Hur é conhecido para localizar a polissomos e nos grânulos de estresse após certos tipos de brinquedos e lesões celulares. Percebemos uma enorme mudança da proteína para as fracções mais pesadas polissomal seguinte remédio Doxo, indicando que a proteína está a participar activamente na reação celular ao fármaco, talvez, regulando o exercício tradução de mRNAs ligados. Nós utilizamos um ensaio de chip de RIP para estabelecer que mRNAs vincular a Hur após o tratamento Doxo, para investigar a resposta Hur para Doxo em termos de metas Hur.
Depois de imunoprecipitação e hibridação em matrizes Agilent, por meio de uma tolerância de enriquecimento vezes, nós filtrado aqueles variedade mRNA particularmente obrigado a Hur. Descobrimos mRNAs correspondentes a 822 genes HGNC anotados, que podem ser vinculados a Hur e proporcionalmente enriquecidos dentro do produto. Nós submetemos o registro gene ligado 721 Hur para avaliação dos motivos funcionais em todo o 3UTR, para julgar a estabilidade do nosso processo de enriquecimento de mRNA. Desde Hur é bem conhecida por se ligar a Ares, esperávamos para procurar uma sobre-representação sólida de opinião são obrigatórios em todos os 3UTRs destes genes.
O enriquecimento da ARE foi grande ea importância é preservado, mesmo se a remoção constante genes com o enriquecimento de vezes menor. Os primeiros 50 genes estão maximamente enriquecido em ARE. A partir desta lista nós escolhemos três genes para verificar a consequência da análise ampla do genoma, verificando a quantidade relacionadas sobre a solução imunoprecipitação via PCR semi-quantitativo de c-fos, c myc e SOCS3. Todos os mRNAs estabelecida a sua relação com Hur após Doxo governo, tal como mostrado na Figura 5B.
Estes dados sugerem um envolvimento de Hur no processo de activação de apoptose causada por Doxo no nosso sistema de modelo celular que não pode ser explicado pela formação do tipo truncada apoptogénica de Hur, e que, como uma alternativa Hur é ligado para mRNAs e relocalizes específicas sobre polissomos após a terapia Doxo. Desde Hur infra-regulação promove uma diminuição da resposta apoptótica induzida por Doxo e desde rottlerin antagoniza Doxo na indução de perda de viabilidade, que se perguntou se Hur poderia estar implicado no aparecimento de resistência Doxo.
Nós colocamos MCF 7 células sob Doxo coleção constantemente aumentando a concentração da droga de 0 a 100 nM em uma escala de tempo mês. Recebemos uma cidadania celular, chamado MCF 7 /doxoR, que mostrou aproximadamente 250 resistência vezes a Doxo, em comparação com o tipo selvagem MCF 7 células, como observado pelo aumento IC50 para cerca de 10 uM. A confirmação adicional do fenótipo de resistência adquirida originado na expressão sobre-em células MCF 7 /doxoR do transportador ABCG2, um sinal médio e a razão conhecida para pharmacoresistance Doxo, como a permissividade para a apoptose foi descoberto por caspase 7 frase. Og-L002
Foi observada uma forte sub-regulação de Hur, enquanto as células adaptado para a presença de Doxo. Repetimos o procedimento de Doxo coleção 3 x muitas vezes adquirindo a mesma óbvia Hur infra-regulação, porque estávamos com foco em populações, intrinsecamente colocado através de variabilidade. Mais ainda, nós colocamos sob seleção diferentes linhas celulares de cancro da mama dois com diferentes charachteristics de MCF 7 células: MDA MB 231, células ruins triplos e SK BR 3, células HER2 positivo.
Adquirimos uma população de MDAMB 231 células resistentes a Doxo mas não uma população de SK BR 3 de acordo com os valores calculados. Curiosamente, assistimos Hur downregulation na MDAMB 231 /doxoR mas não no SK BR 3 /NOdoxoR, sugerindo que as células de câncer de mama regular negativamente a expressão Hur somente se um genética profunda re-programar em direção pharmacoresistance está ocorrendo e não como resultado de a mera presença de Doxo.