Abstract

Apesar de muitas evidências que apoiam o conceito de “vício oncogene” e muitas hipóteses racionalizá-lo, há ainda é uma falta de compreensão detalhada para o mecanismo molecular subjacente vício oncogene preciso. Neste relato, foi desenvolvido um modelo matemático do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) rede de sinalização associados, que envolve a proliferação EGFR-condução /pró-sobrevivência vias Ras /extracelular-sinal regulada quinase (ERK) e fosfoinositol-3-quinase (sinalização PI3K) /AKT, e pró-apoptótica sinalização da via apoptose quinase-regulação do sinal 1 (ASK1) /p38. Na configuração da activação do EGFR sustentada, os resultados da simulação mostram um elevado nível de proliferação persistente /efectores pró-fosfo-ERK de sobrevivência e fosfo-AKT, e um nível basal de pró-apoptótica efectora fosfo-p38. O potencial de ativação do p38 (potencial de apoptose), devido ao nível elevado de espécies reactivas de oxigénio (ROS) é em grande parte suprimida pelo crosstalk negativa entre PI3K /AKT e ASK1 vias /p38. Após inactivação EGFR aguda, a sinais de sobrevivência deterioração rápida, seguida por um aumento rápido do sinal apoptótico devido à libertação de potencial apoptótica. No geral, nossa modelagem biologia de sistemas em conjunto com validações experimentais revela que a inibição de sinais de sobrevivência e libertação concomitante do potencial apoptótica contribuir conjuntamente para a morte de células tumorais após a inibição da oncogene viciado em EGFR viciado cancros

Citation:. Zhou JP , Chen X, Feng S, Luo SD, Pan YL, Zhong L, et al. (2011) Biologia de Sistemas Modelagem revela um possível mecanismo da morte celular do tumor mediante Oncogene Inactivação em EGFR Cancros viciado. PLoS ONE 6 (12): e28930. doi: 10.1371 /journal.pone.0028930

editor: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, China

Recebido: 20 de junho de 2011; Aceito: 17 de novembro de 2011; Publicação: 14 de dezembro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Zhou et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (20872100, https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default124.htm) ea Fundação da Juventude da Província de Sichuan (08ZQ026-030, http: //www.qnjj .sc.cn /). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o conceito de “dependência oncogene” foi primeiramente levantada por Weinstein com base nos fenómenos peculiares que a proliferação e a sobrevivência de alguns cancros dependem fortemente apenas uma proteína oncogénica ou via, apesar da presença de múltiplas mutações dos genes e epigenética anormalidades [1] – [3]. Agora, uma grande quantidade de provas têm sido encontrados para suportar este conceito, incluindo aqueles a partir de modelos de rato geneticamente modificados [4], [5], estudos mecanísticos em linhas celulares de cancro humano, [6], [7], e em particular a boa eficácia terapêutica clínica de uma série de anticorpos ou drogas moleculares pequenos que alvejar proteínas específicas em cancros humanos relatados nos últimos anos [8] – [10]. Atualmente, várias hipóteses têm sido propostas para explicar o fenômeno da dependência de oncogene, incluindo racionalização genética [11], [12], a letalidade sintética [13], amnésia oncogênico [14], e choque oncogênico [15], [16]. Estas hipóteses dão várias explicações a partir de ângulos diferentes para o fenômeno da dependência oncogene. Mesmo assim, ainda há uma falta de compreensão detalhada para o mecanismo preciso subjacente à dependência oncogene. Em particular, a base molecular de alguns fenómenos essencial relacionado com a dependência oncogene se sabe, por exemplo, o fenómeno que a inactivação do oncogene aguda leva à morte das células tumorais em que o oncogene viciado cancros, enquanto poupando outras células que não são viciadas semelhante.

tem sido sugerido que a anormalidade de circuitos intracelular (sinal de rede transdução) ou “esquema de ligação” é a razão mais fundamental que explica o fenômeno da dependência oncogene [2], [17]. A complexidade do circuito intracelular em conjunto com mutações genéticas múltiplas em células de cancro dificulta a compreensão da base molecular subjacente vício oncogene [18], [19]. A situação agora mudou um pouco devido a recentes avanços na biologia de sistemas [20] – [22], particularmente a biologia de sistemas computacional [23], [24]. Assim, está atualmente em uma boa posição para aplicar estas tecnologias para revelar possíveis mecanismos moleculares vários fenômenos subjacente associado com o vício oncogene.

Como o primeiro trabalho de compreender o vício oncogene do ponto de vista da biologia de sistemas, na neste estudo, foi desenvolvido um modelo matemático do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) -associated rede de sinalização para investigar possível mecanismo molecular da morte de células tumorais a seguir à inibição de oncogene viciado. Aqui nós escolhemos a rede associado ao EGFR sinalização principalmente devido às seguintes razões: (1) EGFR é um dos oncogenes mais importantes e implicadas em muitos tipos de tumores humanos, em particular, os cancros do pulmão, cabeça e pescoço tumores [25], [ ,,,0],26]; (2) a rede de sinalização de EGFR tem sido amplamente estudada experimentalmente e, teoricamente, [27] – [30], o que implica que muitos parâmetros estão disponíveis na literatura que facilita o desenvolvimento do modelo. Este modelo foi validado em primeiro lugar, e, em seguida, utilizado para simular o estado normal das células cancerosas e respostas da rede mediante a inibição EGFR aguda.

Resultados

Criação do modelo matemático da rede de sinalização associado ao EGFR

Nós aqui apresentar uma equação diferencial ordinária (ODE) baseado no modelo matemático da rede de sinalização associado ao EGFR, que envolve a proliferação EGFR-condução /pró-sobrevivência vias Ras /extracelular-sinal regulada quinase (ERK) e fosfoinositol sinalização -3-quinase (PI3K) /AKT, e pró-apoptótica sinalização da via apoptose quinase-regulação do sinal 1 (ASK1) /p38. As porções de Ras /ERK e PI3K /AKT neste modelo foram estabelecidas com base no conhecido Ras /ERK e modelos /AKT de PI3K, incluindo, tais como Brightman [31], Birtwistle [30], Schoeberl [29], e Oda [32 ] modelos. Para conhecimento dos autores, no entanto, não existe um modelo matemático de p38 mediada via de sinalização pró-apoptótica ainda relatado na literatura. Nós, portanto, construiu um modelo de sinalização de p38 e incorporou-o na rede de sinalização EGFR. O modelo compreende 243 equações e interacções com 160 espécies moleculares distintas, caracterizadas por 145 parâmetros cinéticos e 28 concentrações diferentes de zero moleculares iniciais. A maioria dos parâmetros cinéticos e concentrações moleculares iniciais neste modelo foram tomadas a partir da literatura ou derivado a partir de quantidades físico-químicas básicas [29], [30], [33]. Outros foram estimados por saídas do modelo de ajuste aos dados experimentais conhecidos com o uso do algoritmo de modelagem conjunto quasi híbrido proposto por nós recentemente [34]. As principais reacções e os parâmetros são apresentados na Tabela S1, e as concentrações iniciais moleculares da Tabela S2 (ver Informação de Apoio). As vias de sinalização importantes e principais componentes envolvidos no nosso modelo de rede estão mostrados na Figura 1. Uma breve descrição para esta rede associado ao EGFR é dado como se segue.

As linhas a cheio com setas indicam a activação de proteínas ou de lípidos. As linhas pontilhadas representam proteína-proteína direto e interações proteína-lipídica. As linhas a cheio com extremos cerses representam inibição.

No estado normal, a sinalização de rede é iniciada pela ligação do factor de crescimento epidérmico (EGF) para o EGFR, seguida pela dimerização e subsequente trans-fosforilação em mútuo vários resíduos de tirosina do EGFR; embora família de EGFR tem outros três membros incluindo ErbB2, ErbB3, ErbB4 e em adição ao EGFR (ErbB1), que pode formar dímeros diferente (qualquer um homo- ou hetero-dímeros) [30], [35], apenas EGFR e EGFR homo-EGFR -dimers são considerados neste modelo de simplificação. Estes resíduos fosfo-tirosina actuam como locais de ancoragem que permitem que os receptores para recrutar proteínas adaptadoras Shc e Grb2 [36], que pode, em seguida recrutar o factor de troca do nucleótido guanosina SOS. SOS promove a substituição do PIB até GTP em Ras, ativando Ras [37]. A Ras activada subsequentemente resulta na activação da proteína cinase Raf [38]; uma vez que o ativador direto de Raf quinase ainda não é conhecida, assumimos que Raf fosforilação é causada diretamente por uma molécula de Ras-GTP neste modelo. O Raf activado, finalmente, activa a cinase de proteína activada por mitogénio kinase1 /2 (MEK) e ERK de um modo em cascata [39]. A ERK activada pode fosforilar a proteína SOS a montante, portanto, causando a dissociação de Grb2-SOS a partir do complexo do receptor, o qual forma um circuito fechado de realimentação negativa [40]. Além disso, Grb2 em cytomembrane também pode recrutar Gab1, o que faz com que a fosforilação de Gab1 e ​​a consequente recrutamento de PI3K [41]. Em cytomembrane, PI3K transforma fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP2) em fosfatidilinositol (3,4,5) -trisphosphate (PIP3), que induz a activação de AKT através cooperando com proteína dependente de 3-fosfoinositida cinase-1 (PDK1) [42 ]. Neste processo, a fosfatase e tensina homólogo (PTEN) e a proteína fosfatase 2A (PP2A) pode especificamente desfosforilar PIP3 e AKT, respectivamente [43]. Fosforilada Raf, MEK e ERK pode ser desfosforilado pela suas fosfatases específicas [30]

P38 que é pensado como um importante efectora pró-apoptótico pode ser activada por uma variedade de stresses ambientais e citoquinas inflamatórias [44]. – [46]. Entre os quais, de particular importância é o estresse devido a espécies reativas de oxigênio (ROS). Por exemplo, Dolado et ai. relataram que o oncogénica induzida por H-Ras ROS desempenha um papel importante na inibição da iniciação do tumor através da activação de p38 e, por conseguinte, resultando em apoptose em fibroblastos derivados de embriões de rato [47]. Além disso numerosos estudos demonstraram que a estimulação das células cancerosas humanas com resultados EGF em um aumento na concentração intracelular de ROS [48] – [50]. Jin e seus colegas ainda detectada a taxa de geração de ROS induzidas por estimulação por EGF em A431 [50]. Assim, ROS está envolvido em nosso modelo como um importante componente a montante da via de sinalização p38. ROS desencadeia a activação de ASK1, que, em seguida, induz a fosforilação de MAP quinase kinase3 /6 (MKK) e p38 num estilo em cascata [51]. fosfatases específicas de ASK1, MKK e p38 estão também incluídos neste modelo. Além disso, foi estabelecido que a AKT activados podem suprimir a activação de p38 por meio de fosforilação ASK1, que forma uma interferência negativa entre PI3K /AKT e vias de sinalização /p38 ASK1. Por exemplo, Zhang et al. relataram que a AKT pode fosforilar ASK1 no local Ser83 para inibir a activação de sinalização induzida por peróxido de hidrogénio ASK1 /p38 em células endoteliais [52]. Yuan e seus colegas também provou que a AKT pode inibir a activação de p38 induzida pela cisplatina por meio de fosforilação de ASK1 [53]. Por conseguinte, o crosstalk AKT-ASK1 entre PI3K /AKT e vias de sinalização /p38 ASK1 também está envolvido em nosso modelo.

A validação do modelo

O modelo estabelecido foi validado através do cálculo dos campos de tempo de vários activação espécies-chave, incluindo Ras, ERK, AKT e p38 após uma estimulação EGF curto e comparar os resultados de simulação com outros estudos experimentais ou de simulação publicados sobre sinalização de EGFR. A Figura 2 mostra os padrões de curso de tempo simulados de Ras, ERK, Akt e p38 activação exposição a EGF com concentrações variadas ao longo de 60 minutos. Após a adição de EGF em t = 0, as concentrações totais de Ras-GTP, fosfo-ERK (p-ERK) e fosfo-AKT (p-AKT) aumenta rapidamente até um máximo no prazo de 5 minutos com os seus picos, dependendo da concentração de EGF , seguido por decomposição dos seus níveis basais dentro de 50 minutos. Enquanto isso, um aumento retardada de fosfo-p38 (p-p38), que é um pico aos 15 minutos, observa-se. Estes são consistentes com os resultados experimentais anteriores. Por exemplo, a estimulação EGF de células PC12 resultados em uma rápida ativação, transitória de Ras e ERK [27]. O nível de Ras-GTP rapidamente atinge um máximo dentro de 2 minutos a exposição a EGF, mas diminui dentro de 10 minutos e, gradualmente, retorna aos níveis basais dentro de 60 minutos. Do mesmo modo, a activação de ERK é máxima em menos de 5 minutos, e decai para menos de 50% do nível máximo, em 30 minutos, e menos do que 25% dentro de 60 minutos. As activações transientes de ERK e p38 após a estimulação EGF foi também observada em células endoteliais dos capilares da retina [54]. Após uma exposição de cinco minutos das células endoteliais dos capilares da retina de EGF, ERK atinge um nível máximo de fosforilação que é 20 vezes maior do que a do seu controlo. Durante as 2 horas subsequentes, a activação de ERK decai até atingir uma linha de base. Para p-p38, aumenta a um nível quase três vezes em relação ao seu controlo após 15 minutos, seguido por um declínio para o seu nível de controlo.

variação da concentração de (A) ERK activo (fosfo-ERK), (B ) AKT ativa (fosfo-AKT), (C) activa Ras (Ras-GTP) e (D) p38 activo (fosfo-p38) com a estimulação transitória por EGF em diferentes concentrações.

Simulação de ativação sustentada de EGFR

em seguida, simular a activação de EGFR sustentada em células cancerosas EGFR viciadas. Para este efeito, as reacções de internalização do receptor foram removidos a partir do modelo, e a concentração de EGF foi definida como um valor fixo. A Figura 3 apresenta os períodos de ERK, Akt e p38 activação. Claramente, a activação do EGFR sustentada finalmente resulta num elevado nível estável de p-ERK e p-AKT depois de um aumento rápido no início. No entanto, a activação de p38 ainda mantém no seu nível basal, embora um pequeno pico detectável de p-p38 dentro dos primeiros 5 minutos. Em geral, a activação sustentada do EGFR leva a um resultado final de alto nível persistente de p-ERK e p-AKT, mas um nível baixo de p-p38. Isto é consistente com os resultados experimentais em EGFR células cancerosas dependentes de que a ERK e AKT manter em um alto nível de ativação e do p38 mantém em um baixo nível de ativação [16].

mudanças de concentração de (A) ativa ERK (fosfo-ERK), (B) AKT activo (fosfo-AKT) e (C) activo p38 (fosfo-p38) após estimulação sustentada do EGFR em diferentes níveis.

Simulação da rede resposta sobre inativação EGFR aguda em EGFR viciado células cancerosas

Temos apenas simulou o estado normal das células cancerosas EGFR viciado, ou seja, um cenário de activação de EGFR sustentado. Nesta seção, vamos simular a resposta da rede mediante inactivação EGFR aguda, que imita a situação da utilização dos inibidores de EGFR em células cancerosas EGFR viciadas. Nesta simulação, a inactivação do EGFR aguda foi realizada por meio de um acontecimento de pré-atribuído a um ponto de tempo fixo, ou seja, a actividade de EGFR foi ajustada para o seu nível basal. As alterações na concentração de ERK activada, AKT e p38 após a inibição do EGFR aguda são mostrados na Figura 4. Obviamente, a inactivação do EGFR aguda leva a um declínio imediato da concentração de p-ERK e p-AKT, e um aumento retardada de P- p38. O poço de simulação reproduziu os fenômenos experimentais que a inactivação aguda do EGFR resultados oncogene em uma diminuição rápida das efetores proliferação celular /pró-sobrevivência p-ERK e p-AKT, e envolvimento posterior do efetoras pró-apoptótica p-p38 em EGFR viciado células de câncer [16], [55].

Perfil de mudanças de concentração de (A) ERK ativa (fosfo-ERK), (B) AKT ativa (fosfo-AKT) e (C) p38 ativo (fosfo -p38). O evento virtual de inibição de EGFR foi realizada no tempo 0 h.

A análise de sensibilidade revela fatores críticos responsáveis ​​pela ativação do p38

A análise de sensibilidade tem sido muito utilizado em biologia de sistemas para estudar como variação do valor da saída simulada de um modelo matemático podem ser repartidos por diferentes fontes de variação na entrada de um modelo, que podem ser utilizadas para identificar proteínas críticas que dominam a produção de uma proteína efectora [29]. Aqui p-ERK, p-p-AKT e p38 foram tomadas como as variáveis ​​de saída para a análise de sensibilidade. A Figura 5 apresenta a sensibilidade integrada no tempo normalizado para espécies com valores diferentes de zero no modelo de rede de sinalização de EGFR. Obviamente, os nós mais sensíveis para a activação de ERK e MEK são Raf para além da ERK incurious e EGF; ERK e EGF são as soluções trivial uma vez que ERK é o precursor directo de p-ERK, e EGF é o iniciador da resposta da rede (para simplicidade, esses nós sensíveis incurious será ignorado mais tarde). Para a ativação do AKT, os nós mais sensíveis incluem Grb2, PIP2, Gab1, PI3K, PDK1, SOS, e PTEN. E aqueles para a ativação de p38 incluem principalmente ASK1, MKK, RacGDP, PP2A, AKT, PDK1 e SOS.

normalizados sensibilidades integradas no tempo de ERK, AKT e fosforilação p38 (p-ERK, p-AKT, e p-p38) para cada espécie diferente de zero no modelo de rede associado ao EGFR.

a análise de sensibilidade acima revela os reguladores críticos na rede para o effectors de sobrevivência p-ERK e p-AKT, e pró-apoptótica efectora p-p38. Observou-se também que os maiores valores positivos e negativos de sensibilidade correspondem todas a variável de saída p-p38. Por exemplo, AKT que tem o maior valor negativo de sensibilidade para o efector pró-apoptótica p-p38 pode desempenhar um papel importante na regulação negativa da apoptose celular. ASK1, MKK e RacGDP, que todos são os principais componentes de ROS /ASK1 /MKK /p38 cascata de sinalização, têm os maiores valores positivos de sensibilidade, o que implica um papel positivo fundamental de sinalização associada ROS na apoptose celular. Estes resultados também podem ser relacionados com a sensibilidade das células tumorais aos efeitos letais de drogas-alvo. Para testar esta hipótese, nós mudamos a rede original, removendo tanto o crosstalk AKT-ASK1 ou ROS, e então re-simularam as respostas rede, nas configurações de activação de EGFR sustentado e inativação EGFR aguda. Figura 6A apresenta os resultados da simulação ao remover o crosstalk AKT-ASK1. Obviamente, os níveis elevados de P-ERK e p-AKT na configuração da activação do EGFR sustentada e uma rápida queda sobre a inibição do EGFR aguda (ver Figura 6A) foram observadas, que são muito semelhantes aos resultados obtidos na modelagem da rede original. No entanto, após a remoção da diafonia AKT-ASK1, p-p38 mantém num nível elevado no caso de qualquer activação do EGFR sustentada ou inibição de EGFR aguda, o que implica uma capacidade de apoptose mais forte. Figura 6B apresenta os resultados de modelagem ao remover ROS. Similar ao caso em que a remoção de AKT-ASK1, ainda monitorizada níveis elevados de P-ERK e p-AKT na configuração da activação do EGFR sustentada e uma rápida queda sobre a inibição do EGFR aguda. No entanto, a remoção de ROS resultou num baixo nível de p-p38 no caso de qualquer um de activação ou inactivação de EGFR sustentada EGFR aguda. Estes dados mostram que a remoção de ROS conduz à perda da capacidade por apoptose.

O evento virtual de inibição de EGFR foi realizada no tempo 0 h. (A) Os efeitos da remoção de diafonia AKT-ASK1 sobre as alterações de concentração de p-ERK, p-AKT e p-P38. (B) Os efeitos da remoção ROS sobre as mudanças de concentração de p-ERK, p-AKT e p-P38.

Em conjunto, os resultados da simulação aqui obtidos sugerem que há um potencial mais forte apoptótica existente no estado normal de células cancerígenas, que é suprimida pela diafonia negativo AKT-ASK1 entre PI3K /AKT e vias de sinalização /p38 ASK1. A libertação do potencial apoptótico devido ao desaparecimento da diafonia negativo AKT-ASK1 sobre a inactivação de EGFR poderia ser um factor importante que causa a morte celular, em adição à inibição da proliferação /pró-sobrevivência de sinalização. Em particular, a rápida libertação do potencial apoptótica acumulada poderia ser uma das principais razões que leva à sensibilidade das células tumorais aos efeitos letais de drogas que alvejam o oncogene viciado.

evidências experimentais para a existência de ROS e apoptose potencial em células de câncer de EGFR-viciado

o modelo descrito acima é um pouco artificial, que pode não corresponder estreitamente com o EGFR real viciado células cancerosas. Portanto, nós também realizaram uma série de experimentos para examinar várias questões-chave relacionadas com a nossa modelagem. Dois cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) linhas celulares HCC827 e NCI-H460 (H460) foram selecionados para os experimentos; HCC827 EGFR é uma linha celular de cancro viciado típico, e H460 não é viciada EGFR, o que é para comparação. O primeiro experimento foi concebido para investigar os níveis de ROS nas duas linhagens de células NSCLC. O nível intracelular de ROS foi exibida por 2 ‘, 7’-diacetato dichlorodihydrofluorescein (DCFH-DA) [56], uma sonda molecular responsivo ROS, e visualizados utilizando um microscópio invertido de fluorescência. Como mostrado na Figura 7, um nível muito elevado de ROS foi detectada nas células HCC827 viciado-EGFR, enquanto que ROS dificilmente poderia ser percebida em células H460. Esta constatação reflete um fato que HCC827 sofre um grande estresse ROS, ou em outras palavras, HCC827 carrega um potencial de apoptose mais forte. Mesmo assim HCC827 ainda mantém capacidade de proliferação vigorosa, sugerindo que o potencial de apoptose é bem suprimida.

Os sinais da sonda ROS, bem como a localização nuclear DAPI em HCC827 e H460 foram apresentados isoladamente ou fundidos (Merge).

análise de mancha ocidental Subsequentemente e citometria de fluxo (FCM) ensaios foram utilizados para investigar se a activação de p38, assim como a apoptose de células cancerosas pode ser acionado por meio de inibição de AKT. Nós tratada HCC827 e H460 células com vortmanina 1 PM; wortmanina é um inibidor de PI3K /AKT. Como mostrado na Figura 8A, o tratamento com wortmanina de HCC827 células pode causar a inibição quase completa da AKT e acumulação grande de p-p38 dentro de 4 horas de tratamento. Para células H460, o tratamento com wortmanina também pode causar a inibição quase completa da AKT, mas muito pequena acumulação de p-p38 sem alterar o nível intracelular de ROS (Figura S1). Os resultados dos ensaios de FCM (Figura 8B) mostram que o tratamento com wortmanina pode resultar em aumentos de taxas de apoptose tanto em células HCC827 e H460. Na comparação com o H460, HCC827 células exibiram muito mais apoptose depois de 10? M vortmanina tratamento. Estas experiências demonstram que a inactivação de sobrevivência efectora p-AKT leva à rápida libertação do potencial apoptótico acumulado em células cancerosas viciado-EGFR, o que pode ser uma razão importante que leva à sensibilidade das células tumorais a drogas que têm como alvo EGFR oncogene viciado .

(a) Immunoblotting com os anticorpos indicados para mostrar a fosforilação de AKT e p38 em HCC827 e células H460 tratadas com 1 vortmanina? M (WM). (B) A apoptose de células H460 HCC827 e com ou sem tratamento de 10 uM wortmanina (WM) durante 24 horas. As taxas de apoptose são dados como percentagens.

Uma vez que temos demonstrado a existência de potencial de apoptose devido ao estresse ROS em células cancerosas viciado-EGFR, postulamos, ainda, que as servidões de ROS estresse pode dessensibilizar o câncer células para o tratamento alvo. Para testar esta hipótese, foram tratadas células com HCC827 vitamina C, um antioxidante que pode ser usado para atenuar parcialmente a tensão de ROS. Em seguida, FCM e Western blot foram realizados para testar a exposição a apoptose das células para o inibidor de EGFR gefitinib. Como mostrado na Figura 9A, a vitamina C pode diminuir a apoptose de células tratadas por HCC827 gefitinib em comparação com o controlo em que não foi utilizado nenhum vitamina C. Figura 9B apresenta os resultados de ensaios de western blot, que mostram que a mitigação de ROS, na verdade reduziu o nível de p-p38 em HCC827 células tratadas por gefitinib. Ao mesmo tempo, nós também notou que a redução da ROS diminuiu os níveis de p-ERK e p-AKT também. Uma possível explicação pode ser que as ROS stress pode promover a proliferação /sobrevivência, além de induzir a apoptose [57] – [59], por conseguinte, a atenuação de ROS consequentemente conduz a uma diminuição de p-ERK e p-AKT. Nós reconhecemos que este não obter a reflexão dos nossos resultados de modelagem desde o nosso modelo matemático ignorou a sinalização de ROS a ERK /AKT, que não é conhecido no momento. Além disso, um ensaio de MTT foi realizado para testar a viabilidade de células HCC827. O resultado mostra que a vitamina C pode diminuir a citotoxicidade de gefitinib em HCC827 células (Figura 9c). Estes resultados sugerem que a sensibilidade do HCC827 células ao gefitinib inibidor EGFR é reduzida devido à mitigação do potencial apoptótica.

HCC827 células foram tratadas com vitamina C (VC), gefitinib (GEF), ou a sua combinação (GEF + VC). (A) A citometria de fluxo detectar a apoptose de células em cada HCC827 tratamento durante 24 horas. As taxas de apoptose de tratamentos são dados como percentagens. (B) de imunotransferência com anticorpos indicados para mostrar a fosforilação de ERK, Akt e p38 em HCC827 células tratadas por agentes indicados. 1 PM gefitinib, foram utilizados 1? M de vitamina C ou sua combinação. (C) A viabilidade celular das células HCC827 exposição aos agentes indicados medidos por MTT. 1 nM gefitinib, foram utilizados 10 nM vitamina C ou sua combinação.

Discussão

O conceito de “vício oncogene” foi agora aceite por mais e mais pesquisadores através da última década . No entanto, o mecanismo subjacente à dependência oncogene está longe de ser compreendido. Nesta investigação, foi desenvolvido um modelo matemático da rede de sinalização associado ao EGFR. Nós reconhecemos que o modelo de rede estabelecida não inclui todas as vias e componentes que regulam a sobrevivência e a apoptose das células cancerosas de sinalização; estabelecimento de um modelo de rede completa é impraticável na presente. De outro ponto de vista, ignorando outras vias de sinalização alternativas podem dar um golpe de sorte sorte que o modelo estabelecido mais fecha para o estado EGFR viciado.

Simulações com o modelo de rede associado ao EGFR validado juntamente com a validação experimental revelam a existência de potencial apoptótica. O potencial de apoptose pode ser induzida por vários stresses, tipicamente, por exemplo, ROS. As células cancerosas muitas vezes mostram níveis de ROS intracelular [60], [61] aumentou. Muitos fatores podem contribuir para a geração de ROS [61]. A ativação do EGFR oncogene pode trazer na geração de ROS através da ativação sequencial de PI3K, Rac e NADPH oxidase [48]. Além disso, a hipoxia-reperfusão no microambiente do tumor pode levar à produção de ROS, que por sua vez pode dar início a um ciclo vicioso de dano mitocondrial e ainda a produção de ROS [62]. Em células normais, o ROS poderia ser aliviada por envolver a glicólise e para baixo-regulação da função mitocondrial [63]. As células cancerosas geralmente têm deficiência no sistema de redução de ROS devido a alterações genéticas, que dificultam a depuração de ROS [61]. A acumulação de ROS geralmente resulta na apoptose através da activação sequencial ROS /ASK1 /p38 [47], [64]. No entanto, a activação de p38 efectora pró-apoptótico é inibida por interferência negativa AKT-ASK1 em células cancerosas [52], [65]. Uma vez que a mitigação da interferência negativa AKT-ASK1, através, por exemplo, inativação de AKT, o potencial de apoptose pode ser liberada, a apoptose, portanto, induzir células [53].

A rápida liberação do potencial apoptótica acumulada com a inibição oncogene é uma razão importante que leva à sensibilidade das células tumorais aos efeitos letais de drogas que têm como alvo o oncogene viciado, que é a marca mais importante da dependência do oncogene. No entanto, isso não significa que o resultado global apoptose em resposta ao oncogene inactivação é contribuiu apenas pela potencial apoptótica. Tem sido reconhecido que o EGFR pode produzir resultados pró-apoptótica através de activar algumas vias efectoras a jusante que têm sido associadas aos resultados pró-apoptóticos. Por exemplo, o EGFR pode ligar-se directamente para o assim chamado “ligando de morte” do FAS /CD95 [66], por conseguinte, levando a resultados apoptótica. Os Ras a jusante pode ser pró-apoptótica através de uma interação com o alvo efetoras Nore1 [67].

Os resultados deste estudo pode também ter implicações clínicas em terapias direcionadas, bem como no desenvolvimento de drogas anti-câncer. Por exemplo, uso exclusivo de inibidor de ERK ou AKT não pode trazer um bom efeito terapêutico até mesmo para pacientes com cancros viciado-EGFR. Faber et ai. [68] demonstraram que PI3K inibição /AKT não promoveu apoptose substancial no EGFR viciado cancros. No entanto, bloqueando tanto da via PI3K /AKT e Ras /MEK simultaneamente levado a apoptose para níveis semelhantes como os inibidores de EGFR. Além disso, a utilização de agentes que beneficiam o crescimento do potencial apoptótico pode aumentar ainda mais a sensibilidade das células tumorais a drogas-alvo. Por exemplo, tem sido relatado que os agentes de geração de ROS têm efeitos morte selectiva em cancros segmentados-resistentes terapia [69], [70]. Por outro lado, agentes que podem ajudar a reduzir o potencial de apoptose podem reduzir a sensibilidade de células tumorais para os inibidores de EGFR [59], que devem ser evitados para usar clinicamente. Finalmente, este estudo também sugere que um bom alvo anti-cancro deverá ter um carácter que a sua inibição funcional deve beneficiar a libertação de potencial apoptose acumulado em células cancerosas, em adição ao bloqueio de sobrevivência.

Em resumo, a modelagem de sistemas de biologia revela que há uma apoptótica forte potencial existente nos cânceres de EGFR-viciados, que é largamente reprimidas pela interferência negativa entre PI3K /AKT e as vias /sinalização p38 ASK1. A inibição de sinais de sobrevivência e libertação concomitante do potencial apoptótica acumulada contribuir conjuntamente para a morte de células tumorais após a inibição da oncogene viciado em EGFR viciado cancros. No geral, esta é a primeira tentativa de compreender “vício oncogene” do ponto de vista dos sistemas de biologia. Mais insights sobre os mecanismos subjacentes à dependência oncogene do ponto de vista dos sistemas de biologia ainda estão fortemente necessário. Quaisquer avanços neste campo acabaria por beneficiar a terapia do cancro alvo, bem como o desenvolvimento de drogas anti-câncer.

Materiais e Métodos

Modelo de Desenvolvimento

O modelo de rede foi desenvolvido com o auxílio de Matlab (The MathWorks, MA, EUA, https://www.mathworks.com). As informações para todas as vias de sinalização e topologia da rede foi recolhida a partir de vários trabalhos publicados. interacções moleculares no modelo foram descritos por um conjunto de equações diferenciais ordinárias acopladas, que foram obtidos com base na lei de ação das massas.