmada em culturas em monocamada 2D. Em conclusão, Dlx1 e RHOU mostrou maior potencial como biomarcadores clínicos úteis para o diagnóstico APC, ainda validados por seus papéis funcionais na progressão CaP. Estes candidatos podem ser úteis para a identificação mais confiável de recaídas ou falhas terapêuticas antes das metástases locais ou distantes de recorrência

Citation:. Alinezhad S, Väänänen RM, Mattsson J, Li Y, Tallgren T, Tong Ochoa N, et ai. (2016) Validação de novos biomarcadores para o cancro da próstata Progressão pela combinação de Bioinformática, clínicos e estudos funcionais. PLoS ONE 11 (5): e0155901. doi: 10.1371 /journal.pone.0155901

Edição: Natasha Kyprianou, da Universidade de Kentucky College of Medicine, United States |

Recebido: 14 Outubro, 2015; Aceito: 05 de maio de 2016; Publicado: 19 de maio de 2016

Direitos de autor: © 2016 Alinezhad et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela Marie Curie (FP-7) Prostate Research Organizations-Rede de Formação Early Stage (PRO-NEST, projecto de referência 238278) e a Academia da Finlândia (Tumor Microenvironment metástase no câncer de próstata resistente à castração, números de projecto 267326 para Matthias Nees e 267326 para Malin Åkerfelt). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O câncer de próstata (PCA) continua sendo um grande problema de saúde pública em todos os países ocidentais. CaP representa a entidade tumor mais comumente diagnosticado depois do câncer de pele em homens, e é a segunda causa mais frequente de morte relacionada ao câncer nos Estados Unidos. Em os EUA, 233.000 novos casos de CaP foram diagnosticados, e 29,480 homens morreram da doença em 2014 [1]. Um em cada sete homens podem desenvolver câncer de próstata invasivo durante a sua vida [1]. As medições dos níveis séricos de antigénio específico da próstata (PSA), seguido de exame digital rectal (DRE) e exame histológico de biópsias da próstata, são ainda os métodos de diagnóstico de rotina mais amplamente utilizados para CaP. Em 1986, a PSA foi aprovado como um biomarcador para o monitoramento e acompanhamento de pacientes com CaP pela Food and Drug Administration dos Estados Unidos [2]. Os primeiros estudos relataram uma diminuição significativa na taxa de mortalidade dos pacientes CaP [3] após ampla introdução de testes de PSA para a triagem da população em grande escala. No entanto, estudos mais recentes têm revelado que o teste de PSA pode levar a excesso de diagnóstico generalizado e oneroso excesso de tratamento de pacientes com cancros indolentes [4]. Como PSA é um marcador específico de tecido, mas não específico do cancro da próstata para, níveis elevados de PSA durante e após a quimioterapia ou a prostatectomia radical indicar falha da terapia, e aparente recorrência da doença. Embora um marcador de acompanhamento clínico incontestável, os níveis de PSA única subir após CaP remissão e quando progressão já ocorreu. Por conseguinte, a PSA tem pouco diagnóstico e praticamente nenhum valor preditivo para a progressão da doença de cancro localmente avançado ( 10% dos pacientes), ou mesmo CaP metastático. Recentemente, no entanto, um painel de quatro calicreinas, em combinação com a estratificação do risco auxiliada por PSA, foi demonstrado ser útil na identificação de homens na casa dos cinquenta com um risco altamente aumentado de progressão da doença e o desenvolvimento de metástases distantes. Isto também fornece um meio para reduzir o excesso de diagnóstico da doença indolente [5]. Mais sensível, informativo, doença- e biomarcadores específicos do cancro seria necessário, a fim de distinguir os pacientes com alto risco de pessoas com cânceres indolentes ou lesões precursoras até mesmo pré-malignas. Isso também pode incluir marcadores que indicam “efeitos de campo” associados ao câncer, que só recentemente foram descritos no câncer de próstata [6], mas já se tornaram uma observação recorrente que é provável que se torne importante para fins de diagnóstico. painéis marcador à base de tecido podem ter o potencial para melhorar significativamente o diagnóstico, o que resulta em uma maior precisão e uma detecção mais precoce, ou podem indicar a natureza multifocal frequentemente observada da doença [7]. aplicações emergentes de diferentes tecnologias como a genómica, como a genômica, proteômica e metabolômica transcriptômica promoveram campo da descoberta de biomarcadores de forma significativa. Os marcadores que são funcionalmente envolvidos em várias fases de progressão da doença ou disseminação metastática pode ter o maior potencial para prever com sucesso as falhas de radiação e terapias anti-hormonais, que conduzem a cancro da próstata altamente agressivo e metastático resistente à castração (CRPC). Tais marcadores mecanicamente envolvidos pode não só melhorar significativamente a gestão CaP na prática clínica; Eles também podem representar novos alvos para intervenção terapêutica. Na prática clínica, a aplicação de marcadores mais preditivos, baseados em tecido poderia ser significativamente combinado com outros parâmetros de alto risco, tais como extracapsular positivo ou invasão das vesículas seminais, estágios tumorais avançados ( T2c, T3 ou T4), notas altas Gleason ( 8), ou elevada a muito elevada nível de PSA ( 20 ng /ml); e seria ainda apoiada por tecnologias avançadas de imagem, como ressonância magnética.

Nos últimos anos, técnicas moleculares, tais como perfil de expressão gênica por microarrays e de próxima geração seqüenciamento (NGS) têm facilitado enormemente estudos genômicos de expressão genética do tumor perfis. Por conseguinte, e de microarray-based NGS perfil de expressão de genes tem sido amplamente utilizada para a identificação de painéis de biomarcadores de prognóstico [8] e de previsão, incluindo tal forma que pode ser indicativo de CaP recorrência [9,10], os estágios iniciais e tardios da progressão do cancro, ou efeitos de campo. Identificação de novos biomarcadores, informativos para pulmão e cancro colorectal por mineração sistemática de conjuntos de dados de expressão de genes pública como a Cancer Genome Atlas (TCGA) tem sido relatada [11,12] em outro lugar. O banco de dados TCGA contém muitos estudos de expressão gênica em larga escala baseados em biópsias clínicas CaP [13,14,15], derivadas da investigação financiada publicamente e conjuntos de dados abertamente disponíveis. O Cancer Genomics Portal CBio [16] (https://www.cbioportal.org) é o principal recurso de acesso aberto para a mineração os conjuntos de dados genômica do câncer TCGA, e atualmente hospeda mais de 21.000 amostras tumorais de 20 entidades diferentes de câncer e 91 estudos. Nós selecionamos uma das maiores e mais abrangente desses estudos de expressão microarray da ACP de, realizados principalmente em biópsias clínicos, realizados por Taylor et al. no Memorial Sloan-Kettering Cancer Center (MSKCC) [13] em 2010. Este estudo inclui 181 amostras primárias APC, 37 amostras de CaP metastático, 12 linhas de células APC e xenotransplantes e 29 tecidos normais da próstata como controles saudáveis. Um grande número de parâmetros patológicos e clínicos, tais como notas de Gleason, estágios TNM, margens cirúrgicas positivas, o estatuto de invasão local de células cancerosas para os gânglios linfáticos, vesículas seminais, ou espaço extracapsular, ou metástases à distância são anotados. Esses parâmetros são considerados mais importantes para avaliar CaP agressividade, e confiantemente prever mau prognóstico da doença. Nossa meta específica para a mineração de dados foi utilizar uma abordagem aberta e imparcial, abordando um amplo espectro de tecidos normais, cânceres primários, e em estágio final, lesões avançadas. Uma vez que o objetivo não era de prever o resultado clínico ou avaliar o risco individual para pacientes ou subgrupos de pacientes com base em dados de expressão de mRNA, os dados não foram divididos em conjuntos de treinamento e teste de validação cruzada. Também não apontar para a avaliação de uma “assinatura marcador preditivo” para ser usado em outros, estudos independentes de expressão gênica mRNA. validação cruzada, portanto, não era essencial, a fim de confirmar como estatisticamente preciso um conjunto de biomarcadores preditivos iria realizar em conjuntos de dados adicionais. Em contraste, o nosso objectivo foi identificar biomarcadores anteriormente não declarada e validá-los em todo o espectro de biópsias clínicos disponíveis a partir de CaP. A nossa abordagem foi baseada em análise de expressão de ARNm diferencial para a identificação de candidatos a biomarcadores, seguida da sua correlação com os parâmetros experimentais clínicos mais críticos em colecções de amostras independentes, que eram muitas vezes de origem muito diferentes em comparação com os dados de microarray. O foco principal foi sobre a validação funcional de biomarcadores em relação ao CaP iniciação e progressão, de preferência combinado com avaliação do seu valor diagnóstico potencial.

Para validação independente dos achados iniciais, nós extraído recursos adicionais, como o

in silico

transcriptomics (IST) do banco de dados [17] (https://ist.medisapiens.com). Esta base de dados inclui dados de ARNm de expressão de genes em mais de 20,000 microarrays Affymetrix, cobrindo 60 tecidos saudáveis, 104 maligna e 64 outros tipos de doenças. Para mineração de dados, nós utilizamos Ingenuity Pathway Analysis (IPA), que fornece associação genética e ontologia informações, e permite a filtragem de genes baseados em aspectos funcionais. Durar não menos importante, foi utilizado o sistema de informações da literatura Pubmed para filtrar os biomarcadores que têm sido repetidamente descritas antes, como associada com PCA. Foi utilizada uma ferramenta de mineração de texto modo de lote (https://pmid.us), o que permitiu sca1nning através de toda a literatura para a malha título “cancro da próstata”, contra a co-ocorrência de centenas de genes candidatos inseridos como “símbolos de genes”. Com essa estratégia, um conjunto de 300 candidatos biomarcadores putativos foi priorizada passo a passo, usando uma combinação de diferentes dados e abordagens de mineração de texto ou de filtragem, destacando marcadores que foram mais fortemente correlacionadas com aspectos gerais de progressão da APC, falha terapêutica, ou progressão para metastático CRPC, mas anteriormente não abrangidos por um grande corpo de relatórios científicos. Oito genes foram selecionados para validação clínica e funcional. Para este efeito, por PCR (RT-PCR) foi aplicado quantitativo, em tempo real normalizado internamente transcrição reversa, utilizando quatro amostras de tecidos independentes de prostatectomia radical e cistoprostatectomia. Estas amostras cistoprostatectomia normais contidas, o tecido histologicamente benigna da cistoprostatectomia amostras com câncer de próstata incidental, além de tecidos para histologicamente benignos e câncer maligno de espécimes de prostatectomia radical.

Os recentes avanços na biologia celular têm facilitado estudos sistemáticos de validação funcional ( genética funcional) de candidatos biomarcadores, com base em abordagens eficazes, tais como tecnologias TALEN pequeno RNA de interferência (siRNA ou RNAi), CRISPR /Cas9 e. Destes, estudos siRNA continuam a ser os mais acessíveis, baratos e mais rápidos tecnologias na prática experimental, e representam a principal abordagem na validação alvo funcional. A fim de explorar os efeitos funcionais de genes seleccionados sobre o crescimento, a proliferação e propriedades invasivas das células de cancro da próstata, siRNA knock-down estudos para genes seleccionados foram realizadas em ambos os modelos 3D organotípicas (culturas de células organotípicas) 2D e usando o VCaP pouco invasiva e o linhas celulares PC3 altamente agressivos.

Materiais e métodos

Análise do perfil de expressão gênica para identificar biomarcadores candidatos

Um painel de diferentes métodos de análise bioinformática e filtragem foi aplicada a mina de grande a expressão do gene -scale profiling conjuntos de dados, e para selecionar os, biomarcadores putativos mais informativos para o prognóstico e /ou monitorização da progressão da doença (resumidos na Figura 1). Usamos Bioconductor /normalização de dados à base de R eo (Robust Multi-chip de Média) pacote para o processamento e normalização dos conjuntos experimentais Affymetrix extraídos do portal TCGA /CBio RMA. Em seguida, os genes foram classificados de acordo com a expressão diferencial de genes entre os principais grupos de amostras (n, normal; T, o PCA primária; e M, metastático PCA). Para este fim, utilizou-se vários testes estatísticos para significância (ANOVA, teste T ou Z-score e Mann-Whitney U;. E candidatos, em seguida, filtrado por várias correções de teste (Bonferroni) Em paralelo, foi utilizado o SAM ou ” as análises de significância programa para microarrays “, usando Falso taxa de detecção (FDR) critérios para a selecção do gene. Esta abordagem resultou em conjuntos de genes sobrepostos, semelhantes (dados não mostrados). Nós restritas a análise à grande conjunto de dados MSKCC (218 perfis de tumores, incluindo 37 metástases, 12 linhas celulares de CaP, 29 e tecidos da próstata normal). a expressão diferencial de cada gene em 181 amostras de cancro primário foi comparado com as 29 amostras normais (

T contra o N comparação

). do mesmo modo, a expressão em 37 amostras metastáticos foi comparado com as 181 amostras de CaP primárias (

M contra T

). a variação média dobra de expressão de mRNA e significância estatística em todas as amostras foram calculados, e os genes foram classificados de acordo com as diferenças mais fortes no gene mRNA expressão (vezes de alteração, consulte S1 e arquivos S2). Os 300 melhores acessos em cada grupo (T vs. N e M vs. T) então sujeito a filtragem de dados adicionais: Foram selecionados apenas os genes para acompanhamento, que mostrou as diferenças estatisticamente mais significativas, robustas e reproduzíveis entre normal, primário APC e das amostras de CaP metastático (com base em estimativas FDR ou Bonferroni-filter). Nós também utilizado a ferramenta de software Ingenuity Pathway Analysis (IPA) para as opções de filtragem adicionais das listas de genes originais, baseada em parâmetros estatísticos, bem como funcional “ontologia gene” e anotações via mecanicistas. Utilizamos a lista ordenada de candidatos gerados pelo IPA para correlação adicional com parâmetros clínicos (parcelas de Kaplan-Meier), avaliação da expressão específica de tecido, e mineração de texto literatura (próximos parágrafos). Para genes específicos do cancro identificados como diferencialmente expressos entre o N e T-grupos, classificando foi maior, se a expressão do gene mRNA diferencial também foi observado entre as subcategorias T e M.

Para cada gene selecionado, a caixa gráficos de expressão parcelas subdivididas foram gerados usando uma ferramenta de visualização de dados in-house baseada em HTML (R-executável (REX)). Isso permite sistemática, mineração de dados orientada para o utilizador de conjuntos de dados de acordo com os parâmetros clínicos (por exemplo subgrupos de tumores tais como cancros metastáticos primárias vs., nódulos linfáticos e invasão extracapsular, infiltração de margens cirúrgicas e metástases à distância). Além disso, a expressão diferencial entre o baixo (4-6), o intermediário (7) e elevada (8-10) de Gleason, ou entre diferentes fases da doença ( T2, T3 ou T4), e categorias de doenças, tais como primário vs. metástase ganglionar, foram avaliados sistematicamente (Fig 2A). Em seguida, priorizamos genes que foram especificamente, preferencialmente ou fortemente expressos em próstata em comparação com todos os outros tecidos humanos, incluindo outras entidades tumorais. Para este efeito, as pontuações expressão específica de tecido fornecidos pela base de dados on-line TSI foram usadas (Figura 2C). A pontuação de expressão e gráficos expressão box-plot para outros genes selecionados específico do tecido são resumidos no arquivo S3.

A) Dot gráfico enredo que ilustra a associação da expressão do gene mRNA de CACNA1D em amostras normais e cancerosas com um painel dos parâmetros mais informativos clínico-patológico. B) analisa Kaplan-Meier, mostrando a correlação de altos níveis de expressão de mRNA para CACNA1D com a análise de sobrevida global reduzida para pacientes APC. C) A expressão relativa de CACNA1D através de um painel de mais de 60 tipos de tecidos humanos normais e relacionadas com o cancro e doenças.

Em seguida, dirigida resultado clínico, mas utilizar-se outros conjuntos de dados para além do microarray MSKCC dados. Para cada gene selecionado, uma trama resultado do paciente Kaplan-Meier com base em um estudo clínico independente, em grande escala com dados disponíveis publicamente [15] foi gerada. Para este fim, focada na sobrevivência total e intervalos livres de doença, usando estatísticas não paramétricas que discriminam as funções de sobrevida do paciente a partir de dados da vida clínicos (Fig 2B). Desde cerca de 85-90% dos pacientes, mesmo com localmente avançado PCA mostraram sobrevivência a longo prazo ( 5 ou 10 anos) e principalmente boa evolução clínica, e apenas 10-15% desses pacientes evoluem para CRPC, escolhemos os números equivalentes também para as análises de Kaplan-Meier. Assim, 85% dos pacientes foram agrupados no “baixo risco /boa evolução clínica” da categoria, em comparação com 15% dos pacientes de alto risco que evoluem para CaP avançado.

Finalmente, para priorizar novos biomarcadores candidatos à validação funcional e clínico subsequente, a nossa lista de candidatos biomarcadores foi filtrada contra todo o banco de dados de literatura PubMed. Co-ocorrência de nomes de genes candidatos e símbolos Hugo com o termo “cancro da próstata” nas entradas do banco de dados PubMed foi examinada de forma sistemática, utilizando a ferramenta Pubmed lote-search (https://pmid.us). Genes que foram mencionados mais de cinco vezes em publicações científicas indexadas foram automaticamente excluídos como “previamente descrito em detalhe” (Status de pesquisa bibliográfica: setembro de 2012). Estes últimos passos de filtragem levou a oito genes para validação experimental. parcelas de expressão gênica do IST de banco de dados e do ponto parcelas de um conjunto de dados MSKCC estão resumidas no arquivo S3. Nosso objetivo foi identificar e confirmar biomarcadores gerais PCA-específicos (marcadores de diagnóstico), incluindo biomarcadores que podem indicar cedo e estágios de doenças multifocais ou “efeitos de campo”. Além disso, queríamos para validar potenciais marcadores de progressão CaP (marcadores prognósticos) que podem indicar o desenvolvimento de recaída, CRPC e lesões metastáticas após falha terapêutica.

As amostras de tecido para biomarcador clínica validação

A Comissão de ética do Hospital Distrital do Sudoeste da Finlândia aprovou o protocolo do estudo. Foi de acordo com a Declaração de Helsinki de 1975, revisto em 1996, com o consentimento informado de cada participante. Dois conjuntos independentes de amostras de tecidos relacionados com a próstata foram usadas para validação clínica. O primeiro conjunto consistiu de 180 amostras de tecido da próstata obtidos a partir de um total de 90 pacientes CaP primários, operado pela prostatectomia radical (RP) em Turku University Hospital (TYKS). De 90 pacientes, apenas 2 pacientes tinham recebido RHS-análogos antes da cirurgia como tratamento pré-operatório. A partir de cada próstata, foram retiradas duas amostras de tecido. Uma foi derivada da área cancerosa suspeita, o outro a partir da área adjacente, suspeito de ser benigno. A histo-patologia de metade de cada amostra de tecido foi examinada por patologistas TYKS, enquanto a outra metade foi imediatamente armazenado em tampão de guanidina isotiocianato (GITC) para extracção de ARN. O exame revelou que, para 30 dos doentes, ambas as amostras foram tomadas a partir da área benigna; para 15 pacientes, ambas as amostras foram tomadas a partir da área cancerosa; e para 45 pacientes, uma amostra foi retirada de benigno e outro da área cancerosa (como inicialmente previsto). Apenas duas amostras necessárias para ser excluído por causa de problemas técnicos com a extração de RNA. Finalmente, 178 amostras (104 amostras benignas e 74 amostras cancerosas) foram deixados para análise de expressão gênica por qRT-PCR. As características clínicas e patológicas de todos os 90 casos PAC estão apresentados na Tabela 1.

O segundo grupo incluiu 19 amostras de tecido da próstata, obtidas de pacientes com câncer de bexiga, sem quaisquer sintomas clínicos de CaP. Estes foram operados por cistoprostatectomia (CP) no Hospital Universitário de Skåne em Malmö, Suécia. patologistas experientes, utilizando o mesmo protocolo que o descrito anteriormente para os espécimes RP, analisou todos os espécimes da próstata. 12 dos 19 espécimes de próstata nesta coleção teve incidental PCA (IPCA), enquanto sete estavam livres de qualquer focos carcinoma detectável. No caso de IPCA, amostras de tecido para análise da expressão do gene foram tomadas a partir da área benigna.

A extracção e a transcrição reversa do RNA

A extracção de ARN a partir de amostras de tecido foi previamente descrito [18] . Resumidamente, o RNeasy Mini Kit (Qiagen, Alemanha) foi utilizada de acordo com as instruções do fabricante. Durante a extracção de RNA, e após o passo de lise celular inicial, uma quantidade conhecida de ARN de um

KLK3

gene mutado artificialmente, denominado mmPSA, foi adicionado à amostra como um controlo interno e para a quantificação absoluta dos níveis de expressão. A qualidade do ARNm obtido foi verificada por meio de electroforese em gel de agarose, e a concentração final de ARN foi medida por um espectrofotómetro NanoDrop N2000 (NanoDrop Technology, Ltd Lab). Reversamente transcrito de cDNA foi gerado usando o Kit High Capacity cDNA Archive (Applied Biosystems, EUA), seguindo as instruções do fabricante.

quantitativo em tempo real de RT-PCR

Nosso protocolo previamente descrito [19] para a química luminescente quelato-hidrólise aumentada, com base em fluorometria resolvida no tempo, foi também utilizado aqui para quantitativo em tempo real de RT-PCR. Para cada gene, um par de iniciadores específicos, e repórter correspondente e quencher sondas foram desenhadas e adquiridos a Thermo Fisher (Alemanha) (Tabela S1). Para marcar efectivamente as sondas repórter com um quelato de európio nonadentate, foi utilizado um procedimento previamente descrito [20]. PCR em tempo real foi realizada em um volume total de 25 uL, contendo 2,5 uL de ADNc molde com Hotmaster

™ Taq ADN polimerase (5 Prime, Alemanha) ou AmpliTaq

® DNA polimerase Gold (Applied Biosystems, EUA) . As amostras foram feitas em triplicado. Para corrigir a potencial degradação do ARN e a quantidade de ARN perdida durante a extracção e a transcrição reversa, a transcrição obtida de dados de nível devem ser normalizados. genes de manutenção (por exemplo,

GAPDH

) são assumidos para ser transcrito a um nível constante em diferentes tecidos e em todas as condições, e são amplamente utilizados para normalizar os resultados de RT-PCR em métodos de quantificação relativos [21]. No entanto, a confiabilidade dos genes de limpeza para a normalização tem sido frequentemente questionada devido à sua instabilidade durante as mudanças de armazenamento e de expressão inconsistente em condições de doença diferentes [22,23]. A adição de uma quantidade fixa de um RNA artificial, que não é expressa nas amostras de ARN inerentemente como referência interna para amostras (antes da extracção) é considerada como uma alternativa mais segura para normalização [24,25]. Neste estudo, tomaram as vantagens da utilização de ARN artificial (mmPSA) para normalização e os benefícios da utilização de sondas marcadas com quelatos de lantanídeos, em vez de sondas Taqman, que permitem a fluorometria resolvida no tempo para os ensaios de qRT-PCR.

estatística

Para as análises de qRT-PCR, as amostras foram consideradas positivas se todas as três repetições estavam acima do limite de detecção do ensaio mais baixa (LDL). A quantidade absoluta, numérico da expressão de genes para qualquer gene de interesse foi calculada utilizando os valores do padrão interno, normalizada pela quantidade de ARN total utilizado nestes ensaios. Para testar as diferenças de níveis de transcrição de genes candidatos entre caso e amostras de controlo, bem como entre as diferentes categorias de exemplo, o não-paramétrico de Mann-Whitney

foi aplicado U

teste. Para avaliar o desempenho de cada gene candidato em uma configuração de diagnóstico, uma característica operacional do receptor (ROC) análise da curva foi realizada e a área sob a curva (AUC) utilizado para avaliar a sensibilidade e especificidade dos ensaios. Para identificar a associação de ARNm de níveis de transcrição de um gene candidato em particular com a progressão do tumor (medida como a PSA recaída nas clínicas), as amostras de RP foram divididos em dois grupos, reflectindo recaída PSA e n recaída, respectivamente; de acordo com dados clínicos de acompanhamento. Qualquer associação entre os níveis de expressão de genes candidatos e os parâmetros clínicos ou patológicos como Gleason grau, pontuação de Gleason, a porcentagem de câncer contra células estromais em biópsias de tecidos, e da categoria T clínica (T-stage) foi abordada pela não-paramétrico de Mann-Whitney

U

teste, a fim de identificar diferenças estatisticamente significativas (p 0,05). As análises estatísticas foram realizadas com o software SPSS, versão 22 (IBM, EUA).

gene funcional knock-down estudos com siRNAs

PC-3 células de câncer de próstata humano independente de androgénios a partir de ossos metástase de adenocarcinoma da próstata foram compradas a partir de ATCC (EUA) [18] e cultivadas em meio RPMI-1640 a 37 ° C em condições padrão de cultura de células (95% de humidade e 5% de CO2). Para siRNA estudos knock-down, um total de 31 siRNAs diferentes foram encomendados à Qiagen (Alemanha) (três siRNAs diferentes para

ACSM1 Comprar e quatro siRNAs diferentes para cada um dos outros sete genes). Usamos várias linhas de células APC, incluindo, VCaP e LNCaP células PC-3, para estes experimentos de validação funcionais. Para alcançar o mais eficiente possível knock-down para cada gene, vários siRNAs foram testados tanto individualmente como também em misturas reunidas contendo todos os três ou quatro ARNic em concentrações iguais. Allstars Hs controlo morte celular siRNA (Qiagen, Alemanha) foi utilizada como um controlo positivo para estimar a eficácia de transfecção em cada experiência. Os ARNsi foram pré-carregadas em poços, foi adicionado Hiperfect agente de transfecção (Qiagen, Alemanha) em meio Opti-MEM (Invitrogen, EUA), e incubou-se durante 15 minutos à temperatura ambiente. Finalmente, 2000-5000 PC-3, as células LNCaP ou VCaP foram adicionados em cada cavidade. As concentrações finais de siRNA e Hiperfect em cada reacção foram de 4 nM e 8 nM, respectivamente. Para avaliar a eficiência da interferência de RNA para cada gene com os diferentes ARNsi, o RNA total foi extraído de células transfectadas cinco dias após a transfecção e expressão de siRNA ARNm específica dos genes alvo foi medida por qRT-PCR. Para seleccionar as moléculas de ARNip que resultam da forma mais eficaz knock-down, valores normalizados de expressão para cada uma das amostras tratadas foram divididas pelo nível do gene candidato em células de controlo não tratadas expressão ( “mexidos controlo”). Para excluir quaisquer possíveis efeitos deste procedimento sobre expressão do gene alvo, as células transfectadas por simulação (usando único agente de transfecção) foram incluídos como um segundo controle.

ensaios fluorescentes para medir a apoptose e inibição do crescimento de VCaP Organóides após siRNA transfecção

células VCaP não conseguiu crescer em condições de 3D, se directamente incorporado em Matrigel ou culturas de colágeno. Portanto, as células foram transfectadas com VCaP siRNAs como descrito para PC3. Em seguida, as células VCaP transfectadas foram cultivadas em placas de fundo redondo. As células foram deixadas a agregar e forma esferóides durante sete dias após a transfecção. Um pequeno número de esferóides (1-6) foram transferidas para poços de placas de cultura 3D. Tais Organóides VCaP mostrou alguns efeitos fenotípicos, mas exibida a alteração do crescimento organ�de e diferentes níveis de células em apoptose, mortas ou a morrer na cultura 3D em resposta a siRNAs, assim, foram consideradas informativo. A viabilidade celular foi determinada com o ensaio CellTiter-Glo de acordo com as instruções do fabricante (Promega, EUA). Resumidamente, tampão CellTiter-Glo e substrato liofilizado foi combinado, a 100 ul de a referida solução é adicionada a cada poço de amostra e a placa é agitada durante 30 minutos. A luminescência que resulta da lise das células e que estão em proporção com a quantidade de adenosina-trifosfato (ATP), foi medida com um leitor de placa multilabel EnVision (Wallac, Finlândia). Além disso, o ensaio da caspase 3/7 NucView foi usado que detecta células que sofrem activamente morte celular programada (descrito em pormenor em [26,27,28].

2D migração celular e ensaio de invasão

O potencial invasivo ou migração das células da APC foi investigada com um “ferida zero” ou um ensaio de cicatrização de feridas, realizadas em placas de ImageLock 96 poços (Essen Bioscience, EUA). Tanto as células VCaP e LNCaP faltava propriedades invasivas ou com motilidade em 2D ou condições 3D. Estas linhas celulares não mostram propriedades de fechamento da ferida, e não foram úteis em ensaios de zero da ferida. por este motivo, utilizou-se células PC3, que também expressas sete dos oito genes candidatos em níveis significativos, eram fáceis de transfectar pela