Abstract

Fundo

Mycoplasma hyorhinis

(

M.hyorhinis , M.hy

) está associada com o desenvolvimento de cancros gástricos e da próstata. O inflamassoma NLRP3, um complexo proteína de controlar a maturação de importantes citocinas pró-inflamatórias interleucina (IL) -1β e IL-18, está também envolvida na tumorigénese e metástase de vários cancros.

Metodologia /principais conclusões

para esclarecer se

M.hy

promovido o desenvolvimento do tumor através da ativação inflammasome, analisamos monócitos para IL-1β e IL-18 em cima

M.hy

desafio. Quando expostas a

M.hy

, monócitos humanos exibiu IL-1β rápida e robusta e secreção de IL-18. Nós ainda identificou que a proteína associada à membrana lipídica (LAMP) de

M.hy

foi responsável pela indução de IL-1β. Aplicando inibidores competitivos, gene shRNA específico e ratos gene alvo, verificou-se que

M.hy

induzida a secreção de IL-1β foi NLRP3 dependente

in vitro

e

in vivo

. a actividade da catepsina B, K

+ de efluxo, Ca

2 + fluxo e produção ROS eram todos necessários para a ativação inflammasome NLRP3 pelo

M.hy

. Importante, é IL-1β mas não IL-18 produzido a partir de macrófagos desafiados com

M.hy

promoveu a migração de células de câncer gástrico e invasão.

Conclusões

Nossos dados sugerem que a ativação do inflammasome NLRP3 pelo

M.hy

pode estar associada com a promoção da metástase do câncer gástrico, e anti-

M.hy

terapia ou limitar a sinalização NLRP3 poderia ser abordagem eficaz para o controle do progresso câncer gástrico

Citation:. Xu Y, Li H, Chen W, Yao X, Y Xing, Wang X, et al. (2013)

Mycoplasma hyorhinis

Ativa o NLRP3 inflammasome e promove a migração e invasão das células cancerosas gástricas. PLoS ONE 8 (11): e77955. doi: 10.1371 /journal.pone.0077955

editor: Suresh Yenugu, Universidade de Hyderabad, Índia |

Recebido: 05 de junho de 2013; Aceito: 06 de setembro de 2013; Publicação: 06 de novembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Xu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações de 100 Programa de Talentos da Academia chinesa de Ciências, Natural Science Foundation da China (91029707, 31170868), fundação Shanghai Natural Science (11ZR1442600), Fundação de Pesquisa Novo Nordisk-CAS, Programa de bolsas SA-SIBS, bem como concessões dos principais programas nacionais sobre Doenças Infecciosas (2012ZX10002007-003). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

os micoplasmas são pleomórficos de parede livre, organismos procariotas que residem tanto nas membranas das células eucariotas ou no interior das células, e eles são os mais pequenos organismos capazes de auto-replicação [1]. Até à data, pelo menos 16 espécies de micoplasma foram isoladas a partir de seres humanos [2].

Mycoplasma hyorhinis

(

M.hy

) foi considerada não patogênica para o ser humano, uma vez que normalmente infecta porcos levando a doença do trato respiratório e inflamação do peito e articulações [3], [4] . No entanto, o acúmulo de evidências sugere que

M.hy

infecção em humanos resulta em resultados clínicos.

M.hy

foi encontrado em 56% de carcinoma gástrico, 55% do carcinoma do cólon e 52,6% das biópsias de carcinoma do pulmão [5]. Além disso, 36% dos homens com hiperplasia prostática benigna (BPH) e 52% de homens com câncer de próstata são

M.hy

sero-positivo. Estes achados clínicos sugerem uma possível ligação entre o

M.hy

exposição com gástrico, cólon, pulmão e próstata [5], [6].

Após a infecção microbiana, receptores de reconhecimento padrão host ( SRRS), tais como TLRs sentir os patógenos e desencadear a síntese de citocinas pró-inflamatórias, tais como Pro-IL-1β e pro-IL-18 através da activação de NF-kB. Ao mesmo tempo, outro grupo de PRRs incluindo NLRP3 recrutar a ASC proteína adaptadora e conduzir à activação de caspase-1, que é uma protease activa que cliva a forma precursora de citocinas incluindo pró-IL-1β e pro-IL-18 em madura formulário, secretado [7]. Patógenos ou agentes desafiadores causar efluxo de potássio, danos mitocôndrias, liberação DNA mitocondrial, a produção de ROS, aumento de cálcio intracelular ou diminuição AMP cíclico celular em células do sistema imunológico inato, que estão todos envolvidos na caspase-1 ativação [8], [9], [10 ], [11], [12], [13]. Durante este processo, o NLRP3, ASC e pró-caspase-1 forma uma plataforma molecular chamada inflammasome. Até agora, uma série de inflammasomes foram identificados, um deles, o inflamassoma NLRP3 foi encontrada associada com o desenvolvimento de tumores [14], [15], apesar de existir controvérsia de diferentes modelos de [16], [17]. No entanto, a IL-1β foi relatado para promover o crescimento de células tumorais e metástases através da indução de vários genes pró-metastáticos, tais como as metaloproteinases de matriz e moléculas de adesão endoteliais, bem como TGF-β, quimiocinas e factores de crescimento [18]. Numa população coreana, a combinação do aumento do nível de IL-1β mucosa e homozigotia para o polimorfismo de nucleótido único IL-1β -31T (SNP) são ambos associados com o risco aumentado de cancro gástrico [18]. Além disso, Tu et ai. descobriu que a expressão específica do estômago de IL-1β humano em ratinhos transgénicos levou a inflamação espontânea gástrico e cancro [19], o que sugere ainda que a IL-1β podem promover a carcinogénese gástrica humana. Em contraste, a IL-18 aumenta a actividade de células NK, reduz a tumorigénese, induz apoptose e inibe a angiogénese em células de tumor para exercer efeitos anti-tumor [20], [21]. Além disso, uma produção inadequada de IL-18 foi encontrada para contribuir para a patogénese de cancros e pode influenciar o resultado clínico dos pacientes [22]. IL-18 foi relatada para estimular matriz metaloprotease-9 produção, resultando num aumento da migração e invasão na artéria coronária células de músculo liso e células HL-60 leucémicas mielóides [23], [24]. Também foi relatado que o soro de IL-18 de nível no grupo de doentes do cancro gástrico foi significativamente mais elevada do que no grupo de úlcera gástrica paciente [25] e IL-18 pode aumentar a metástase e a fuga imunitária do cancro do estômago através da sub-regulação de CD70 e manutenção de CD44 na linha celular de cancro gástrico humano NCI-N87 e SNU16 [26]. É também um mediador fundamental da migração por VEGF aumentada em linhas de células de cancro gástrico humano SNU-601 [27]. Os resultados acima sugerem que

Mycoplasma hyorhinis

pode promover a migração e invasão das células cancerosas gástricas ativando inflammasome.

Até o momento, um amplo espectro de micróbios, incluindo vírus, bactérias, fungos e protozoários ter sido identificado para activar o inflamassoma NLRP3 [28]. Um estudo recente mostrou que

Mycoplasma pneumoniae

também foi capaz de induzir a produção de IL-1β em células humanas [29]. No entanto, se o

M.hy

, que é um factor importante no desenvolvimento do cancro gástrico, como mencionado acima [5], [30], [31], activa o inflamassoma NLRP3 e se esta activação contribui para o cancro gástrico desenvolvimento permanecem desconhecidos. Neste estudo, verificou-se que

M.hy

desencadeada a secreção de IL-1β em uma maneira dependente da inflammasome NLRP3, eo resultante IL-1β induzida migração e invasão das células cancerosas gástricas.

resultados

M.hy

Triggers IL-1β e IL-18 Produção em THP-1 células

Para determinar se

M.hy

induz IL -1β produção a partir de células imunes inatas, que monitorizada maduros níveis de IL-1 na linha celular monocitica humana THP-1 As células desafiadas com diferentes quantidades de

M.hy

. Nesta experiência, uma forte indução de IL-1β de uma forma dependente da dose foi observada (Figura 1A). Em seguida, foram medidos os níveis de pró-IL-1β de ARNm nas células e níveis de proteína IL-1β maduras nos sobrenadantes de cultura em diferentes pontos de tempo após

M.hy

desafio. Observou-se que os níveis de ARNm de IL-1β atingiu um máximo de 3 horas após o desafio (Figura 1B) e madura de IL-1β (Figura 1C) e os níveis de proteína IL-18 (Figura 1D) atingiu um máximo de 12 horas após o desafio. Além disso, THP-1, macrófagos derivados também exibiram robusta secreção de IL-1β, IL-18, bem como outras citoquinas inflamatórias tais como IL-6 e IL-8 (Figura 1E, Figura S1). Para confirmar as conclusões anteriores em linha de células THP-1, examinamos a produção de IL-1β em monócitos humanos primários de doadores saudáveis ​​desafiados com

M.hy

, em que IL-1β também foi induzida fortemente (Figura 1F) . Estes dados indicaram que o

M.hy

desencadeada robusta IL-1β e IL-18, a secreção a partir de células mielóides humanas.

, 5 × 10

4 THP-1 As células foram tratadas com

M.hy

em diferentes doses, 12 horas mais tarde, os sobrenadantes foram recolhidos para ELISA de IL-1β. BD, 2 × 10

5 THP-1 As células foram tratadas com

M.hy

a uma concentração de 6,7 × 10

7 CCU /ml, as células e os sobrenadantes foram recolhidos a diferentes pontos de tempo para mRNA de IL-1β (B) e de detecção de IL-1β (C) assim como a proteína IL-18 (D) por Real-Time PCR e ELISA, como indicado. E-F, 5 × 10

4 macrófagos induzido por PMA (E) e monócitos primários humanos (F) foram tratados com

M.hy

, 12 horas mais tarde, os sobrenadantes foram recolhidos para ELISA de citoquinas. Os valores representam a média ± o desvio padrão (DP) de três experiências independentes. *** Representa P 0,001, ** representa P 0,01 e * representa P . 0,05 em comparação com o controle na análise estatística

LAMP derivado de

M.hy

é responsável pela indução de IL-1β através de TLR2

em seguida, investigou se era necessária a replicação do

M.hy

para a produção de IL-1β em monócitos. Como mostrado na Figura 2A,

H

.hy

inactivado por aquecimento ou ultra-violeta tratamento (UV) induzido como a secreção de IL-1β tanto a partir de células THP-1 como ao vivo

H

.hy. Isto indicou que certo calor e componentes resistentes UV da

M.hy

foi responsável pela indução da secreção de IL-1β. -Lípido associado proteína de membrana (LAMP) é abundantemente expresso na superfície de

M.hy

[32], e trabalho anterior constatou que as lipoproteínas de membrana a partir de outras espécies de micoplasmas induziu a secreção de IL-1β [33]. Nós portanto especulado que

LÂMPADA M.hy

derivado (MLAMP) podem ser responsáveis ​​pela indução de IL-1β em células THP-1. Em seguida, extraiu-se a partir de LAMP

M.hy

(Figura 2B) e testaram a capacidade de MLAMP para induzir a secreção de IL-1β em células THP-1. Descobrimos que MLAMP claramente induzida a secreção de IL-1β de uma forma dependente da dose, enquanto que a fase aquosa de

M.hy

extracto não foi capaz de fazê-lo (Figura 2C). Para excluir a possibilidade de RNA e /ou contaminação de DNA em MLAMP, nós tratamos os MLAPMs com RNase e DNase e descobriu que MLAMP foi o principal componente para a indução de IL-1β (Figura S2).

A, 5 × 10

4 células THP-1 foram tratadas com irradiação de calor ou ultra-violeta inactivado

M.hy

durante 6 horas e os sobrenadantes foram recolhidos para ELISA de IL-1β. B, proteína total de

M.hy

, MLAMP extraído de

M.hy

e a aquosa de proteína foram detectadas por SDS-PAGE e coloração com prata. C, 5 × 10

4 células THP-1 foram tratadas com MLAMP em diferentes concentrações e aquosa, 6 horas mais tarde, os sobrenadantes foram recolhidos para ELISA de IL-1β. D, 5 × 10

4 células THP-1 foram pré-incubados com as quantidades indicadas de mAb T2.5 ou conT2 (ug /ml) durante 0,5 horas e desafiados com RST2 P3CSK4 ligando (controlo positivo), TLR4 LPS ligando (controlo negativo) e

M.hy

a uma concentração de 6,7 × 10

7 CCU /ml, subsequentemente, durante 6 horas, os sobrenadantes foram recolhidos para ELISA de IL-1β. Os valores representam a média ± o desvio padrão de três experiências independentes. *** Representa P 0,001, ** representa P 0,01 e P * representa. 0,05 em comparação com o controlo na análise estatística

Foi relatado que MLAMP activado principalmente através de NF-kB e TLR2 TLR6 [34], [35]. Portanto, primeiramente foi aplicado um anticorpo neutralizante T2.5 TLR2 para bloquear o sinal de TLR2, com ConT2 que serve como um controlo de isotipo [36]. Como se mostra na Figura 2D, T2.5 bloqueou completamente a secreção de IL-1β estimulada por agonista TLR2 P3CSK4 mas não pelos LPS ligando TLR4. Importante, a secreção de IL-1β de

M.hy

células infectadas foi fortemente reduzida em T2.5, indicando que o TLR2 participou no MLAMP desencadeada a secreção de IL-1β em monócitos humanos. Curiosamente, a secreção de IL-1β a partir de células

M.hy

não infectadas foi completamente bloqueada por T2.5 (Figura 2D), o que sugeriu que a via de sinalização de TLR2-independente também foi envolvida em MLAMP desencadeada a secreção de IL-1β, que merece uma investigação mais aprofundada no futuro.

M.hy

induz IL-1β de secreções através da activação do NLRP3 inflammasome

Para testar se

M.hy

secreção de IL-1β induzida pela ativação inflammasome, primeiro utilizados LPS preparado macrófagos THP-1 derivados para verificar se

M.hy

pode ativar inflammasome como ATP ou MSU, que são conhecidos ativadores inflammasome. Como mostrado na Figura 3A,

H

.hy

foi capaz de induzir a libertação de IL-1β nas células activadas. Em seguida, examinamos a clivagem de caspase-1 e oligomerização de ASC, dois fabricantes importantes para a ativação inflammasome. Descobrimos que

M.hy

promovido a clivagem de caspase-1 e oligomerização de ASC (Figura 3B), indicando uma ativação direta de inflammasome pelo

M.hy.

a, 1 × 10

5 macrófagos induzido por PMA foram sensibilizados com 50 ml de LPS /ng, em seguida, tratados com

M.hy

, LPS, MSU ou ATP durante 5 horas, os sobrenadantes foram colhidos para IL-1β ELISA. B, A clivagem de caspase-1 e oligomerização de ASC nos lisados ​​enriquecido-inflamassoma e reticulados de THP-1 derivadas de macrófagos tratados com

M.hy

, LPS e MSU durante 6 horas. Os monómeros, dimeros e oligómeros de ASC foram indicados em conformidade. C, 5 × 10

4 THP-1 foram pré-tratados com um inibidor da caspase-AC-YVAD-CHO e depois desafiados com

M.hy

a uma concentração de 6,7 × 10

7 CCU /mL, 12 horas mais tarde, os sobrenadantes foram recolhidos para ELISA de IL-1β. D, silenciamento de sucesso (knock-down, KD) de ASC e caspase-1 foi verificada por transferência de western. E, 5 × 10

4 THP-1 precipitação, células de caspase-1 e células KD KD ASC foram tratados com

M.hy

a uma concentração de 6,7 × 10

7 CCU /ml, 12 horas mais tarde, os sobrenadantes foram recolhidos para ELISA de IL-1β. F, 5 × 10

4 células THP-1 foram pré-tratados com o inibidor NLRP3 inflamassoma glibenclamida e depois desafiados com

M.hy

, 12 horas mais tarde, os sobrenadantes foram recolhidos para ELISA de IL-1β. L, o silenciamento de sucesso de NLRP3 foi verificada por transferência de western. H, 5 × 10

4 células THP-1 de encriptação e NLRP3 KD foram tratados com

M.hy

a uma concentração de 6,7 × 10

7 CCU /ml, 12 horas mais tarde, os sobrenadantes foram recolhidos para IL-1β ELISA. I, a análise de imunotransferência de pró-caspase-1 e amadurecer forma (P10) da caspase-1 e IL-1β madura (P17) em sobrenadantes e pró-IL-1β (P31) e β-actina em extractos de células de THP-1 corrida e caspase-1 KD, ASC KD e NLRP3 KD células tratadas com

M.hy Compra de 6 horas. Os dados apresentados são média ± SD de um representante de três experiências independentes. *** Representa P . 0.001, em comparação com o controle na análise estatística

Além disso, nós testamos se a secreção de IL-1β

M.hy induzida

foi dependente de certos componentes inflammasome. Em primeiro lugar, verificou-se que o específico inibidor da caspase-1 AC-YVAD-CHO diminuição da secreção de IL-1β em células THP-1 de uma forma dependente da dose (Figura 3C). Em seguida, quando shRNA específico foi utilizada para silenciar a expressão de caspase-1 e ASC (Figura 3D), a produção de IL-1β foi fortemente diminuída mediante

M.hy

desafio (Figura 3E), indicando que

M.hy

induzida a secreção de IL-1β foi dependente da caspase-1 e ASC.

Então, nós testamos se NLRP3 foi necessário para

M.hy

induzida a secreção de IL-1β. Em primeiro lugar, verificou-se que o inibidor de NLRP3 glibenclamida suprimiu a secreção de IL-1β

M.hy induzida Online em uma maneira dependente da dose (Figura 3F) [37]. Quando shRNA específica foi utilizada para silenciar a expressão de NLRP3 (Figura 3G), a produção de IL-1β foi fortemente diminuído em cima

M.hy

desafio (Figura 3H), indicando que

M.hy

a secreção de IL-1β induzida era dependente NLRP3. Isto foi ainda confirmado por imunotransferência, em que a produção de caspase-1 e IL-activação 1β foram ambos NLRP3 dependente (Figura 3I). Além disso, verificou-se ainda que MLAMP foi o principal componente responsável pela ativação inflammasome NLRP3 pelo

M.hy

(Figura S2C). Além disso, AIM2 inflammasome foi relatado para ser ativado por DNA [38], e descobrimos que

M.hy

induzida DNA secreção de IL-1β através AIM2 inflammasome (Figura S3A). a secreção de IL-1β Curiosamente,

M.hy induzida

foi principalmente dependente NLRP3, enquanto AIM2 foi apenas parcialmente envolvidos (Figura S3A). Tomados em conjunto, estes resultados demonstraram claramente que

M.hy

induzida a secreção de IL-1β por meio da ativação do inflammasome NLRP3 em células monocíticas humanas.

mecanismos subjacentes

M.hy

Provocado NLRP3 inflammasome Activation

a ativação do NLRP3 inflammasome por uma variedade de estímulos depende da atividade catepsina B, K

+ de efluxo, o influxo de cálcio e /ou produção de espécies reactivas de oxigénio (ROS) [11], [ ,,,0],12], [13], [39]. Para explorar os mecanismos subjacentes a libertação de IL-1β em resposta a

M.hy

desafio, aplicada pela primeira vez inibidor CA-074 Catepsina B específico-Me e observaram uma atenuação significativa da secreção de IL-1β em cima

M .hy

desafio. A uma concentração de 100 uM, CA-074-me completamente bloqueada IL-1β libertação (Figura 4A). Esta inibição não era devido a qualquer efeito tóxico para as células, como a secreção de IL-8 afectado por este inibidor foi muito leve (Figura 4E). Importante, quando as células foram tratadas com catepsina K Inhibitor I, a diminuição da secreção de IL-1β não foi evidente em todos (Figura 4B e 4F), o que sugere que a actividade da catepsina B foi especificamente envolvido na activação inflamassoma NLRP3 durante

H .hy

desafio. Além disso, quando bloqueado K

+ efluxo através do aumento do K extracelular

+ concentração, a secreção de IL-1β por células THP-1 em cima

M.hy

desafio foi significativamente reduzida em uma dose forma dependente (Figura 4C). Mais uma vez, não houve qualquer efeito tóxico de KCL como IL-8 a partir das mesmas células foi normal (Figura 4G). Para descobrir se o influxo de cálcio ajudou a activação inflamassoma, foram adicionados diferentes doses de EGTA no meio de cultura celular e descobriram que o tratamento EGTA bloqueou

M.hy

induzida por secreção de IL-1β de uma forma dependente da dose, e não foi observado efeito tóxico de EGTA como evidenciado pela produção de IL-8 (Figura 4D e 4H).

5 × 10

4 THP-1 foram pré-tratados com diferentes doses de inibidor de catepsina B CA-074 Me (a, e) ou Catepsina K Inhibitor I (B, F), KCl (C, G) ou EGTA (D, H), em seguida foram desafiadas com

M.hy

a uma concentração de 6,7 × 10

7 CCU /mL, 6 horas mais tarde, os sobrenadantes foram colhidos para IL-8 e IL-1β ELISA ao mesmo tempo. Os dados apresentados são média ± SD de um representante de três experiências independentes. *** Representa P 0,001, ** representa P 0,01 e * representa P . 0,05 em comparação com o controle na análise estatística

Além disso, nós testamos se

M.hy

desafio induzida geração de ROS em células THP-1. Para este ensaio, as células THP-1 foram primeiro carregadas com o fluoróforo sensível ao redox DCFDA e depois desafiados com

M.hy

, ATP foi incluído como um controlo positivo. Como mostrado na Figura 5A, 16,9% de células positivas CM-H2DCFDA foram detectados 30 minutos após

M.hy

tratamento em comparação com 1,6% em células não tratadas. Estes dados sugerem que ROS podem contribuir para a ativação inflammasome NLRP3 em resposta a

M.hy

desafio. Para verificar esta possibilidade, pré-tratados células THP-1 com difeniliodónio inibidor de ROS (DPI) durante 30 minutos, e, em seguida, desafiados com as células

M.hy

antes da medição de IL-1β produção de 6 horas mais tarde. Como esperado, o DPI dramaticamente reduzida

M.hy

induziu libertação de IL-1β (Figura 5B). Um estudo recente mostrou que o inibidor de ERO, tais como DPI aboliu a libertação de IL-1β em macrófagos de ratinho por inibição da expressão do gene NLRP3 [40]. Portanto, nós também monitorado o nível de mRNA de pro-IL-1β e NLRP3 sob tratamento DPI. Verificou-se que DPI marcadamente reduzida a expressão de pró-IL-1β e NLRP3 (Figura 5C-D), o que foi consistente com o achado de células de rato [40]. Além disso, também examinámos a activação de caspase-1 e verificaram que as doses baixas (1 ou 10 uM) de tratamento de PPP não afectou a activação de caspase-1, enquanto 100 | iM de DPI inibiu a activação da caspase-1 (Figura 5E). Isto demonstrou que em células humanas DPI interferiu com a activação inflamassoma NLRP3 através da inibição da transcrição NLRP3, bem como de caspase-1 quando a actividade dose mais elevada foi aplicada. Colectivamente, estes dados sugerem que a actividade da catepsina B, K

+ de efluxo, Ca

2 + fluxo e ROS contribuíram para a ativação inflammasome NLRP3 em resposta a

M.hy

desafio.

células THP-1 A, os níveis de ROS em

M.hy

tratados foram analisados ​​por meio de rotulagem CM-H2DCFDA. Os dados representam média da percentagem de células CM-H2DCFDA-positivos. B, 5 × 10

4 células THP-1 foram pré-incubados com as quantidades indicadas de DPI durante 0,5 horas e desafiados com

M.hy

subsequentemente durante 6 horas, os sobrenadantes foram colhidos para IL 1β ELISA. 1 × 10

5 células THP-1 (C) e macrófagos induzido por PMA (D) foram pré-incubados com as quantidades indicadas de DPI durante 0,5 horas e desafiados com

M.hy

(concentração final, 6,7 × 10

7 CCU /ml), subsequentemente durante 3 horas, as células foram lisadas e o ARNm foram extraídos para a síntese de cDNA e, finalmente, para a IL-1β e expressão do gene NLRP3 por PCR em tempo real. E, a análise de imunotransferência de pró-caspase-1 madura e forma (P10) da caspase-1 e IL-1β madura (P17) em sobrenadantes e extractos de THP-1 derivadas de macrófagos tratados com

M.hy para

6 horas após o pré-tratamento do DPI durante 0,5 horas. Os dados apresentados são SD ± média de um representante de cada três experimentos independentes.

M.hy

Ativa NLRP3 inflammasome

in vivo

quando a medula óssea de ratinho (células dendríticas derivadas BMDCs) foram infectados com

M.hy

, uma indução de IL-1β sustentado foi observado (Figura 6A). Outras experiências sobre BMDCs isolados de tipo selvagem (WT) ratos ou camundongos deficientes para caspase-1, ASC ou NLRP3 com

M.hy

desafio confirmou que

M.hy

indução de IL 1β foi NLRP3 inflammasome dependente (Figura 6B). Além disso, a inoculação sistémica do

M.hy

em camundongos WT induzidas produção de IL-1β no soro e no fluido de lavagem peritoneal (PLF), mas não em ratinhos falta ASC ou NLRP3 (Figura 6C-D). Curiosamente, o nível basal de IL-1β em ratinhos deficientes ASC foi claramente mais elevado do que em ratinhos deficientes em WT ou NLRP3, mas desafio com

M.hy

não aumentar ainda mais a secreção de IL-1β em tais ratinhos (Figura 6C-D). Colectivamente, estes resultados confirmam que as

M.hy também

activado NLRP3 inflammasome em camundongos

in vitro

e

in vivo

.

A, 1 × 10

5 medula óssea de ratinho células dendríticas derivadas (BMDCs) foram desafiados com

M.hy

a uma concentração final de 5 x 10

7 CCU /ml, em diferentes pontos de tempo, os sobrenadantes foram colhidos para IL -1β ELISA. B, 1 × 10

5 BMDCs isolados de tipo selvagem e caspase-1 deficiente (knock-out, KO), ASC KO e NLRP3 KO rato foram desafiados com

M.hy

a uma concentração final de 5 × 10

7 CCU /ml, 24 horas mais tarde, os sobrenadantes foram colhidos para IL-1β ELISA. i.p. C-D, C57BL /6, ratinhos KO e ASC NLRP3 KO foram injectados com 5 × 10

8 CCU /ml de

M.hy

em 200 ul de PBS. Os ratinhos foram sacrificados 6 horas após a injecção, e o soro ou fluido de lavagem peritoneal (FLP) foram recolhidas para a IL-1β ELISA (C, D). A experiência foi repetida três vezes, e os dados foram reunidos e mostrou como média ± DP. *** Representa P 0,001 e ** representa P . 0,01 em comparação com o controle na análise estatística

M.hy

Induzida por IL-1β Promove migração tumor gástrico celular e invasão

Os dados acima mostram claramente que

M.hy

foi capaz de induzir a produção de IL-1β a partir de células da imunidade inata através da ativação inflammasome NLRP3. estudos epidemiológicos iniciais revelaram um possível papel de micoplasma no desenvolvimento de câncer gástrico [5]. E

Mycoplasma hyorhinis

foi demonstrado para promover a migração do tumor celular, invasão e metástase

in vitro Comprar e

in vivo

[41]. Trabalhamos com a hipótese de que não pode existir um outro mecanismo para esta promoção, que é o

M.hy

pode promover a carcinogênese e /ou metástase gástrico, promovendo a produção de IL-1β. E nós confirmou que

M.hy

promoveu a migração de células de câncer gástrico e invasão (Figura S5). Desde

M.hy

foi demonstrado para infectar células de cancro gástrico ([41], Figura S4), é assim possível que

M.hy

pode induzir a activação em células de cancro inflamassoma directamente. No entanto, nenhuma activação inflamassoma foi detectada em células de cancro gástrico (Figura S6).

próxima determinado o efeito de recombinante humano IL-1β (rIL-1β) na carcinogénese celular de cancro gástrico num ensaio de formação de colónias, que revelou que o rIL-1β não influenciaram a proliferação da linha celular de cancro gástrico MGC-803 (Figura S7). Desde IL-1β foi relatado para promover metástase de outros tumores [18], verificamos os efeitos de rIL-1β sobre a migração e invasão de células MGC-803. Os nossos resultados mostraram que a migração MGC-803 e invasão foram reforçadas com o tratamento com rIL-1β (Figura 7A e 7C), enquanto que o tratamento com rIL-18 não apresentaram qualquer efeito (Figura 7B e 7D). Em seguida, nós tratamos estas células cancerosas gástricas com os sobrenadantes da cultura de

M.hy

desafiou THP-1 macrófagos ou macrófagos derivados com silenciamento de NLRP3, ASC e caspase-1 para migração e ensaio de invasão. Os nossos resultados mostraram que os sobrenadantes de cultura a partir de

M.hy

células de macrófagos desafiados embaralhamentos migração e invasão de células gástricas cancerosas fortemente melhoradas, enquanto que os sobrenadantes de cultura a partir do NLRP3, ASC ou caspase-1 não macrófagos knockdown, provavelmente devido à secreção de IL-1β diminuída (Figura 8A e 8C). Esta migração acrescida e invasão de células MGC-803 foi abolida pelo tratamento das células com anticorpos anti-IL-1β mAb (Figura 8B e 8D). Tomados em conjunto, os nossos resultados demonstraram que

M.hy

induzida migração e invasão da linha de células de câncer gástrico MGC-803 através da promoção da secreção de IL-1β a partir de células monocíticas. Além disso, nossos dados indicam que

M.hy

induzida activação inflammasome pode promover

M.hy

replicação (Figura S8), o que pode criar um feedback positivo e, finalmente, leva a cronicidade da doença.

5 × 10

4 MGC-803 células tratadas com as doses indicadas de IL-1β (A e C) ou IL-18 (B e D) foram analisados ​​por ensaios de migração e invasão Transwell. A parte superior foram migrados ou invadido células eo menor foram números médios de 4 campos microscópicos para cada experimento correspondente respectivamente. Os dados são representativos de três experiências independentes e as barras de erro representam DP. *** Representa P 0,001 em comparação com o controle na análise estatística

A-B, 5 × 10

4 MGC-803 células tratadas com o SNS de macrófagos mexidos como controle, e SNS. de

M.hy

tratada Casp-1 KD, ASC KD e NLRP3 KD macrófagos foram analisados ​​pela migração Transwell (A) e ensaios de invasão (B). C-D, 5 × 10

4 MGC-803 células tratadas com o SNS de

M.hy

THP-1 tratadas macrófagos ou LSs contendo anti-IL-1β mAb foram analisados ​​por migração Transwell derivados (C ) e invasão (D) ensaios. Os painéis superiores são migrados ou invadido células e os painéis inferiores são números médios de 4 campos microscópicos para cada experimentos correspondentes, respectivamente. Os dados são representativos de três experiências independentes e as barras de erro representam DP. *** Representa P 0,001, ** representa P 0,01 e * representa P . 0,05 em comparação com o controle na análise estatística

Discussão

Mycoplasmas distinguir-se de outras bactérias pelo pequeno tamanho, o genoma minuto e ausência de parede celular. Muitos micoplasmas estabelecer colonização e infecção através de aderência aos tecidos do hospedeiro. Devido a sua arquitetura de superfície dinâmica é antigenicamente e funcionalmente versátil, micoplasmas são capazes de evadir ataque imune do hospedeiro e adaptação a diversos habitats e causar doenças crónicas [32]. Desde a identificação de

M.hy

de suínos em 1962, pouca investigação foi levada a cabo sobre este patógeno até que foi encontrado para ser associado com vários cancros humanos [5], [41], [42], [ ,,,0],43]. Mais recentemente, cientistas descobriram que

M.hy

p37 proteína foi responsável por promover invasão de células de câncer e metástase [30], [44]. Além deste mecanismo direto, este micróbio pode também induzir a tumorigênese ou metástase indiretamente por meio de um processo inflamatório crônico local. É bem sabido que a IL-1β é uma importante citocina pró-inflamatória que promove o crescimento de células de cancro do cólon e aumenta a capacidade de invasão e metástase de células de melanoma B16 [19], [45]. A sobre-expressão de IL-1β foi encontrada para induzir a inflamação e cancro gástrico em ratos [19]. Neste estudo, nós investigamos se a inflammasome NLRP3, que controla a maturação IL-1β, foi ativada pelo

M.hy

, e se esta activação pode contribuir para a

M.hy

associado a metástase gástrica . Nossos resultados mostraram que

M.hy

ativado o inflammasome NLRP3

in vitro

e

in vivo

, ea promoção da migração de células de câncer gástrico e invasão de

M .hy

era dependente da ativação inflammasome NLRP3. Além NLRP3, descobrimos que

DNA M.hy

também activado o inflammasome AIM2, mas a ativação MLAMP de NLRP3 foi o componente dominante para a indução de IL-1β por

M.hy.

recentemente, foi relatado que a secreção de IL-1β lipopéptido acilado de micoplasma morta pelo calor

Acholeplasma laidlawii

(HKAL) induziram a produção de IL-1β através NLRP7 inflamassoma em células humanas, enquanto HKAL totais induzida foi parcialmente dependente NLRP3 [46], o que indica que múltiplos inflammasomes pode ser activado por alguns micoplasmas. Nossos dados não descartou o possível envolvimento de NLRP7 em

M.hy

induzida a produção de IL-1β, mas

M.hy

principalmente ativado o inflammasome NLRP3, porque a secreção de IL-1β foi quase completamente abolida nas células NLRP3 silenciados (Figura 3 horas e 3I).

os primeiros estudos propuseram que ROS ativado o inflammasome NLRP3 ativando caspase-1 [47]. GCCTATTATTGCTAAAGATAAATATCTTAAGGTATTTTAATATTGGTAATCTATTTTAGAAATTTAATTTAAAAATTAAACTCGGTTATAAAAAAGATCGTTGAAATAATAAATATGAAGTTAATCATATTGTTATTTGCTATTCAGTTTTCAAAGAACTATAATTGAGAACTTAAAGCTCTCAAAACTAGACACGAATCGATTATGTAATAAGTCAATTAAGACTAACGGAAAGCGGAAAAAGAAGGTGATCCGTCCCCACG.