Sumário

O sucesso clínico da imunoterapia adoptiva do cancro baseia-se na selecção de antigénios alvo que são altamente expressos nas células tumorais mas ausente em tecidos normais essenciais. Um grupo de genes que codificam as cancerosas /testis ou da linha germinal cancro antigénios têm sido propostos como alvos ideais para imunoterapia devido à sua elevada expressão em vários tipos de cancro e a sua expressão restrita em tecidos normais immunoprivileged. No presente trabalho, relatamos o isolamento e caracterização de receptores de células T humanas (TCRs) com especificidade para o sarcoma sinovial X ponto de interrupção 2 (SSX2), um antigénio do cancro /testículo expresso no melanoma, cancro da próstata, do linfoma, mieloma múltiplo e cancro do pâncreas, Entre outros tumores. Isolamos sete HLA-A2 restrita receptores de células T a partir de clones de células T naturais derivadas de nódulos linfáticos infiltrados com tumor de dois doentes com melanoma SSX2-seropositivos, e seleccionados quatro TCRs para clonagem em vectores retrovirais. linfócitos do sangue periférico (PBL) transduzidas com três dos quatro SSX2 TCRs mostrou SSX2

reactividade específica 41-49 (KASEKIFYV) peptídeo, o reconhecimento de células tumorais e tetrâmero vinculativo. Um destes, TCR-5, exibiu ligação tanto em células CD4 e CD8 foi de tetrâmero e seleccionado para estudos posteriores. proliferação de liberação de interferon-γ, a lise das células e linfócitos específica do antigénio e HLA-A * 0201-restrita foi observada após cultura de engenharia de TCR PBL humano com linhas de células tumorais relevantes. optimização codão foi encontrado para aumentar TCR 5-expressão em células T transduzidas, e esta construção foi seleccionada para o desenvolvimento de células produtoras de vector virais grau clínico. O padrão específico de tumores de expressão de SSX2, juntamente com a actividade potente e selectiva de TCR-5, faz com que este TCR um candidato atraente para a terapia de gene de TCR potencial para tratar vários histologias cancro

citação:. Abate-Daga D, Speiser DE, Chinnasamy N, Z Zheng, Xu H, Feldman SA, et ai. (2014) Desenvolvimento de um receptor de células T de segmentação de uma molécula HLA-A * 0201 Restrito Epitopo do cancro testicular-Antigen SSX2 adoptiva para imunoterapia do cancro. PLoS ONE 9 (3): e93321. doi: 10.1371 /journal.pone.0093321

editor: Nupur Gangopadhyay, da Universidade de Pittsburgh, Estados Unidos da América

Recebido: 13 de dezembro, 2013; Aceito: 04 de março de 2014; Publicação: 28 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este projecto foi apoiado em parte por uma contribuição da Fundação Milstein Família e pelo Programa de Pesquisa Intramural do Centro de Pesquisa do Câncer, National Cancer Institute, Bethesda MD. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

os avanços recentes nos campos da imunologia tumoral, genómica do cancro e tecnologias de transferência de genes têm permitido o desenvolvimento de terapias baseadas na transferência adoptiva de células T reactivas a tumores autólogos para o tratamento de malignidades humanas [1], [2 ]. As células T reactivas a tumores, podem ser naturais, como no caso de linfócitos infiltrados no tumor (TIL) purificadas a partir de lesões ressecados e estimulada

ex vivo

, ou produzida a partir de sangue periférico por meio de introdução de genes que codificam para os receptores imunes [3 ].

Enquanto a taxa alta (50-70%) de respostas clínicas objectivas conseguida por tratamento TIL em pacientes com melanoma avançado estágio estabelecido um sólido prova de conceito para o tratamento de cancros humanos com células T [4 ], [5], a sua aplicação generalizada é limitada pela dificuldade em cultura e expandindo estas células T para números clinicamente relevantes para cada paciente. Como uma abordagem alternativa, a especificidade do antigénio de células T de sangue periférico prontamente disponíveis pode ser redireccionado para antigénios expressos nas células tumorais através de modificação genética. A transferência adoptiva de células T autólogas modificadas para expressar receptores de células T (TCRs) ou receptores imunes quiméricos derivados de anticorpos pode resultar numa resposta imune celular potente contra tecidos que expressam os antigénios alvo, mesmo a baixos níveis de [3], [6] – [ ,,,0],8]. Por conseguinte, é instrumental para seleccionar cuidadosamente antigénios que são expressos em células de tumor mas ausente de tecidos normais essenciais, com vista a evitar indesejáveis ​​/toxicidades off-tumor sobre-alvo.

Os esforços actuais na identificação dos antigénios alvo óptimas para imunoterapia adoptiva são focalizados principalmente nos neoantigénios gerados por mutações somáticas presente em tumores, mas ausente em tecidos normais [9], [10], em antígenos expressos em tecidos normais dispensáveis, e a um grupo de genes que codificam para o cancro testicular ( CT) antígenos. Estes últimos são definidos pelo seu padrão de expressão que, em adultos, é geralmente restringida a não-MHC expressando células germinativas dos testículos, que, assim, não apresentam antigénios às células T, e células tumorais de origem diversa [11] – [13 ]. A transferência adoptiva de linfócitos de sangue periférico autólogos que expressam um determinado TCR de um antigénio de cancro dos testículos, NY-ESO-1, mediada regressões de tumor objectivas em doentes com melanoma avançado e com sarcoma de células sinovial, sem o NY-ESO-1 a toxicidade relacionada [14 ].

a fim de expandir o repertório de antigénios que podem ser orientadas por esta abordagem, por conseguinte, a expansão do número de doentes e os tipos de tumores que podem ser tratados, foi desenvolvido um vector que expressa TCR-destinada a um membro da sinovial sarcoma X família ponto de interrupção, SSX2. Os genes do sarcoma sinovial X ponto de interrupção (SSX) estão localizados no cromossoma X e que codificam uma família de dez proteínas nucleares altamente homólogas, SSX1-10. SSX2 foi originalmente identificado como parte de uma translocação genómico presente no sarcoma sinovial [15], [16] e, mais tarde verificou-se ser idêntico ao HOM-MEL-40, uma proteína imunogénica que se sabe induzir respostas de anticorpos espontânea em 10% dos pacientes com melanoma [17].

Geramos vetores retrovirais que codificam o alfa e beta-TCR cadeias visando a HLA-a * 0201-restrito epitopo SSX2

41-49, isolado a partir previamente descrito pacientes com melanoma exibindo ativa imunológico respostas para SSX2 [18]. Demonstramos ainda que as células T manipuladas com esses vectores reconhecem linhas de células derivadas a partir de múltiplas histologias cancerosas. Optimização da expressão e actividade do TCR através da modificação da sua sequência de nucleótidos permitiu-nos identificar o desenho óptimo para a expressão eficiente e reactividade específica para o antigénio potente contra SSX2. Produção de uma linha de células retroviral produtor vector de grau clínico foi prosseguida pela sua futura aplicação em ensaios clínicos de imunoterapia adoptiva.

Materiais e Métodos

As linhas celulares e PBLs humanos

HLA-a * 0201 + /SSX2 + linha de células de melanoma 624, e não-HLA-a * 0201 linhas de células 888 e 938 foram estabelecidas a partir de tumores de melanoma metastático cirurgicamente ressecados e mantido no ramo Cirurgia, National Cancer Institute, National Institutes of Health ( Bethesda, MD). O HLA-A * 0201 + /linha de células de glioma SSX2 + U251 foi obtida a partir da Divisão de Tratamento do Câncer and Repository Tumor Diagnóstico, National Cancer Institute, National Institutes of Health (Frederick, MD). linhas de melanoma SKmel23 e SKmel37, e linha celular de cancro da mama MCF7 foram adquiridos a partir de ATCC (Manassas, VA). COS7-A * 0201 e 293-A * 0201 foram retroviralmente células manipuladas para expressar HLA-A * 0201, como descrito anteriormente [19], [20]. células * 0201-SSX2 293-A COS7-A * 0201-SSX2 e foram transduzidas com um vector retroviral que expressa o ADNc de SSX2. T2 é uma função TAP linha celular linfoblastóide falta, cujas proteínas de HLA de classe I pode ser facilmente carregado com péptidos exógenos. Os clones de embalagem PG13 foram gerados utilizando a linha celular de empacotamento do vírus da leucemia do macaco gibão PG13 (ATCC CRL-10686), e a linha celular de empacotamento ecotrópico humano, Phoenix ECO (gentilmente cedida pelo Dr. Hans Peter-Kiem, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle , WA). Todas as células foram cultivadas em meio D10 consistindo de alto teor de glucose (4,5 g /l), meio essencial modificado de Dulbecco (DMEM, Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS, Hyclone, Logan, UT) e 6 glutamina mM (concentração final; Invitrogen, Carlsbad, CA). As células foram mantidas a 37 ° C e 5% de CO

2.

linfócitos do sangue periférico utilizados neste estudo foram obtidos a partir de pacientes com melanoma tratados no ramo Cirurgia, National Cancer Institute, National Institutes of Health, em protocolos NCI Institutional Review Board-aprovado. Pacientes forneceram consentimento por escrito para colheita de tecidos e utilização destes para fins de pesquisa, conforme detalhado no protocolo 03-C-0277. Linfócitos humanos foram mantidas em meio AIM-V (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado com 5% de soro humano AB (Vale biomédica, Winchester, VA), 50 U /mL de penicilina, 50 ug /mL de estreptomicina (Invitrogen), e 300 UI /ml de IL-2 e mantida a 37 ° C com 5% de CO2. clones de células T específicas SSX2 foram recém-gerado a partir de tumor infiltrado linfáticos células T derivadas do nó de pacientes Lau 567 e Lau 672, da mesma forma como descrito anteriormente [18].

peptídeos sintéticos

O SSX2

41-49 péptido (KASEKIFYV) correspondente aos aminoácidos 41-49 de SSX2, e péptidos homólogos derivados de SSX1 (KYSEKISYV), SSX3 (KVSEKIVYV), SSX4 (KSSEKIVYV), SSX5 (KASEKIIYV), SSX6 (KFSEKISCV), SSX7 (KSLEKISYV), SSX8 (KYSEKISYV), SSX9 (KSSEKIIYV), SSX10 (KASEKILYV), IGSF22 (KESAKIFYD), ARHGAP1 (KFGQKIFYV), GPR82 (SCYEKIFYG), PHF8 (LKGEKIFYL), LIPM (TGQEKIYYV), SYT14 (IVGEKIFYL), TCOF1 (KASEKILQV), RBL2 (SPREKIFYY) e FRAS1 (SPREKIYYV) foram sintetizados por GenScript (Piscataway, NJ). Os péptidos foram dissolvidos em DMSO e diluídos em meio RPMI 1640 para o carregamento das células T2. A afinidade de ligação a HLA-A2 * 0201 foi previsto para cada péptido utilizando NetMHC-3.0 [21]. Identificação de péptidos homólogos para SSX2

41-49 com um potencial de reactividade cruzada foi realizada por pesquisa BLAST (algoritmo BLASTP).

A construção de vectores retrovirais para a expressão específica de SSX2-HLA-A * 0201-restritos TCRs

vectores retrovirais baseados em MSGV1

foram construídas por PCR de sobreposição com a alfa- e beta-cadeias TCR dispostos na seguinte ordem:-cadeia alfa de TCR, ligante peptídico furina-SGSGP2A, TCR-cadeia beta , como previamente descrito [22]. As inserções de TCR clonados foram verificadas por profiling enzima de restrição e sequenciação directa de ADN. O ADNc que codifica para a versão com codões optimizados de TCR específicos de SSX2 e um TCR com codões optimizados, com regiões constantes de murino foram sintetizados por GenScript. A versão híbrida humano-ratinho de TCR-5 foi concebido como previamente descrito [23].

transdução de células T

sobrenadantes retrovirais foram geradas por transfecção de cada plasmídeo pMSGV1-SSX2-TCR, juntamente com um vector que codifica RD114 envelope em células 293-GP utilizando o reagente Lipofectamine 2000 (Invitrogen) em meio Opti-MEM (Invitrogen) [22]. Os sobrenadantes virais foram então carregados para RetroNectin-revestido (Takara Bio, Japão) placas de seis poços tratados com cultura de células não-tecido. Os PBLs foram estimulados com OKT3 (50 ng /mL) e rhIL-2 (300 UI /mL) 48 h antes da transdução, e a transdução foi realizada tal como descrito previamente [24].

coloração com tetrâmeros

HLA-a * 0201-restrito SSX2

41-49 (KASEKIFYV) foram produzidos pelos Institutos Nacionais de Saúde tetrâmero Núcleo Facilidade na Universidade Emory (Atlanta, GA) usando ficoeritrina (PE) como o fluorocromo. Para a avaliação da eficiência de transdução de TCR em subconjuntos de células T, as células T transduzidas foram marcadas com um CD8 marcado com FITC anti-humano (BD Pharmingen, San Jose, CA) e com marcado com PE HLA-A * 0201 tetrâmeros. As células foram analisadas usando um citómetro de fluxo FACScan com o software CellQuest (BD Biosciences) ou software FlowJo (ár, Ashland, OR).

ensaio de libertação de citoquinas

linfócitos TCR-transduzidas foram testadas para o antigénio reactividade espec�ico em ensaios de libertação de citoquinas utilizando células T2 carregadas com péptido ou células tumorais. Para esse fim, as células efectoras e células alvo foram co-cultivadas a uma razão de 1:01 (1 × 10

5 de cada) em 200 ul de meio AIM-V, em poços em duplicado de uma microplaca de 96 poços. Os sobrenadantes de cultura foram colhidas 18-24 h após o início da co-cultura e ensaiaram-se para o interferão-γ (IFNg) por ELISA (Thermo Scientific).

[

51Cr] ensaio de libertação de

A capacidade dos PBLs transduzidas para lisar as células HLA-a * 0201 + SSX2 + tumorais foi avaliada utilizando um padrão [

51Cr] ensaio de libertação como descrito anteriormente [25] PBLs Resumidamente, TCR-modificadas foram cultivadas com a diminuição da proporção do

As células alvo marcadas 51Cr-(razão E: T) em meio AIM-V, em placas de 96 poços em U, a 37 ° C durante 4 h. A lise foi medida por [

51Cr] libertação no meio de acordo com a fórmula: percentagem de lise = (libertação amostra – libertação mínima) /(libertação máxima – libertação mínima) x 100%. Resultados expressos como a média de amostras em duplicado.

A geração de um clone que codifica uma embalagem PG13 específica de TCR-SSX2

Um clone de células de empacotamento retroviral PG13 foi gerado tal como descrito anteriormente com as seguintes modificações [24] . células Phoenix ECO foram transfectadas com 9,5 ug de ADN de plasmídeo (pMSGV1-SSX2.567.5-CO) utilizando o reagente Lipofectamina 2000CD transfecção (Life Technologies, Carlsbad, CA). Após 48 h, o sobrenadante foi colhido e utilizado para transduzir linha de células de empacotamento retroviral, PG13. Não-tecido tratado de cultura de placas de 6 poços revestidas com 20 ug /mL de RetroNectin como descrito pelo fabricante. Retroviral sobrenadante contendo vector (4 mL) foi adicionado a cada poço seguido por centrifugação (2000 x g) a 32 ° C. Após 2 h, o sobrenadante foi removido e 5 × 10

5 PG13 células foram adicionados ao poço, centrifugado (1000 x g) durante 10 min a 32 ° C. Duas rondas de transdução foram realizados e, em seguida, os clones de embalagem PG13 foram gerados por clonagem de diluição limitante. Devido à falta de um marcador de selecção, os clones de título elevado foram identificados por dot blot de ARN, tal como descrito anteriormente [24], [26]. Vector retroviral a partir dos 6 clones mais elevados de titulação foi gerado como descrito. Resumidamente, 175 cm

2 frascos de cultura de tecidos (Nunc, Cole-Parmer, Vernon Hills, IL) foram semeadas a 4 x 10

4 células /cm

2, seguido de uma troca de meio (30 mL) no dia 3. O sobrenadante foi colhido 24 horas mais tarde, aliquotado e armazenado a -80 ° C até à sua utilização. O sobrenadante de cada clone foi avaliado quanto à capacidade para transduzir eficientemente PBL humanos e induzir IFNg em um ensaio de libertação de citocina. Um clone título alta serão selecionados para a produção de um banco de células principal e posterior GMP retroviral sobrenadante vetor.

Geração de GMP retroviral vector sobrenadante

Um total de 26 1,700 centímetros

2 expandida frascos rolantes de superfície foram semeadas no dia 0 a uma densidade celular de 4 x 10

4 células /cm

2 em 200 mL de meio D10. No dia 3, o meio foi mudado e substituído com 120 mL de meio D10. Meio contendo o vector retroviral foi colhido diariamente com garrafas a ser realimentadas com 120 ml de meio. Os níveis de glicose foram monitorados diariamente usando o sistema Accu-check da Roche (Roche, Basal, Suíça). Se os níveis de glucose caiu abaixo de 2 g /L, o volume da troca de meio foi duplicada para 240 mL /garrafa rolo para todas as colheitas subsequentes. Todas as colheitas foram divididos em alíquotas e armazenado a -80 ° C até à sua utilização. Uma alíquota de cada colheita foram testados quanto a eficiência de transdução e a libertação de citoquinas, tal como descrito anteriormente. Todos os produtos clínicos foram submetidos a um extenso programa de testes de biossegurança, de acordo com as diretrizes regulamentares atuais (US Food and Drug Administration, Centro de Avaliação e Pesquisa Biológica; Pontos de referência a considerar na produção e teste de novas drogas e produtos biológicos produzidos por tecnologia de DNA recombinante , 1985; Pontos a considerar na caracterização de linhas de células utilizadas para produzir Biologicals, 1993; Orientação para a Indústria: Orientação para somáticas humanas terapia celular e terapia gênica, 1998; Orientação para a Indústria, INDs – Abordagens da Conformidade com CGMP durante a Fase I, 2006).

resultados

Clonagem de TCRs SSX2 reativa humanos

As regiões codificantes de alfa e beta cadeias de TCR foram clonados a partir descrito anteriormente ocorre naturalmente SSX2-reativa As células T de dois doentes de melanoma [18]. Estas células CD8 HLA-A2-restrito reconhecem um epítopo que abrange os resíduos 41 a 49. O ADNc foi sintetizado por 5 ‘RACE utilizando iniciadores específicos para a região constante de genes de TCR e os produtos foram sequenciados, identificando sete pares diferentes de TRAV e genes (TRBV tabela 1). As cassetes de expressão contendo as cadeias alfa e beta-TCR separadas por o péptido ligante 2A [27], [28] foram gerados pela sobreposição de PCR e clonado no pMSGV1 para a geração de vectores de expressão retrovirais para os clones 5, 8, 9 e 11 ( Figura 1A).

a região de codificação de cada cadeia alfa de TCR foi amplificado por PCR utilizando iniciadores ladeada por um sítio de restrição Ncol no extremo 5 ‘e uma sequenciação pendendo contendo o elemento de na extremidade 3’. Em paralelo, cada cadeia beta de TCR foi amplificado por PCR utilizando um iniciador de sentido directo contendo um ‘saliência que se sobrepõe com a extremidade 3’ 5 saliência presente no iniciador utilizado para a amplificação da cadeia alfa. O iniciador inverso para a amplificação da cadeia beta continha um codão de terminação e um sítio de restrição

Eco RI

. Num segundo ciclo de PCR, os produtos de alfa- e beta-cadeia amplificações foram reunidas, e a ligação dos dois fragmentos de ADNc através das saliências de sobreposição foi obtida por PCR utilizando os iniciadores externos. Os produtos de PCR resultantes foram clonados no vector de pMSGV1 para a produção de retrovírus. LTR: repetição longa terminal, sd: dador de união, sa: aceitador de união, ψ:. Sinal de encapsidação retrovírus

A expressão de TCRs clonados em linfócitos humanos

retrovirais sobrenadantes vetor foram geradas por transfecção transitória de 293GP e utilizado para a transdução de células T humanas estimuladas com OKT3-. Expressão e correcta montagem de TCR foi avaliada por citometria de fluxo, utilizando marcados fluorescentemente a HLA-A2-SSX2

41-49 tetrâmeros. TCR5 foi eficientemente expresso em ambas as células T CD8 e CD4, e TCR9 TCR11 foram expressos apenas em células CD8, enquanto que a expressão de TCR8 não foi detectada por esta técnica (Figura 2 A).

A) Análise de expressão de superfície SSX2

TCRs específicos de 41-49 em CD8 e CD4 T populações de células por citometria de fluxo. As células mononucleares do sangue periférico humano foram estimuladas com OKT3 e transduzidas com os vectores de expressão retrovirais indicados. Uma semana mais tarde, as células foram coradas com anticorpos CD3, CD8 anti-humano e com um tetrâmero marcado por fluorescência contendo o SSX2

41-49 péptido. Os resultados de um dador representativo de pelo menos quatro experiências independentes. Eventos com delimitação de linfóide, e viáveis, uma única célula CD3 +. B) – D) Concentração de IFNg nos sobrenadantes de células T TCR-transduzidas cultivadas durante a noite com os objectivos indicados (1 × 10

5 efetores vs 1 × 10

5 alvos). Resultados apresentados como média de duplicatas de dois doadores representativos em cada quatro. UT:. Untranduced

Reatividade de PBL transduzidas com humanos anti SSX2-TCRs contra células tumorais SSX2 positivo

O correto processamento e apresentação do SSX2

41-49 epitopo , e reconhecimento por PBL TCR-engenharia foram testadas in vitro por cultura de PBL com derivados de células COS-7 e HEK293 que expressam HLA-a * 0201, com ou sem expressão concomitante do SSX2 antigénio (COS-A2, Cos-A2 SSX2 , 293-A2 e 293-A2 SSX2, respectivamente). Tal como mostrado na Figura 2B, as células T transduzidas com TCR-5, -9 e -11 segregados níveis elevados de IFNg (na ordem de 1 × 10

4 pg /ml) quando co-cultivadas com SSX2-transfectantes. TCR-8-transduzidas células T secretados apenas os níveis de IFNg de fundo, de acordo com a falta de tetrâmero de ligação mostrados na Figura 2A. A fim de verificar a HLA-A * 0201 restrição destes TCR, um * 0201-negativo linha SSX2-positiva para HLA-A de células de melanoma (938) ou o seu derivado modificado para expressar HLA-A * 0201 (938-A2) foram usadas como alvos para experimentos co-cultura. Como mostrado na figura 2C, os linfócitos que expressam TCR-5, -9 e -11 secretada IFNg apenas quando cultivadas na presença de células 938-A2. Reconhecimento de SSX2 endógena 938-A2 foi mais forte em linfócitos TCR-5-transduzidas, como evidenciado por um duas vezes maior secreção de IFNg por estas células em comparação com a de células T transduzidas com TCR-9 e -11 (Figura 2C).

para testar a capacidade destes TCRs que reconhecem o SSX2 endógeno expresso por células tumorais, que cultivados PBLs (transduzidas com TCR-5, -8, -9, -11) com linhas celulares derivadas de melanoma (888, SKMEL-23, 624), glioma (U251), e cancro da mama (MCF-7). Como se mostra na Figura 2D, TCR-5, -9 e -11 libertação mediada por linfócitos IFNg transduzidas quando cultivadas na presença de HLA-A de células tumorais SSX2-positivo * 0201-positivos a partir de glioma e melanoma. De nota, TCR-5 mediada o mais forte reconhecimento do alvo entre os diferentes teste TCRs. Com base nisto, e sobre a sua expressão eficiente em ambas as células T CD4 e CD8, que seleccionado de TCR-5 para posterior caracterização.

A reactividade cruzada com outros membros da família SSX e proteínas não-SSX

a família SSX 10 compreende genes que codificam proteínas que são altamente homólogos entre si. Em particular, o epitopo de SSX2 alvo de TCR-5 está dentro de uma das regiões de homologia entre os membros da família. Como mostrado na Figura 3A, a sequência de aminoácidos de SSX5 e SSX10 diferem de SSX2

41-49 em apenas um resíduo; SSX1, SSX3, SSX4, SSX8 e SSX9 diferem de SSX2

41-49 em dois aminoácidos; e SSX6 e SSX7 diferir

41-49 em três aminoácidos SSX2. Além de SSX2, SSX3 e SSX5 foram previstos para ligar moléculas HLA-A2 com uma afinidade elevada. Os péptidos derivados de SSX4, SSX7, SSX9 e SSX10 foram previstos para se ligarem a HLA-A2 com uma afinidade mais baixa. Reatividade de TCR-5 contra cada um destes péptidos foi testado em experiências de co-cultura utilizando linfócitos humanos que expressam TCR-5 como efectores e células T2 pulsadas com péptido como alvo, e a secreção de IFNg foi avaliada como um marcador de reconhecimento do antigénio. Enquanto TCR-5-expressando células secretada IFNg após exposição a SSX2

41-49, a baixa concentração de péptido ( 0,01 ng /ml), que reagiram a SSX3-, SSX4-, SSX5-, SSX9- e SSX10- única péptidos derivados quando expostos a concentrações elevadas de péptido (mais de 10 ng de péptido /ml, a figura 3 a). Esta diferença na reactividade de três a quatro ordens de magnitude indica que TCR-5 é relativamente específico para SSX2

41-49, e sugere que o reconhecimento de células que expressam peptídeos homólogos derivados de outros genes SSX pode ser improvável.

células T de sangue periférico expressam TCR-5 foram co-cultivadas durante a noite com células T2 pulsadas anteriormente com as diluições em série dos péptidos indicados. Os resultados da concentração de IFNg nos sobrenadantes de cultura são expressos como média de duplicados numa experiência representativa. Alinhamento de sequências dos péptidos testados é mostrada na legenda da figura para A) os genes SSX-família e B) genes não-SSX com sequências que se sobrepõem. IGSF22: membro da superfamília de imunoglobulina 22, ARHGAP1: Rho GTPase-activating protein 1, GPR82: Provável acoplados à proteína G receptor 82, PHF8: histona lisina demethylase PHF8, LIPM: lipase membro M, SYT14: sinaptotagmina-14, TCOF1: proteína melado, RBL2: retinoblastoma-like proteína 2, FRAS1: FRAS1 proteínas da matriz extracelular. Previsão da afinidade de ligação a HLA-A2 * 0201 é mostrado para cada peptídeo, expressa constante de dissociação (K

D, nM).

Nove genes codificantes de proteínas adicionais foram identificados por pesquisa blast como parcialmente homóloga à SSX2

41-49 epitopo: IGSF22, ARHGAP1, GPR82, PHF8, LIPM, SYT14, TCOF1, RBL2 e FRAS1. Os péptidos que se sobrepõem em duas destas proteínas, e IGSF22 TCOF1, diferiam em apenas dois resíduos da SSX2 epitopo alvo. Além disso, os péptidos derivados de SYT14 e TCOF1 foram previstos para ser ligantes de HLA-A2 positivos e negativos, respectivamente (Figura 3B). Analisou-se o reconhecimento destes péptidos nonâmero por TCR-5 em experiências de co-cultura utilizando células T2 pulsadas com péptido. Como representado na Figura 3B, a libertação induzida por IFNg SSX2

41-49 péptido foi de duas a quatro ordens de grandeza superiores à induzida pelos péptidos homólogos, confirmando a especificidade de TCR-5.

Codon optimization e murinization de TCR-5

próxima avaliado se a optimização da utilização do codão na sequência de codificação de TCR-5 e /ou o uso de ratinho-humano TCRs híbridos poderiam melhorar TCR-5 expressão e /ou actividade biológica . um ADNc que codifica para a mesma sequência de aminoácidos como TCR-5, mas com uma sequência de nucleótidos optimizado para a utilização de codões em humanos foi sintetizado e clonado em pMSGV1 para a geração de vectores retrovirais. Da mesma forma, uma versão com codões optimizados de TCR-5, em que as regiões constantes de TCR foram substituídos com a região constante de um TCR de rato [23] foi sintetizado e clonado em pMSGV1. As três versões do TCR-5 (WT, cod�s optimizados e códon otimizado rato + região constante, figura 4A) foram próxima comparados em sua expressão e capacidade de reconhecer antígenos e mediar a lise celular.

A) Representação esquemática das três construções gerados para a expressão de TCR-5 e seus derivados. LTR: repetição longa terminal, sd: dador, sa: splice aceitador, ψ: sinal de encapsidação retrovírus, MC: Rato TCR região constante, 2A: péptido de ligação. B) Análise de expressão de TCR-5 variantes por coloração tetrâmero. OKT3 linfócitos estimulados duas vezes foram transduzidas com o vector que expressa TCR correspondente e coradas com anti-CD3, anti-CD8 e SSX2

41-49 tetrâmeros de uma semana após a transdução. Os resultados representativos de três experiências independentes. Os valores entre parêntesis representam a intensidade média de fluorescência de coloração de tetrâmero dentro da população de células T CD8. C)

ensaio de libertação de 51Cr-para a avaliação da citólise específica de antigénio induzida por linfócitos TCR-5 transduzidas após quatro horas de co-cultura com as células-alvo indicadas. Percentagem de lise representada para cada linha de células-alvo em diferentes efector: alvo proporções é a média de duplicados de uma experiência representativa de três experiências independentes. UT: as células T não transduzidas usados ​​como controle negativo de lise não específica, WT: wild-type TCR, Co Op: otimizados para copon TCR, MCR:. TCR com o mouse região constante com codões optimizados

Depois retroviral transdução de linfócitos humanos estimulados com OKT3-, coloração tetrâmero foi usada para avaliar a expressão dos três construções. Como se mostra na Figura 4 B, a optimização de codões aumentou a densidade de expressão membranar de TCR em células T CD8 como evidenciado por um aumento da intensidade de fluorescência média (IFM) de SSX2

41-49 tetrâmero coloração em células transduzidas com o codão otimizado TCR-5 (910 unidades de fluorescência), em comparação com aqueles transduzidas com a versão de tipo selvagem (656 unidades de fluorescência). No entanto, a utilização de uma região constante de murino para além da optimização do codão apenas minimamente aumentado a ligação pelo TCR (949 unidades de fluorescência) tetrâmero. A actividade biológica do TCR foi testada em experiências de co-cultura em que os linfócitos de TCR-transduzidas foram expostos a células alvo * 0201-positivos múltiplos HLA-A que eram positivos para SSX2 (COS-A2-SSX2, 293-A2-SSX2, K562- A2, 624, 938-A2 e U251). A concentração de IFNg nos sobrenadantes foi medido por ELISA após a co-cultura durante a noite e os resultados são mostrados na Tabela 2. Os linfócitos transduzidas com a versão com codões optimizados de TCR-5 secretada, em média, 30% mais do que os IFNg transduzidas com o do tipo selvagem TCR. A presença de uma região constante de TCR ratinho também aumentou a secreção de IFNg em comparação com o tipo selvagem de TCR, mas esta modificação não fez aumentar a secreção da variante de IFNg com codões optimizados (tabela 2). Os três construções apresentaram propriedades semelhantes em termos de indução da proliferação específica de antigénio de células T em ensaios de incorporação de timidina (figura S1A), activação de células T após o reconhecimento do antigénio (evidenciado por sobre-regulação do marcador de activação de CD137, Figura S1B) e interleucina -2 (IL-2) produção (Figura S1C).

a indução da lise de células de células de tumor que expressam SSX2

a capacidade de cada variante de TCR-5 para induzir antígeno lise celular específica de alvos tumorais por linfócitos humanos foi determinada utilizando um ensaio de libertação de crómio. O crómio (

51Cr) marcado com 938, 938-A2, Cos-A2, Cos-A2-SSX2, 624, 888 e SKmel37 células foram co-cultivadas com células T de sangue periférico humano transduzido do tipo-selvagem de TCR-5 ou o seu codão -optimized ou optimizada por codão de variantes murinized, em diferentes efector: alvo rácios. As células T não transduzidas foram utilizados como controle negativo. Como representado na figura 4 ° C, os linfócitos transduzidas com qualquer uma das TCRs

41-49-SSX2 específicas induzidas potente efeito citolítico sobre as células 938-A2, mas não em 938 células, indicando que a lise é HLA-A * 0201-restrito. Além disso, as células COS-A2-SSX2 foram lisadas por TCR-5-expressando células, mas não Cos-A2, que não têm expressão de SSX2, indicando que este efeito é específico para o antigénio. Da mesma forma, 624 e SKmel37 células, que são HLA-A * 0201 positivo e SSX2 expressam naturalmente, foram lisadas por linfócitos transduzidas com ambos os TCR-5 variante, ao passo que as células * HLA-A 0201 888-negativos não foram. Em conjunto, estes resultados confirmam que as construções de TCR-5-derivados são biologicamente funcional em células T de sangue periférico humano, e que pode ser utilizado para redireccionar a sua especificidade para o antigénio para SSX2, em uma molécula HLA-A * 0201-forma específica. Nem a optimização de codões ou murinization de TCRs tinha um efeito sobre a lise de TCR-5-mediada.

Desenvolvimento e ensaio de sobrenadantes de vector retroviral grau clínico

Devido ao padrão de tumor-selectiva da expressão de SSX2 , e as propriedades de reconhecimento de antigénio-potentes ainda selectivos de TCR-5, decidimos produzir e testar vectores retrovirais de grau clínico adequadas para a expressão de TCR-5 em células T de sangue periférico de pacientes com cancro. linhas de embalagem estáveis ​​foram estabelecidos por transdução de células PG13 com um vector retroviral que codifica para a versão com codões optimizados de TCR-5. Após duas transduções, PG13 células foram clonadas por diluição limitante e os clones foram testados quanto à expressão do RNA viral utilizando dot-trama (não mostrado). Os seis clones que expressam os níveis mais elevados de ARN vetor (A8, A10, C3, D8, F2 e H2) foram amplificados e os sobrenadantes foram testados quanto à sua capacidade para induzir a expressão de TCR OKT3 em PBL estimulados a partir de três dadores diferentes. tetrâmero de coloração de células T transduzidas revelou que os sobrenadantes dos seis clones de transdução mediada eficaz de linfócitos (Figura 5 A).