Abstract

Várias características biológicas únicas de HIV-1 Vpr torná-lo um agente potencialmente poderosa para a terapia anti-câncer. Em primeiro lugar, a Vpr inibe a proliferação celular através da indução da paragem do ciclo celular G2. Em segundo lugar, que induz a apoptose através de vários mecanismos, que pode ser significativo, uma vez que pode ser capaz de superar a resistência apoptótica exibido por muitas células cancerosas, e, finalmente, a Vpr selectivamente mata células em crescimento rápido de um modo independente de p53. Para demonstrar a utilidade potencial da Vpr como um agente anti-cancro, foram realizados estudos de prova de conceito

in vitro

e

in vivo

. Os resultados dos nossos estudos preliminares demonstraram que o Vpr induz a paragem G2 do ciclo celular e apoptose numa variedade de tipos de cancro. Além disso, os mesmos efeitos de Vpr também pode ser detectado em algumas células cancerosas que são resistentes aos fármacos anti-cancro tais como a doxorubicina (DOX). Para ilustrar ainda mais o valor potencial de Vpr na inibição do crescimento tumoral, que adoptou um modelo de neuroblastoma resistente a DOX por injecção de células SK-N-SH em murganhos C57BL /6N e murganhos C57BL /6J-scid /scid. Colocámos a hipótese de que a Vpr é capaz de bloquear a proliferação celular e induzem a apoptose independentemente do estado de resistência a drogas de tumores. Na verdade, a produção de Vpr

via

entrega adenoviral de células do neuroblastoma causada prisão G2 e apoptose em células ingénuas e resistentes-DOX drogas. Além disso, a pré-infecção ou injecção intratumoral de

vpr

partículas adenovirais em tumores de neuroblastoma em murganhos SCID crescimento tumoral -expressing marcadamente inibida. Assim, a Vpr pode, possivelmente, ser utilizado como um agente terapêutico suplementar viral para a inibição selectiva do crescimento do tumor em terapia anti-cancro, especialmente quando outras terapias parar de funcionar

citação:. Zhao RY, Liang D, Li L, Larrimore CW , Mirkin BL (2010) Anti-Cancer Efeito do HIV-1 viral R Protein em doxorrubicina resistente Neuroblastoma. PLoS ONE 5 (7): e11466. doi: 10.1371 /journal.pone.0011466

editor: Fatah Kashanchi, George Mason University, Estados Unidos da América

Recebido: 06 de maio de 2010; Aceito: 8 de junho de 2010; Publicação: 07 de julho de 2010

Direitos de autor: © 2010 Zhao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado em parte pelo Medical Research Council Chicago, Departamento de Ajuda Pública e do Departamento de Serviços de Saúde Humanos dos Estados Unidos Illinois e da Universidade de Maryland Medical Center (para Ryz). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Embora tenha havido grandes avanços no tratamento do câncer ao longo das últimas décadas, ainda existe um grande número de obstáculos que limitam o uso de algumas dessas novas terapias. Os obstáculos que são apresentados incluem, mas não estão limitados a, 1) servir efeito colateral devido à citotoxicidade não específica das terapias, 2) o desenvolvimento de resistência à droga, e 3) o desenvolvimento de resistência do tumor à apoptose. Portanto, qualquer agente anti-câncer que poderia evitar ou substituir as deficiências de alguns dos atuais tratamentos anti-câncer seria de grande importância para o design futuro da terapia anti-câncer. Idealmente, um agente eficaz anti-câncer devem ter as seguintes propriedades. Deve ser capaz apenas a proliferação celular anormal 1) bloco que resulta da perda de regulação do ciclo celular normal, por exemplo, mutações de ponto de verificação celular; 2) induzir a paragem do ciclo celular sustentada que poderia levar a morte celular ou apoptose; 3) induzir células específica para matar as células cancerosas com o mínimo ou nenhum efeito sobre as células normais; 4) ser capaz de substituir a resistência apoptótica, uma característica típica de muitas células cancerosas; 5) têm o efeito de morte celular independente de mutações oncogénicas comuns, tais como p53; 6) conferem o mesmo prender e matar células de efeitos em células resistentes aos medicamentos, ou seja, quando outro fármaco quimioterápico falha; e 7) ou absorvida facilmente secretado por células, na sua forma bioactiva originais.

A proteína virai R (vpr) feito pelo vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) poderia potencialmente preenchem muitos dos critérios acima mencionados. Porque, 1) Vpr bloqueia a proliferação de células cancerosas por indução da paragem do ciclo celular G2 [1], [2], e este efeito é independente de prender os pontos de verificação de ADN clássicos [3], [4]; 2) Vpr induz a apoptose através de múltiplas vias que não dependem de respostas celulares do hospedeiro [5], [6]; e 3) Vpr seletivamente mata as células a crescer rapidamente de uma forma independente de p53 [7], [8], sugerindo a morte celular induzida por Vpr pode oferecer o poder de forma mais seletiva em matar células cancerosas do que as células normais e essa propriedade citotóxica deve ser eficaz em muitos dos cancros, em que a p53 gene está mutado. 4) em si Vpr não é contagiosa; 5) A Vpr é uma proteína solúvel que é, naturalmente, também transduzidas. tranducing capacidade natural da proteína permite que seja levado para cima e segregada por células sem o auxílio de qualquer veículo de entrega especiais [9]; e 6) a Vpr é uma proteína associada ao virião. Isto permite possível a entrega da proteína Vpr de alvo tumores específicos, tais como neuroblastoma ou glioma utilizando vectores virais especialmente concebidos [Para revisões, ver [10]].

HIV-1 Vpr é uma pequena proteína virai com um acessório comprimento médio de 96 aminoácidos e um peso molecular calculado de 12,7 kD. Vpr é uma proteína única que não apresenta qualquer homologia conhecida a qualquer outras proteínas celulares actuais. A estrutura terciária da Vpr proposta com base na análise por RMN é composto por um domínio α-hélice-volta-α-hélice na metade amino-terminal de entre os aminoácidos 17 a 46 e um longo α-hélice a partir de aminoácidos 53 a 78 no a metade do terminal carboxilo [11]. Estes três hélices a são dobradas em torno de um núcleo hidrofóbico em uma estrutura que permite a interacção entre a Vpr e outras proteínas celulares diferentes [12]. As interações entre Vpr e proteínas celulares sublinhar os papéis multifacetados em sua interferência com funções celulares do hospedeiro, como descrito acima [Para comentários, veja [8], [13], [14]].

Um dos mais difíceis cânceres de tratar é neuroblastoma. Este sarcoma mortal consiste em neuroblastos células malignas que aparece em ambos os sistema nervoso autónomo ou na medula adrenal. Neuroblastoma é considerado um tipo de tumor neuroepithelial que afeta principalmente bebês e crianças até 10 anos de idade. É um dos tumores sólidos mais comuns da infância. O tumor tipicamente se origina na medula adrenal, com o local mais comum sendo o abdómen (perto da glândula supra-renal), mas ele também pode ser encontrado na pele, o peito, pescoço, pélvis, ou de outras áreas. Enquanto entende-se que mutações genéticas quer durante o desenvolvimento fetal, ou aqueles que foram herdada vantagem de neuroblastoma, a causa exacta destas mutações genéticas são ainda desconhecidos. As opções de tratamento que estão disponíveis incluem, principalmente, cirurgia, quimioterapia, terapia de radiação, e transplantes de medula óssea. No entanto, apesar das várias opções terapêuticas, a morbidade deste câncer é ainda muito elevado e está atualmente perto de 100%. A principal razão para essa alta morbidade é porque a maioria dos pacientes têm a doença disseminada no momento do diagnóstico e estes tumores desenvolvem resistência rápida à quimioterapia e radioterapia.

A principal abordagem para o tratamento do câncer, muitas vezes envolve quimioterapia. Quimioterapia funciona por matar as células rapidamente divididos, o que é uma propriedade principal das células cancerosas. Infelizmente, neuroblastoma desenvolve resistência rapidamente aos agentes de quimioterapia e torna difícil tratamento. Há várias razões possíveis para a resistência à quimioterapia, que incluem 1) as células que não são mortas pela quimioterapia mutação, se tornarem resistentes, 2) proteínas que transportar drogas em células cancerosas parar de trabalhar, 3) as células podem começar a bombear drogas para fora da célula como rápido quanto eles podem entrar na célula, 4) genes que provocam uma superprodução de proteínas que tornam uma droga ineficaz pode tornar-se ampliado, e 5) células cancerosas podem começar a reparar quebras de DNA causadas por tratamento. Considerando-se uma rápida resistência a drogas de neuroblastoma e um número limitado de drogas correntemente disponíveis para o tratamento de neuroblastoma, existe uma grande necessidade de uma nova terapia que pudessem continuar a eliminar células malignas, quando as células desenvolveram resistência a outros fármacos anticancerígenos. Uma nova solução possível para este dilema é a utilização potencial do HIV-1 Vpr com as suas características biológicas únicas descritas acima.

Para demonstrar a utilidade potencial de Vpr como um agente anti-cancro, levámos a cabo prova- de conceito estudos preliminares

in vitro

e

in vivo

. Os resultados dos nossos estudos mostraram que o Vpr induz a paragem G2 do ciclo celular e apoptose numa ampla variedade de tipos de cancro. Temos ainda demonstrado que os mesmos efeitos Vpr pode também ser detectada em células de cancro que são resistentes a drogas anti-cancerígenas tais como DOX. Além disso, adotamos um sistema modelo de rato neuroblastoma que nos permite mostrar o efeito supressor da Vpr no crescimento do tumor

in vivo

.

Resultados

Vpr induz G2 do ciclo celular prisão em várias células cancerígenas

Vpr foi observado para induzir a paragem do ciclo celular G2 em uma ampla variedade de células eucarióticas que variam a partir de levedura de fissão de células humanas [15], [16]. Estas observações sugerem que altamente conservadas as actividades celulares de células eucarióticas são efectivamente afectados por Vpr. Neste estudo, o sistema de infecção adenoviral foi seleccionado para medir o efeito potencial do HIV-1 na indução de G2 do ciclo celular em vários tipos de cancro (Tabela 1) como descrito anteriormente [17] – [19]. Os sistemas adenovirais permite a quase 100% de células a serem infectadas por transdução e detecção de efeitos Vpr são capazes de ser observadas tão cedo quanto 5 horas [18]. Usando este sistema, testou-se o efeito potencial da Vpr em vários tipos de linhas celulares de cancro. Estes tipos de cancro incluem cervical (HeLa), da mama (MCF-7), do ovário (A2780) e de tipo T ou linfomas de células B (células Jurkat e SU-DHL-4). Como mostrado na Figura 1 e Tabela 1, a Vpr induziu a paragem G2 do ciclo celular em todos os tipos de células cancerígenas testadas com a excepção de que apenas deslocamento G2 parcial foi observada nas células MCF-7 (Figura 1 – meio). A relevância funcional desta indução G2 parcial é supôs na discussão. Além disso, esta indução G2 parece ser independente do estado do gene p53, o que é consistente com um certo número de relatórios anteriores [7], [20]

Todas as linhas celulares de cancro (ver Tabela 1 para detalhes;. Única 3 linhas celulares são aqui apresentados como exemplos) foram cultivadas como descrito nos Materiais e Métodos. As células foram transduzidas com Adv ou Adv-Vpr com MOI de 1,0. As células foram recolhidas 48 horas pós-infecção (

p.i.

), As células foram, em seguida, preparado como descrito em Materiais e Métodos. conteúdo em ADN celular foi analisada por citometria de fluxo FACScan (Becton Dickinson) como anteriormente descrito [4], [19]. Os perfis do ciclo celular foram modeladas utilizando software ModFit (Verity Software House, Inc.).

Vpr induz G2 paragem do ciclo celular e morte celular, independentemente do status resistência aos medicamentos à doxorrubicina

a doxorrubicina (adriamicina, hydroxydaunorubicin, DOX) é uma droga antineoplásica que tem sido usada no tratamento de uma grande variedade de cancros, incluindo os da mama, do estômago, do pulmão, do ovário e cancro da bexiga, bem como leucemia, muitos tipos de carcinoma, e dos tecidos moles sarcomas. O mecanismo molecular preciso de DOX não tem sido bem estabelecida. No entanto, sabe-se que intercalam o ADN e interromper a replicação do ADN conduzindo assim à morte das células [21]. Embora DOX continua a ser um componente essencial da primeira linha de terapias anti-cancro no tratamento de muitos tipos de tumores, o desenvolvimento de drogas tumor resistente a DOX e outros regimes anticancro é um obstáculo importante para a realização de tratamentos anti-cancro bem sucedidas [22], [23]. Para explorar se Vpr pode bloquear a proliferação celular por prisão G2 e matar as células tumorais resistentes a drogas anti-câncer, que expressou a

gene vpr

via

transdução Adv-Vpr em três pares de droga ingénuo (WT) e as células cancerosas resistentes a DOX (DOX-R). Eles são do neuroblastoma humano (SK-N-SH), osteossarcoma (SaOS2), e adenocarcinoma da mama (MCF-7). Estas linhas celulares resistentes a DOX foram geradas por incubação contínua de linhas celulares parentais com stepwise aumentos nas concentrações de DOX que variam de 10

-9 a 10

-6 M ao longo de um período de 3 a 6 meses. método detalhado para a geração destas linhas celulares DOX-resistentes foram descritos anteriormente [24]. Como mostrado na Tabela 1, a expressão de Vpr provoca a paragem do crescimento celular em todas as células testadas, independentemente do estado de resistência à droga para a DOX. Além disso, a medição da proliferação celular e a viabilidade pelo teste de MTT, que metaboliza sal de tetrazólio (MTT), mostraram pouca proliferação celular ou células viáveis ​​à esquerda 5 dias após a transdução Adv-Vpr (Figura 2); De igual modo, a determinação da integridade da membrana celular por azul de tripano, que cora apenas as células mortas, indicaram que a Vpr confere muito potente citotoxicidade para as células (Figura 2).

Três pares de droga ingénuos (WT) e DOX-resistentes as células cancerosas (DOX-R) foram testadas quanto à captura induzida por Vpr G2 (Tabela 1) e a morte celular. Estas linhas celulares de cancro foram cultivadas tal como descrito nos Materiais e Métodos. As células foram transduzidas com Adv ou Adv-Vpr com MOI de 2,5. A viabilidade celular foi determinada quer pelo ensaio de exclusão de azul de tripano, a qual identifica as células mortas (figura superior), quer pelo ensaio de MTT para medir a sobrevivência das células (figura inferior). As células foram examinadas 5 dias

p.i

intials:. WT, de tipo selvagem; Dox-R, doxorrubicina-resistente; 1, Mock; 2, Adv e 3, Adv-Vpr.

Vpr induz a morte celular dose-dependente e apoptose em células DOX-naïve e resistentes neuroblastoma

Para entender melhor a morte celular induzida pela Vpr em células tumorais ingênua e resistentes aos medicamentos e se preparar para um

in vivo

estudo do efeito potencial da Vpr no crescimento do tumor em um modelo de rato, decidimos concentrar nossos esforços estudo sobre o neuroblastoma. Neuroblastoma foi escolhido como um sistema modelo, porque o neuroblastoma é um dos tumores sólidos mais comuns da infância normalmente encontrados em bebés ou crianças pequenas. Outra razão para escolher o modelo de neuroblastoma é que o xenotransplante sistema de modelo de rato neuroblastoma humano está bem estabelecida [25], [26].

Antes de conduzir

in vivo

estudos com camundongos, determinou-se em primeiro lugar o potenciais respostas dependentes da dose da morte celular induzida tanto em vpr tipo selvagem (wt) e células de neuroblastoma resistentes a fármaco (DOX-R) SK-N-SH. O azul de tripano e os ensaios MTT foram usadas para medir a proliferação celular e a viabilidade de controlo após 5 dias e transduções Adv Adv-Vpr. Resumo dos resultados são mostrados na Figura 3A-um. Embora o aumento da multiplicidade de infecciosidade (MOI) de controlo Adv não causou morte celular significativa, uma morte celular dependente de dose clara foi mostrada em ambas as células WT e DOX-R, tal como indicado pelo ensaio de azul de tripano. Na extremidade baixa, MOI 1,0 causou a morte celular sobre 40-80%; Considerando que todas as células (100%) foram mortos por 10,0 MOI. O ensaio de MTT mostrou a diminuição dependente da dose correspondente da proliferação celular e sobrevivência de células, e as análises de Western blot confirmou que a Vpr foi produzida nessas células Adv-Vpr-infectadas (Figura 3A-B). Para entender melhor a dinâmica do efeito do vpr na proliferação de células, a proliferação celular e a viabilidade foi medida ao longo do tempo (até 5 dias) com MOI de 2,5. Tal como mostrado na Figura 3B, as células simuladas ou Adv-infectados mostraram a proliferação celular normal e atingiu um patamar ao fim de 3 dias com a proliferação de células pouca ou nenhuma detectada nas células infectadas Adv-Vpr. A atividade metabólica reduzida ao longo do tempo sugerido aumento da morte celular ao longo do tempo. Para avaliar ainda o modo da morte celular induzida por Vpr em células de neuroblastoma (Vpr ou não mata as células por apoptose ou outro mecanismo) potencial efeito de clivagem de caspase-3 foi medida como uma indicação de apoptose. Para distinguir a morte celular induzida por Vpr de seu efeito no ciclo celular, um mutante Vpr (F34I) que faz com que a indução G2, mas não induz a morte celular também foi incluído neste estudo como um controlo [18], [27], [28] . Após a infecção adenoviral, o estado da caspase-3 foi monitorizada a partir de 6 a 36 horas por análise de transferência de Western utilizando anticorpos contra total de caspase-3 (figura 3c, pista superior) ou especificamente clivada da caspase-3 (Figura 3C – faixa do meio). Sem a clivagem de caspase-3 foi detectada nas células Adv-F34I Vpr-infectadas (indicado por “M”) ao longo de todo o período de teste; a clivagem de caspase-3 foi claramente visto a partir de 24-36 horas em células que foram infectadas com o tipo selvagem (indicado por “W”) Vpr.

. Vpr induz a morte celular, dependente da dose em células SK-N-SH fármaco-resistentes e sem tratamento prévio. uma. Nível de morte celular induzida por Vpr foi examinada através da infecção de células SK-N-SH-DOX sem tratamento prévio e resistentes usando aumentando MOI de vírus ou Adv Adv-Vpr. A morte celular foi medida através da determinação da integridade da membrana celular e proliferação utilizando Trypan esforço azul (esquerda) ou a viabilidade celular pelo ensaio de MTT (à direita). Células proliferação e viabilidade foram examinados 5 dias

p.i

. b. produção de proteína Vpr foi confirmada por análise de Western blot. Note-se que é muito difícil de detectar a proteína vpr em baixo MOI. A contaminação de Adv-Vpr foi verificada por meio de núcleos aumentados de células como descrito anteriormente [43]. B. Vpr induz a morte celular ao longo do tempo em droga células SK-N-SH naive e resistentes. Ambas as células SK-N-SH-droga naive e resistentes tratados da mesma forma como A. Apenas MOI2.5 foi utilizado aqui. C. Vpr induz a apoptose em células SK-N-SH-drogas ingénuos e resistente. Caspase-3 clivada foi monitorada até 36 horas. Iniciais: Csp3, caspase-3; CL-Csp3 clivada, caspase-3; m, Adv-VprF34I; w, Adv-Vpr.

Em conjunto, os resultados destes

in vitro

estudos suportam a ideia de que a proliferação de células Vpr blocos neuroblastoma por paragem G2 do ciclo celular e morte celular

via

apoptose. Mais importante, Vpr confere esses efeitos citotóxicos para células de neuroblastoma a um nível comparável independentemente do seu estatuto resistência aos medicamentos.

In vivo

efeito da Vpr no crescimento do tumor neuroblastoma em um sistema modelo de rato

a seguir, examinou o efeito Vpr no crescimento do tumor de células de neuroblastoma no C57-SCID sistema de modelo de rato [29], [30]. Duas abordagens diferentes foram utilizados para introduzir a Vpr em tumores, i.e., pré-transdução virai antes da célula de inoculação em ratinhos ou pós-injecção intratumoral. Para pré-transdução, de tipo selvagem e resistente DOX SK-N-SH foram injetados com Adv, Adv-VprF34I e Adv-Vpr

s.c.

No flanco esquerdo de camundongos C57-SCID. O tamanho do tumor foi medido a cada 7 dias. medição do tamanho final do tumor foi no dia 26 pós-transdução e os ratinhos foram então sacrificados para análise posterior. Como mostrado na Figura 4A, um tamanho médio do tumor de aprox. 2 cm foi claramente visto em ratinhos que foram inoculados com células SK-N-SH ou resistentes WT-DOX 26 dias pós-transdução. Também foram observados os tamanhos de tumor semelhantes em camundongos infectados Ad-F34Ivpr. Em contraste, muito pequenos nódulos no local da injecção foram observadas nos ratos Ad-Vpr-transduzidas, sugerindo expressão de vpr nas células impedido o seu crescimento em ratinhos SCID-C57. Para minimizar a possibilidade de variação de ratinhos individuais, os ratos individuais foram injectados com todas as três vírus transdução

s.c..

Na área abdominal, como mostrado na Figura 4B. Semelhante ao que temos observado em camundongos inoculados com um único tratamento, cerca de igual tamanho dos tumores foram vistos nos locais de Adv ou Adv-F34Ivpr injeções enquanto pouco ou nenhum nódulos foram observadas nos locais de injecções Adv-Vpr.

supressão do crescimento do tumor de neuroblastoma por Vpr é demonstrado aqui, quer por pré-transdução de Adv-Vpr (AB) ou pós-injecção intratumoral (C). Para pré-transdução, tipo selvagem (WT) ou resistente a DOX SK-N-SH foram cultivadas em DMEM suplementado com FBS a 10% a 37 ° C, com um 95% de ar /5% de CO

2 atmosfera. As células frescas foram primeiramente cultivadas numa placa de 12 poços durante 36 horas e transdução adenoviral foi realizada 5 horas antes da inoculação das células com MOI de 2,5, a qual foi determinada empiricamente. As células foram então tratadas com EDTA Trpsin-, re-suspensas em DMEM e lavadas com PBS 3 vezes. células final foi suspensa em DMEM para inoculação. Cerca de 2 × 10

6 células no volume de 100 jil foram injectados

s.c..

No flanco esquerdo de ratinhos SCID-C57. 3-4 ratinhos foram injectados para cada tratamento. Estes grupos de tratamento incluem um controle viral Adv, Adv-Vpr e Adv-F34IVpr. O mutante F34IVpr foi aqui utilizado como um controle uma vez que uma única alteração de aminoácidos do aminoácido 34 a partir da fenilalanina (F) e isoleucina (I) torna Vpr incapaz de causar apoptose (Figura 3C), mas permite que o ciclo da célula de introduzir um G2 prolongada fase [18], [27], [28]. O tamanho do tumor foi medido cada 7 dias por medição de dois diâmetros perpendiculares do tumor, utilizando compassos de calibre. medição final do tumor foi no dia 26 pós-transdução e os ratinhos foram então sacrificados para análise posterior. Para a injecção intra-lesional de Vpr, o WT e células do neuroblastoma SK-N-SH DOX-R foram preparados essencialmente da mesma maneira como descrito acima. 200 ul da Adv, Adv-Vpr ou Adv-F34Ivpr foi em seguida injectada de forma discreta de 3 vezes nos tumores de 2 semanas após a inoculação das células com uma concentração virai de 1012 /mL. O tamanho do tumor foi medido a cada 7 dias. medição final do tamanho do tumor era de 39 dias pós-injecção e, em seguida, os ratinhos foram sacrificados para análise posterior. Três experiências independentes foram realizados e os resultados destas experiências com o tamanho médio do tumor com o desvio padrão (DP) estão apresentadas na Tabela 2.

Uma das potenciais discussões sobre os resultados gerados a partir de pré-transdução é que a expressão de Vpr

in situ

podia matar rapidamente as células SK-N-SH, evitando assim a formação de tumor e, assim, o teste do efeito sobre o crescimento tumoral a Vpr real. Para contornar este problema, foi utilizado um método de injeção de pós-intratumoral alternativa. As células do neuroblastoma SK-N-SH WT e DOX-R foram preparadas e inoculadas essencialmente da mesma maneira como descrito acima. A Adv, Adv-Vpr ou Adv-F34Ivpr foi então injectado discretamente 3 vezes para os tumores de 2 semanas após a inoculação de células. O tamanho do tumor foi medido a cada 7 dias. medição final do tamanho do tumor era de 39 dias pós-injecção e, em seguida, os ratinhos foram sacrificados para análise posterior. Testes estatísticos foram conduzidos para avaliar potenciais diferenças no tamanho do tumor todas as semanas, ou durante todo o período experimental. Os resultados finais são apresentados no Quadro 2. Embora Vpr reduzida de 44,1 ± 11,8% do crescimento tumoral no tipo selvagem tumores SK-N-SH por semana 1 depois da injecção intratumoral, análise estatística mostrou uma

t

– valor de 2,35 (p = 0,10), ou seja, não houve diferença estatística; Do mesmo modo, nenhuma diferença crescimento do tumor foi observada nos tumores Dox-R na semana 1. No entanto, as diferenças estatisticamente significativas foram observadas tanto nos tumores do tipo selvagem e Dox-R por semana 2 semanas e 3. Em particular, nas células de neuroblastoma WT , Vpr reduzida 64,2 ± 6,7% ou 76,4 ± 5,9% do crescimento do tumor por semana 2 ou 3 após injecção intratumoral, respectivamente; Da mesma forma, um por cento de redução comparável (67,1 ± 4,5% ou 75,6 ± 1,8%) foi também detectada nas células DOX-R no mesmo período de tempo. A comparação do crescimento de tumores durante todo o período experimental, utilizando os montantes médios ponderados [31] sugeridas diferenças globais no crescimento do tumor entre os ratinhos tratados com controlo e ad-Vpr injectados ratinhos (p 0,05). Ao contrário, não foram encontradas diferenças estatísticas entre os grupos Ad-F34IVpr controle de anúncios e. Portanto, é claro que a expressão da Vpr em tumores reduziu significativamente o crescimento do tumor e, de facto expressão de Vpr suprime o crescimento do tumor de células de neuroblastoma humano, independentemente do seu estatuto resistente a medicamentos.

Discussão

no presente estudo, foi demonstrado que uma proteína viral da proliferação do VIH-1 Vpr blocos célula, prendendo as células em fase G2 do ciclo celular em vários tipos de células tumorais testadas (Tabela 1; Figura 1). Além disso, o Vpr induz a morte celular em três dessas linhas celulares de cancro independentemente de serem resistentes ou sensíveis a DOX (figura 2). Outras análises do efeito Vpr em células de neuroblastoma indicam que o Vpr induz a morte celular de um modo dependente da dose (Figura 3A-B)

através

apoptose como indicado pela clivagem de caspase-3 (Figura 3C). Usando um modelo de ratinho de neuroblastoma, demonstrámos ainda que a entrega de Vpr

através

entrega adenoviral de tumores de neuroblastoma, quer por pré-infecção (Figura 4A-B) e a injecção intratumoral (Figura 4C), tumor marcadamente inibida crescimento. Assim, os resultados descritos demonstram pela prova-de-conceito que Vpr pode ser um bom candidato para uma investigação mais aprofundada sobre o seu papel na supressão do tumor, especialmente naqueles que são resistentes a drogas anticâncer.

Mesmo que Vpr induz G2 do ciclo celular paragem em todos os tipos de células cancerígenas testadas, verificou-se que o nível de células G2 presos na linha celular de cancro da mama MCF-7 foi muito reduzida (figura 1 – do meio). Não está claro neste momento porque esta linha celular é parcialmente resistente a paragem G2 induzida por Vpr. No entanto, não parece haver uma correlação interessante entre a paragem G2 induzida pelo Vpr e o estado enzimática da proteína fosfatase 2A (PP2A). Como já relatado anteriormente, uma das características únicas de paragem G2 induzida por Vpr é que ele requer a função de PP2A [2], [4], [16], [32]. Pesquisa da literatura indicam que a subunidade reguladora de PP2A ou é significativamente reduzida ou perdida na linha celular MCF-7 [33], [34]. A redução de paragem em G2 em células MCF-7 com suporte a noção de que o Vpr inibe a proliferação celular através da indução da paragem G2 através de um mecanismo mediado por PP2A [4], [32]. Além disso, esta observação sugere que a Vpr pode não ser capaz de bloquear a proliferação celular a paragem G2 em todas as células de tumor, especialmente as células de tumores que contêm mutações relacionadas com a PP2A. Outras investigações dessa noção sem dúvida se justifica especialmente no contexto da utilização de Vpr como um agente anti-cancro.

Vpr induz a morte celular e apoptose por meio de vários mecanismos [para revisões, ver [5], [6]] . Uma vez que a Vpr é capaz de induzir a morte celular e a apoptose em ambas as células de neuroblastoma de DOX sem tratamento prévio e resistentes, uma ou algumas dessas propostas vias Vpr pode ter causado a citotoxicidade observada. Nosso futuro esforços incidirão em testes de qual mecanismo de morte celular induzida pela Vpr poderia superar a resistência apoptótica, uma característica típica de muitas células cancerosas, incluindo neuroblastoma. Com base nos dados mostrados na Figura 3C, é evidente que a Vpr é capaz de provocar a apoptose, tal como indicado pela clivagem de caspase-3. Esta observação é consistente com a nossa caracterização da apoptose induzida por Vpr nas mesmas células de neuroblastoma mostrados usando o ensaio Anexo V [35]. Há, temos ainda demonstrado que a apoptose nas células do neuroblastoma SK-N-SH-Vpr induzida através de um mecanismo dependente de mitocôndrias e caspase-9-mediada [35].

Foi utilizado pré-infecção e intra injecções tumorais no nosso modelo de ratinho para a introdução de Vpr em tumores neuroblastoma. Estes dois métodos foram usados ​​porque expressão de Vpr

in situ

poderia rapidamente matar as células e, assim, evitar ensaios sobre o crescimento tumoral real. Nossos resultados demonstraram ambos os métodos reduziram significativamente o crescimento do tumor após a introdução de Vpr. Comparativamente, as células resistentes a DOX também demonstrou nível semelhante de redução do tamanho do tumor apoiar a premissa de que a expressão Vpr suprime o crescimento do tumor, independentemente do estatuto de resistência de droga.

Vale a pena mencionar que, nas experiências descritas, não o fizemos testar o efeito potencial de vpr em células do neuroblastoma metastático. Nós, no entanto, realizar estudos farmacológicos preliminares para testar efeitos adversos potenciais de camundongos C57-SCID quando eles foram expostos a Vpr através de injecção sistemática de corpo inteiro. Nesses experimentos, um aumento crescente de partículas virais Adv-Vpr que variam de 1 × 10

13-6 × 10

13 de partículas virais foram injetadas em ratos C57-SCID através das veias da cauda. Não há reacções adversas óbvias foram observados nos ratinhos durante todo o período experimental. exames patológicos de diversos órgãos 3 semanas após a injecção virai não demonstrou quaisquer efeitos citotóxicos claros impostas pelo Vpr (dados não mostrados). Portanto, a introdução sistemática de Vpr também poderia ser uma opção para testes futuros.

O conceito de utilização de HIV-1 Vpr como um potencial agente anti-cancerígeno não é nova. De facto, outros estudos iniciais incluindo o nosso sugeriram esta possibilidade [36] e um certo número de estudos demonstraram que a entrega de Vpr para vários tumores, tais como melanoma [37] – [39], de hepatoma [40], [41] e por via oral câncer [42] suprimir o crescimento tumoral

in vivo

. O que é novo, no entanto, é que nós demonstramos pela primeira vez que a Vpr é capaz de suprimir o crescimento do tumor, independentemente se ela é sensível ou resistente a um fármaco anti-cancro por meio da indução da paragem G2 do ciclo celular e apoptose. Esta conclusão poderia potencialmente ser significativa porque a destruição de células cancerosas resistentes a drogas faz com que seja um agente anti-cancro e nova alternativa potencial e poderosa. Este tipo de agente anti-cancro pode tornar-se particularmente útil como um agente terapêutico suplementar viral para a inibição selectiva do crescimento do tumor, especialmente quando outras terapias falham.

Materiais e Métodos

linhas de células e cultura

várias linhas de células de cancro humano que representam diferentes tipos de cancro, com ou sem resistência a drogas para a doxorrubicina anticancerígeno fármaco (DOX) são utilizados no presente estudo e resumidos na Tabela 1. a não ser que especificamente indicado, estas linhas de células foram cultivadas em Dulbecco Modificado meio de eagle (DMEM) (Cellgro) ou meio RPMI 1640 (Sigma) suplementado com soro fetal bovino a 10% (FBS, Invitrogen). A incubação foi a 37 ° C em uma CO 5%

2 incubadora.

infecção por adenovírus

vector adenoviral (Adv) e vector adenoviral inserido com o

vpr

gene (Adv-Vpr) foram gentilmente cedidas pelo Dr. LJ Zhao [17]. Cerca de 1 × 10

6 das células de teste foram infectadas com o vírus Adv ou Adv-Vpr. Quarenta e oito horas

p.i.

, As células foram colhidas para análise do ciclo celular ou a análise de Western blot. As infecções foram realizadas a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 1,0 para as análises do ciclo celular, como mostrado na Tabela 1 e Fig. 1. MOI de 2,5 foi utilizado para análises de morte celular inicial como mostrado na Fig. 2. Sob esta condição de transdução adenoviral, maior do que 90% de eficiência de infecção foi obtida com estes stocks virais (dados não mostrados).

ciclo celular análise

As células foram colhidas 48 horas