Sumário

expressão aberrante de caderinas e cateninas desempenha um papel central no desenvolvimento de cancro do ovário e progressão. Placoglobina (PG, γ-catenina) é um parálogo de β-catenina com funções de sinalização e adesiva dupla. Enquanto β-catenina tem conhecido função oncogénica, PG geralmente actua como um supressor de tumor /metástase. Recentemente, mostrou que PG interagiu com p53 e que a sua função de inibidor do crescimento /metástase pode ser mediada por esta interacção. Muito pouco se sabe sobre o papel do PG no câncer de ovário. Aqui, nós investigamos o

in vitro

tumor /efeitos supressores de metástase de PG em linhas celulares de cancro do ovário com a expressão da p53 mutante e os diferentes perfis caderina. Nós mostramos que a N-caderina expressar e E-caderina e PG-2 ES células deficientes eram altamente migradores e invasivo, enquanto OV-90 células que expressam caderina-E, PG e muito pouca /nenhuma N-caderina não foram. expressão exógena de PG ou E-caderina ou knockdown N-caderina no ES-2 células (ES-2-E-cad, ES-2-PG e ES-2-SHN-cad) reduziu significativamente a sua migração e invasão. Além disso, a expressão PG ou knockdown N-caderina diminuiu significativamente ES-2 de crescimento de células. Além disso, PG interagiu com ambas as caderinas e com o tipo selvagem e mutante p53 em linhagens de células-PG ES-2 normais de ovário e, respectivamente

Citation:. Alaee M, Danesh G, Pasdar M (2016) placoglobina Reduz o

in vitro

crescimento, migração e invasão das células do cancro do ovário que expressam N-caderina e p53 mutante. PLoS ONE 11 (5): e0154323. doi: 10.1371 /journal.pone.0154323

editor: Zhiqian Zhang, Pequim Hospital Institute, CHINA

Recebido: 09 de dezembro de 2015; Aceito: 12 de abril de 2016; Publicado em: 04 de maio de 2016

Direitos de autor: © 2016 Alaee et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela Fundação canadense do Câncer da mama, Pradarias /TNM (MP, operacional); Fundação Alberta Câncer (MA, comunhão de pós-graduação); Women Instituto de Pesquisa de Saúde da Criança (GD, studentship Verão)

Conflito de interesses:. Os autores declaram não haver interesses concorrentes

Introdução

O câncer de ovário (OVCA), o quinto mais prevalente. câncer em mulheres é a principal causa de todas as mortes de mulheres com câncer reprodutiva em todo o mundo, com uma taxa global de sobrevivência de cinco anos de ~ 45% [1]. A principal forma de OVCA é o cancro epitelial do ovário (EOC), que responde por 80% ~ de todos os neoplasmas do ovário [2]. EOCs são classificados em tipo I e tipo II [3]. Tipo I tumores são geneticamente estáveis ​​crescimento, lento, e têm relativamente boa evolução clínica. No entanto, a maioria dos OVCA são do tipo II. Mais de 90% destes tumores p53 abrigar mutações, são geneticamente instáveis, altamente agressivo e ter mau resultado clínico [4-6].

TP53

mutações são acreditados para ser um evento precoce durante o desenvolvimento de tumores do tipo II e contribuir tanto para a progressão metastático e quimiorresistência [7-12]. p53 é um factor de transcrição supressor de tumores e que desempenha um papel essencial na regulação da proliferação celular, sobrevivência, senescência, apoptose e metabolismo [13]. Em resposta ao estresse, p53 ativa DNA danos resposta, a parada do ciclo celular e morte celular [14,15]. Diferentes modificações pós-tradução e interacções proteína-proteína e regulam a estabilidade funções de p53 [16]. Identificámos placoglobina (PG, γ-catenina) como novo parceiro de interagir tanto de tipo selvagem (WT) e mutante p53 (mp53) [17,18].

placoglobina é um membro da família de tatu proteínas e um parálogo de β-catenina [19,20]. Ao contrário, β-catenina, o que só se associa com junções aderentes e possui funções oncogénicas bem conhecidas, PG é um /proteína supressora de tumor e a metástase participa na formação de ambas as junções aderentes e desmosomas [19,21]. PG pode conferir efeitos inibidores de crescimento /metástases através de suas interações com cadherins e indução de inibição por contato do crescimento [19]. Além disso, ele pode interagir com um número de parceiros, incluindo factores de transcrição intracelulares [17-19,22-27]. Mostrámos que PG interage com o p53 e a sua função de tumor /supressor de metástase pode, pelo menos parcialmente, ser mediada por esta interacção [17,18].

Uma série de estudos têm sugerido que a perda de cadherin- catenin complexa e ativação da função oncogénica β-catenina têm um papel central na invasão local das células tumorais de ovário e metástase subsequente [28-31]. Além disso, a perda de heterozigosidade do gene PG (JUP) tem sido relatada em OVCAs esporádicos [32]. No entanto, muito pouco se sabe sobre o papel da PG em OVCAs. Neste estudo, foram avaliados os potenciais funções tumor /metástase supressores de PG em OVCAs, utilizando a linha de células de ovário Iosé-364 e OVCA linhas de células normais OV-90 (PG and E-caderina positivo, mp53 expressar), ES-2 ( PG and e-caderina negativos, N-caderina positivos e mp53 expressar), ES-2-PG (ES-2 transfectantes expressando PG), ES-2-e-cad (ES-2 transfectantes expressando e-caderina) e ES- 2-SHN-cad (células ES-2 em que N-caderina foi derrubado). Foram examinados os níveis de PG, a localização e as interacções com E- e N-caderina e p53 e avaliou o crescimento, as propriedades migratórias e invasivos de várias linhas de células. Os resultados mostraram que ambas as PG interagiu com caderinas e p53. expressão exógena de E-caderina ou PG ou knockdown de N-caderina diminuiu significativamente a migração e a invasão de células ES-2. Além disso, a expressão PG e N-caderina knockdown mas a expressão não caderina-E reduziu significativamente o crescimento ES-2 células.

Materiais e Métodos

linhas de células e condições de cultura

Iosé -364 (daqui em diante Iosé) foram cultivadas numa mistura 1: 1 M199 e M105 MCDB meios mais 5% de FBS e 1% PSK (penicilina, estreptomicina, canamicina). OV90 células foram mantidas nas mesmas M199 e M105 MCDB media mais 15% de FBS e 1% PSK. células ES-2 foram cultivadas em meio 5a de McCoy completado com 10% de FBS e 1% PSK. ES-2-E-cad e células ES-2-PG foram cultivadas em ES-2 meios contendo 400 ug /ml (de seleção) ou 200 ug /ml (manutenção) G418. ES-2-shNcad formigas transfectar foram cultivadas em ES-2 media com 1 ug /ml (selecção) ou 0,5 ug /ml (manutenção) puromicina.

A transfecção

Os plasmídeos codificando E-caderina e PG têm sido descritas [33, 34]. As culturas de células ES-2, em 60 mm ou placas de 100 mm foram transfectadas a 50-75% de confluência com 10-25μg de DNA utilizando fosfato de cálcio. Vinte horas após a transfecção, as células foram enxaguadas com PBS e deixadas a recuperar durante 24 horas em meio de crescimento completo. Para selecionar transfectantes estáveis, 72 h após a transfecção, meios contendo 400 ug /ml G418 (ES-2- PG e ES-2- transfectantes E-CAD) foram adicionadas às células e colónias resistentes selecionados por 3-4 semanas. clones resistentes foram mantidas em 200 ug /ml de G418 e rastreados para PG e E-caderina expressão por imunofluorescência e immunoblotting.

N-caderina knockdown

Human N-caderina lentivírus shRNA plasmídeo [35 ] foi usado para transfectar células Phoenix-Ampho usando fosfato de cálcio. partículas lentivirais coletadas em 48 e 72 horas após a transfecção foram combinadas e filtradas usando um filtro de ligação 0,45 baixa proteína. partículas lentivirais foram usados ​​para transduzir células ES-2, na presença de 8 ug /ml polyberene (Santa Cruz, Canadá). linhas de células estáveis ​​puromicina resistentes que expressam a N-caderina shRNAs (ES-2-SHN-cad) foram isolados e os níveis de N-caderina avaliada por immunoblot e imunofluorescência.

Análise Immunoblot

Confluent 100 placas de cultura de mm foram lavadas com PBS frio e solubalized em tampão de amostra de SDS (10 mM Tris-HCl pH 6,8, 2% (w /v) de SDS, ditiotreitol 50 mM, 2 mM de EDTA, 0,5 mM de PMSF, 1 mM de NaF, 1 mM de na

3VO

4). Quantidades iguais de proteínas celulares totais foram separadas por SDS-PAGE e transferidos para membranas de nitrocelulose (BioRad, Canadá). As membranas foram incubadas em anticorpos primários específicos durante a noite a 4 °

C, seguido de anticorpos secundários apropriados à temperatura ambiente (Tabela 1). As membranas foram digitalizados usando um sistema de imageamento infravermelho Odyssey CLx.

Imunofluorescência

culturas de células confluentes foram estabelecidos em lamelas de vidro e enxaguados com PBS frio contendo 1 mM de cada um de NaF, Na

3VO

4 e CaCl

2. As células foram fixadas com formaldeído a 3,7% durante 20 minutos e extraiu-se com tampão de CSK (NaCl 50 mM, sacarose 300 mM, PIPES 10 mM pH 6,8, MgCl 3 mM de

2, 0,5% de Triton X-100, PMSF 1,2 mM, e 1 mg /ml de DNase e RNase; [17]) durante 10 minutos. As lamelas foram bloqueadas com soro de cabra a 4,0% e 50 mM de NH

4Cl

4 em PBS contendo 0,2% de BSA durante 1 hora. As lamelas foram então incubadas em anticorpos primários específicos durante 1 hora seguido de anticorpos secundários de 30 minutos, nas concentrações indicadas na Tabela 1. Os núcleos foram contrastadas com DAPI (1: 2000). As lamelas foram montadas em ELVANOL contendo 0,2% (w /v) parafenileno diamina (PPD) e visualizado usando uma lente objectiva 63x de um microscópio confocal Zeiss.

A imunoprecipitação

As culturas foram cultivadas até à confluência em 100 mm e lavadas com PBS frio contendo 1 mM de NaF, Na

3VO

4 e CaCl

2. As células foram extraídas em 1 ml de tampão de lise (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM de NaCl, 1% de NP-40, 0,5% de desoxicolato de sódio, 0.7μg /mL de pepstatina, 1 mM de Na

3VO

4, 1 NaF mM, e um cocktail inibidor de protease) durante 20 minutos num agitador rotativo a 4 ° C. As células foram raspadas e centrifugadas a 48000xg durante 10 minutos. Os sobrenadantes foram processadas para imunoprecipitação com anticorpos p53 e PG (Tabela 1) e 40 ul de proteína G agarose (Thermo Fisher Scientific, Canadá) grânulos durante a noite num agitador-rotação a 4 ° C. As amostras foram, em seguida, centrifugado a 14000xg durante 2 minutos, as esferas foram removidas e os sobrenadantes processado para um segundo immunoprecipation durante 3 horas. Grânulos de os dois imunoprecipitações foram combinadas e lavadas três vezes com o tampão de lise. Os complexos imunes foram solubilizados em 60 ul de tampão de amostra de SDS, separadas por SDS-PAGE e processadas para imunotransferência como descrito acima.

crescimento, migração e invasão ensaio

Para o ensaio de crescimento in vitro, 3×10

4 células de ES-2, ES-2-e-cad, ES-2-PG e ES-2-SHN-CAD células foram plaqueadas numa placa de 24 poços. A 1, 3, 5 e 7 dias após o plaqueamento, as culturas foram tripsinizadas e as células foram contadas. Cada ponto de tempo representa a média de três experiências independentes.

Para os ensaios de migração celular, 2 × 10

5 as células foram ressuspensas em 0,5 ml de meio isento de soro e plaqueadas na câmara superior de inserções Transwell (3 um poros, 6,5 milímetros de diâmetro; BD Biosciences, CA, EUA). meios normais contendo FBS a 10% foi adicionado para a câmara inferior e as culturas foram incubadas durante 16 horas a 37 ° C. Inserções foram então transferidas para novos pratos e lavadas com PBS para remover as células não-ligados. Inserções foram fixadas com 3,7% de formaldeído (em PBS) durante 2 minutos, permeabilizadas com metanol a 100% durante 20 minutos e coradas com corante de Giemsa durante 15 minutos à temperatura ambiente. Após coloração, as membranas foram visualizadas sob um microscópio invertido com uma lente objectiva de 20x e fotografado.

Para ensaios de invasão de Matrigel, as células foram privadas de meio isento de soro durante 24 horas antes do ensaio. Para cada linha celular, 5 × 10

4 células em 0,2 ml de meio livre de soro foram plaqueadas no compartimento de topo das câmaras de invasão de Matrigel (8-revestidas de poro da membrana PETE; BD Biosciences). meio condicionado de fibroblastos (0,8 ml) foi adicionado às câmaras inferiores e as placas foram incubadas durante a noite a 37 ° C. Após 16 horas, as membranas foram recuperadas e processadas como descrito para o ensaio de migração. membranas montadas foram vistos sob uma lente objetiva de 20x de um microscópio invertido e fotografada.

As células /invadidos migraram foram contadas em 5 campos aleatórios para cada membrana usando ImageJ programa celular Counter. Os números para cada linha celular foram normalizados para a média e os da linha de células normais ou células não transfectadas e parentais histogramas construído. Histogramas representam a média de pelo menos 3 ensaios independentes para cada linha de células.

A análise estatística

Os valores são apresentados como médias ± SD. As diferenças estatísticas entre grupos foram avaliadas pelo teste t de Student.

P

-valor. 0,05 foi considerado significativo

Resultados

A expressão de proteínas de marcadores epiteliais e mesenquimais e p53 em várias linhas celulares OVCA

Protein expressão de e-caderina, N-caderina, placoglobina, citoqueratinas, vimentina e p53 em Iosé, ES-2 e células de OV-90 foram detectados utilizando análise de imunotransferência (Figura 1). células Iosé teve muito pouco, se algum, da E-caderina e N-caderina expressa e PG. Estas células também expressa citoqueratinas, vimentina e p53. Estas observações foram consistentes com descobertas anteriores indicando que as células normais OSE exibido ambos os marcadores epiteliais e mesenquimais [36]. Em contraste, as células OV-90 que expressam mp53 [37] não tinha N-caderina detectável, baixos níveis de vimentina e níveis elevados de marcadores epiteliais, incluindo E-caderina, PG e citoqueratinas. células ES-2, que também expressam mp53 [38, 39], apresentado um fenótipo mesenquimal mais, carecido da E-caderina e PG e expressa N-caderina, vimentina e níveis muito baixos de citoqueratinas.

lisados ​​celulares totais de Iosé-364, ES-2 e OV-90 células foram processadas para análise immunoblot usando N-caderina, e-caderina, placoglobina, vimentina, citoqueratinas e anticorpos p53. Igualdade de cargas foram confirmados por processar os mesmos lisados ​​com anticorpos actina.

Levels e localização de E-caderina, N-caderina e placoglobina em linhas de células normais e de carcinoma de ovário

distribuição subcelular e potencial de co-localização de E- /N-caderina com PG foram examinadas por imunofluorescência dupla (Fig 2). Em células Iosé, consistente com os resultados de imunotransferência, os níveis de E-caderina não foram detectáveis ​​enquanto que N-caderina e PG foram expressos em níveis elevados e foram co-distribuídos na membrana (Figura 2, Iosé). Em células de OV-90, altos níveis de E-caderina e PG estavam presentes e foram co-localizada na membrana. Nós também detectou mal distribuída pequenas manchas de células positivas N-caderina no OV-90 culturas. Nessas manchas, N-caderina foi colocalized com PG (Fig 2, OV-90). Em células ES-2, não foi detectável E-caderina ou PG, enquanto que expressa níveis elevados de N-caderina, que foi distribuído por todo o citoplasma (Fig 2, ES-2). Consistentes com a ausência de PG e adesivas junções, as células ES-2 exibiram significativamente menos contato célula-célula e sua morfologia foi distintamente diferente do que as células Iosé e OV-90.

Iosé-364, ES-2 e OV-90 células foram cultivadas em lamelas e processados ​​para coloração dupla imunofluorescência. E-caderina (E-cad, vermelho) ou N-caderina (N-CAD, vermelho) e placoglobina (PG, verde) anticorpos foram utilizados nas concentrações indicadas na Tabela 1. Os núcleos foram coradas com DAPI (azul). Bar, 25 um.

A ausência de E-caderina e PG ea presença de N-caderina contribuir para as propriedades migratórias e invasivos de células ES-2

Anteriormente, mostramos que a expressão de PG em células de carcinoma PG-deficientes que carecem de e-caderina e N-caderina expressa diminui a sua

in vitro

crescimento, migração e invasão [33, 34]. Para examinar se PG teve efeitos semelhantes em células OVCA, examinamos primeiro as propriedades de migração e invasão de células Iosé, OV-90 e ES-2. Então, nós exogenamente expressa E-caderina ou PG ou derrubado N-caderina nestas células e avaliadas mudanças no seu crescimento, migração e invasão. Como representado na Fig 3A, OV-90 células mostraram significativamente menor migração e invasão em relação ao Iosé células (8,4% e 0,4%, respectivamente). Em contraste células ES-2 foram significativamente mais migratória e invasiva comparar com Iosé células (138% e 196,4%, respectivamente).

(A) Migração (esquerda) e invasão (direita) de Iosé-364, OV -90, ES-2 células. As culturas foram processadas para ensaios in vitro migração e invasão como descrito em Materiais e Métodos. O número de células que migraram /invadidas foi normalizada para aqueles das células Iosé-364. (B) A expressão de E-caderina, N-caderina e placoglobina em ES-2 transfectantes que expressam E-caderina (ES-2-E-cad) ou placoglobina (ES-2-PG) ou N-caderina shRNAs (ES-2 -shN-cad). transfectantes estáveis ​​foram processadas para immunoblotting usando E-caderina, placoglobina e anticorpos N-caderina. Para confirmar cargas iguais, os mesmos lisados ​​celulares foram tratados com anticorpos de actina. (C) distribuição subcelular e co-localização de E-caderina, N-caderina e placoglobina no ES-2- E-cad, ES-2-PG e transfectantes ES-2-SHN-cad. transfectantes estáveis ​​foram estabelecidas com lamelas e processados ​​por dupla imunofluorescência com anticorpos E-caderina (E-cad, vermelho) ou N-caderina (N-cad, vermelho) e placoglobina (PG, verde). Os núcleos foram coradas com DAPI (azul). Bar, 25 um.

expressão exógena de E-caderina e PG e knockdown estável de N-caderina no ES-2 transfectantes foi confirmada usando immunoblot (Fig 3B) e análises de imunofluorescência (Fig 3C). Em ES-2-E-cad células (Fig 3B e 3C, ES-2-Ecad), E-caderina foi expressa e localizado principalmente na membrana embora também foi detectada no citoplasma dos transfectantes. Curiosamente, a expressão de PG em ES-2-PG células (Fig 3B e 3C, ES2-PG) levaram à sobre-regulação de endógena E-caderina. Nestas células, a forma exógena expressa PG colocalized com ambos N-caderina e E-caderina (Fig 3B e 3C, ES2-PG). N-caderina knockdown reduziu os níveis da endógena N-caderina ( 90%). Coloração destas culturas com anticorpos N-caderina detectadas células ocasionais que quase não foram manchados (Fig 3B e 3C, ES2-SHN-CAD).

Avaliação da migração e invasão de ES-2 transfectantes mostraram uma redução significativa em ambos migração e invasão de Es-2-Ecad e células ES-2-PG relativos a parentais células ES-2 (figura 4A, 4B e 4D). A expressão da E-caderina nas células ES-2 migração e invasão destas células reduzido em 39% e 42%, respectivamente. PG expressão em células ES-2 diminuiu a migração e invasão por 58% e 44%, respectivamente. O efeito do knockdown N-caderina sobre a migração foi semelhante ao de expressão PG, ou seja, uma redução de 65% ao passo que a invasão de células ES-2-SHN-CAD foi significativamente menor do que a de ES-2-E-cad e ES -2-PG células (redução de 68%) (Figura 4A, 4B e 4D).

Iosé-364, OV-90, ES-2 e ES-2 transfectantes (ES-2-e-cad, ES-2-PG, ES-2-SHN-CAD) foram processados ​​para a migração de (a) e ensaios de invasão (B) tal como descrito em Materiais e Métodos. O número de células que migraram /invadidas foi normalizada para aqueles das células Iosé-364. (C) Replicar culturas do ES-2 células e ES-2 transfectantes (E-cad, PG e SHN-cad) foram semeadas a uma única célula (3×10

4) densidade. As culturas foram contadas no dia 1, 3, 5 e 7. Cada ponto de tempo é a média de três experiências independentes. (D) Resumo de alterações no crescimento, migração e invasão de ES-2 transfectantes. transfectantes valores foram normalizados para as células ES-2.

p

valores, * 0,05, ** 0,001.

Também comparamos o crescimento de células ES-2 com os de ES-2-E-cad, ES-2-PG e ES-2-SHN-cad transfectantes (Fig 4C e 4D). No dia 7, as células ES-2-E-cad mostraram a taxa de crescimento semelhantes às células ES-2 enquanto que as células ES-2-PG e ES-2-SHN-CAD mostrou crescimento significativamente menor do que as células ES-2 (21% e 25 % de redução, respectivamente, (Figura 4C e 4D). no entanto, enquanto que as células ES-2-SHN-CAD mostrou diminuição do crescimento ao longo dos 7 dias, as culturas ES-2-PG mostrou diminuição do número de células após o dia 5, provavelmente devido à indução de inibição de contacto sobre a confluência cultura (Figura 4C).

Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que a expressão de e-caderina ou PG ou knockdown de N-caderina com eficácia reduzida de migração e invasão de células ES-2. No entanto, única expressão PG ou N-caderina knockdown diminuiu significativamente o crescimento destas células.

Interacção de placoglobina e p53 em linhas celulares de carcinoma de ovário normal e

Demonstrámos que PG interagiu com ambos e WT mp53 em várias linhas celulares de carcinoma e ambos associados com promotores de uma série de genes alvo p53 [17, 18, 40] interacções. de PG com mp53 expressando células de carcinoma levaram a uma diminuição do crescimento, migração e invasão destas células. Para este fim, nós examinamos se a PG associado a p53 em células OVCA. extracto celular total de Iosé, ES-2 e células ES-PG-2 foram processados ​​para coimmunoprecipitation recíproco (co-IP) e imunotransf erência com anticorpos PG e p53 (Tabela 1). Em células Iosé anticorpos PG e PG co-precipitado de p53 (Figura 5). Os anticorpos utilizando p53 co-IP recíprocas coprecipitados PG, validando ainda mais a interacção entre o PG e p53 nestas células. Em células ES-2 expressando PG exógeno e endógeno mp53, anticorpos PG co-precipitados p53 e PG. No recíproca co-IP de células ES-2-PG, os anticorpos p53 derrubado tanto PG e p53 (Fig 5). Em contraste, em células ES-2 sem expressão PG, anticorpos p53 precipitaram a p53 única (Figura 5). imunoprecipita�es controle com p53 e anticorpos pré-imune PG não detectou qualquer proteína no total de lisados ​​celulares (Fig 5B).

quantidades iguais de extractos totais de células (TCE) a partir Iosé-364, ES-2 e ES-2 -pg células foram processadas para imunoprecipitação sequencial e recíproca (IP) e imunotransferência (IB), utilizando anticorpos de p53 e placoglobina (a) ou anticorpos pré-imune (B) como descrito em Materiais e Métodos. Os mesmos lisados ​​foram processados ​​com anticorpos de actina para confirmar cargas iguais. PG, placoglobina; Pi, pré-imune.

Discussão

No estudo atual, pela primeira vez, investigou-se a

in vitro

tumor /metástase efeitos supressores de PG em linhas celulares Edc com expressão mp53 e os diferentes perfis caderina. Demonstramos que as células ES-2 que expressam N-caderina e são deficientes em E-caderina e PG foram altamente migratório e invasiva. Em contraste, OV-90 As células que expressam tanto de E-caderina e PG e muito pouco N-caderina não foram migratório ou invasivo. A expressão exógena de PG ou E-caderina ou knockdown de N-caderina nas células ES-2 reduziu significativamente a sua migração e invasão. Os nossos dados mostraram que PG colocalized tanto com a E-caderina e N-caderina nos complexos de adesão. Consistente com estas observações, foi detectada redução significativa no ES-2-PG e ES-2-SHN-cad crescimento em relação ao ES-2 e ES-2-E-cad células. Além disso, a PG interagiu com p53 em células WT Iosé e mp53 em transfectantes ES-2-PG.

Caderina comutação de E- para N-caderina é um passo crítico no epitelial para mesenquimal (EMT) mediada doenças malignas [41, 42]. EMT leva à desmontagem junção célula-célula, perda da polaridade celular e ganho de propriedades migratórias e invasivos [30, 43, 44]. Enquanto E-caderina é um marcador de células epiteliais e um supressor de tumor conhecido, N-caderina é um marcador mesenquimais e a sua expressão está associada a um fenótipo mais migratório e invasiva [44, 45]. As células normais epiteliais da superfície do ovário (OSE) expressar uma combinação de marcadores epiteliais e mesenquimais. Estas células não têm E-caderina mas expressam N-caderina, cateninas, vimentina e citoqueratinas [36, 46-50]. De acordo com esses relatórios, as células Iosé expressa N-caderina e vimentina, bem como cateninas incluindo PG, e citoqueratinas. O papel exacto do interruptor /N-caderina E- na iniciação e progressão de carcinomas do ovário não é muito clara, uma vez ambas as caderinas pode ser expressa em tumores de ovário de diferentes origens e em fases diferentes [51, 52]. No entanto, enquanto alguns estudos sugerem que a E-caderina é regulada em derrames OVCA [52, 53], a grande maioria sugerem que a perda ou redução dos níveis de E-caderina contribuir para a transição de benigno a limítrofes lesões ovarianas, para pouco diferenciado tumores do ovário, e para a invasão local e metástase [28, 47, 54-58]. Coerentes com as actividades supressores de tumor de E-caderina, downregulation /falta de expressão da caderina-E, devido aos altos níveis de seus repressores de transcrição Snail, torcer e ZEB-2 tem sido associada com as propriedades migratórias e invasivos de ES-2 e outros células OVCA [59-71]. Além disso, E-caderina e suprime o crescimento de metástases através da inibição da tirosina quinase do receptor de sinalização e PI3K /Akt vias [72, 73]. De acordo com estes estudos, mostrou que as células ES-2-E-cad teve significativamente menor migração e invasão (39% e 42%, respectivamente) em comparação com células ES-2.

Apesar de N-caderina é expressa em OSE normal, a sua expressão é geralmente associada com o aumento da migração e invasão de OVCA [74-76]. níveis de N-caderina tem sido mostrado para ser elevados em linhas celulares que expressam Snail e ZEB-1, assim como, em pacientes com maior grau do tumor e metástases FIGO [51, 64, 77]. expressão exógena de MUC4 em células SKOV3 levou à regulação negativa da E-caderina, regulação positiva de N-caderina e aumento da motilidade. N-caderina knockdown nestas células reduzida motilidade induzida MUC4, concorrente com menor actividade de ERK1 /2, AKT e MMP9 [78]. Apoiando estes estudos, um anticorpo anti-N-caderina selectivo (Exherin, ADH-1) foi recentemente mostrado ser eficaz na estabilização da progressão da doença em dois pacientes OVCA em fase pequena que estudo clínico, que avaliou pacientes com diferentes tumores sólidos [79 ]. Aqui, mostramos que em relação ao ES-2 células, a migração e invasão de ES-2-SHN-cad transfectantes foram reduzidos em 65% e 68%, respectivamente. Além disso, derrubando N-caderina foi muito mais eficaz na redução da migração e invasão de expressar E-caderina em células ES-2. Da mesma forma, enquanto que a expressão de E-caderina teve um efeito muito pequeno (5%) na diminuição do crescimento, expressão PG ou knockdown N-caderina ES-2 reduziu significativamente o crescimento de células (20%, 25%, respectivamente).

Ao contrário cadherins, muito pouco se sabe sobre o papel de PG em OVCA. PG tem sido demonstrado que têm função inibidora do crescimento /metástase, ambos

in vitro

e

in vivo

[19]. Esta função de PG pode ser mediado através da estabilização /sequestrantes de N-caderina e a indução da inibição por contacto do crescimento e /ou interagindo com diferentes proteínas celulares, incluindo os factores de transcrição [17-19], 27,34,40,80-82. Aqui, a expressão exógena de PG reduziu significativamente a migração e a invasão de células ES-2 (58% e 44%, respectivamente). O efeito de PG na inibição da migração foi significativamente maior do que a de E-caderina. Uma vez que a expressão do PG é necessário para a formação de ambos adherens junções e desmosomas [19,33], isto pode sugerir que PG reduzida migração através de associação com N-caderina e formação de junções bem como a interacção com factores de transcrição e regulação da expressão génica. Interação de PG com vários fatores de transcrição como TCF /LEF, CBP, SOX4 e p53 tem sido relatado anteriormente [17, 22-26, 81]. Mostrámos que PG interagiu com mp53 em várias linhas celulares de carcinoma e ambos associados com promotores de uma série de genes alvo, incluindo supressores de tumores p53

SFN

(14-3-3s) e

NME1

eo organizador do genoma oncogênico

SATB1

. Além disso, estas associações foram concomitante com crescimento reduzido, migração e invasão [17,18]. PG também regulada a expressão de HAI-1 e da diminuição da migração de um modo dependente da p53 em células NSCLC [27]. Aqui, mostramos que PG interagiu com p53 em células WT Iosé e com mp53 em células ES-PG-2. p53 regula a expressão de marcadores de EMT como Twist, Caracol e Slug [82-86]. Detectamos níveis baixos de E-caderina nas células ES-2-PG sobre a expressão do PG. Se esta expressão de E-caderina é devido à regulação negativa da E-caderina repressores transcricionais através da interacção PG-p53 ou estabilização da proteína E-caderina através da sua interacção com o PG garante estudos posteriores.

Em resumo, esta é a primeira demonstração do papel de PG em células OVCA. Os nossos dados mostraram que a expressão exógena de PG ou knockdown de N-caderina foram mais eficazes do que a expressão de E-caderina em inibir o crescimento, as propriedades migratórias e invasivos de células ES-2. Estes resultados sugerem que a expressão PG seqüestrado tumor /metástase promoção de atividades de N-caderina. A indução da expressão de E-caderina nas células ES que expressam-2 exógena PG, que interagiram com o mp53 endógeno, aumenta a possibilidade de que PG também pode estar envolvido na regulação de genes alvo p53 envolvidos na migração e invasão. Colectivamente, os resultados sugerem que o PG pode actuar como um supressor de tumor /metástase em OVCA, como foi mostrado para outros cancros. A maior implicação dos nossos estudos é o potencial de PG como um alvo terapêutico para a maioria dos OVCAs com mp53 e N-caderina expressão.

Reconhecimentos

Agradecemos ao Canadian tecido ovariano Banco, a BC Cancer Agency para fornecer células Iosé-364. Nosso trabalho é apoiado pelo Canadian Breast Cancer Foundation Pradarias /TNM Capítulo (MP) e pela Bolsa do Câncer de Alberta Fundação de Pós-Graduação (MA). GD foi apoiado por uma bolsa de estudo de verão das Mulheres e Instituto de Pesquisa de Saúde Infantil (WCHRI).